Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手_生物吧
Real-Time PCR操作手册 0904
7 合成引物： 送往 Sangon 合成引物，大约需三个工作日。
8 引物稀释： 原液 100 μM 工作液 5 μM mixture Forwad primer Reverse primer ddH2O
5 μl 5 μl 90 μl
三） 推荐反应体系
试剂 2 × SYBR Green PCR Master mix cDNA (1-100 ng RNA 反转录所得 cDNA) H2O 5 μM Primer mix 终体积
此时可以设计 Real-time PCR 反应程序，点击兰色行的加号添加反应循环步骤，点击白色行加号添加每 一个循环内的步骤。 上图为 real-time PCR 的默认程序， ① 将第二个循环中第一步 95℃的时间调整为 15 秒，第二步改为 60℃（这些条件都需要根据所用的试 剂不同做出相应的调整）， ② 另外我们需要添加熔解曲线步骤，点击红圈标出的加号，添加第三个循环，并把 dwell time 改为 1， setpoint 列改为 95℃， ③ 再点击加号添加第四个循环，并把 dwell time 改为 1，setpoint 列改为 55℃，
5 选择引物序列： 打开 Map 标签页，查看找到的引物序列，此时引物有红蓝两色显示，在 optimal primer pairs only 前
打勾，则只显示红色并基本上按得分高低排列引物，此时尽可能选择靠近 3’端的引物；再打开 Result 标签页，复制 Forwad primer 和 Reverse primer 序列到 Word 文档中，比对引物查看其是否跨越至少 1 个 外显子，再打开 Primer 标签页查看选中的序列的罚分值，若引物正好跨越外显子，且得分比较低（红 色基本可用）则可用。
Real-Time PCR 操作手册
Real-timeqPCR数据分析方法
Real-timeqPCR数据分析方法
基线（baseline)：通常是3－15个循环的荧光信号，同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线。
阈值（threshold)：自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。
同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。
Ct值：与起始浓度的对数成线性关系
分析定量时候一般取Ct:15-35.太大或者太小都会导致定量的不准确。
相对定量：通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因之间的表达差异,一般是
2-△△Ct。
或者是考虑扩增效率的Pfaffl法。
qPCR操作步骤
QPCR（Real-time Quantitative PCR Detecting System）即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。
标准的两步法：RNA提取→随机引物反转录→反转录产物10倍稀释→real-time PCR.注意：1 高质量的RNA获取，这里的高质量不是强调RNA降解，而是强调RNA 的纯度，不能含有基因组DNA,以及其他杂质污染。
基因组DNA的存在会导致定量偏高，给你错误的结果，所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase处理，消除DNA污染。
而RNA中的杂质的污染会限制real-time PCR的反应，导致扩增失败，给你假阴性的结果。
RNA的降解不是关键，一个是因为定量PCR的引物扩增目的长度本身很短，150-250个bp，并不用于扩增目标基因的全长。
此外是因为存在内参基因，所以RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。
毕竟一旦发生降解，所有的RNA以同样的速度降解，而相对比率不会改变。
2 减少加样误差，在使用SYBR Green MIX的时候，一定要先按照反应的量（比如8个孔）把所有的试剂一次性配成MIX然后分装，留出5微升的反应体系给模板，使用5微升是因为只有5微升以上，加样枪的误差才会比较小，如果你仅仅是吸取一微升的话，手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差，严重影响你的定量精确度。
3 选择合适的内参基因，一般用于定量PCR的内参基因有好几种，但却没有完全通用的内参基因。
具体到不同来源的细胞，比如不同组织来源，或者是动物等等，内参基因会有差异，最好的办法是，在你的样品上先测试内参基因，找到变化最小，最稳定的一个。
4 合适的引物设计，避免出现引物二聚体，非特异性扩增等。
Q-PCR实验流程：一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
Agilent Real-time qPCR 检测 操作手册说明书
Real-time qPCR 检测操作手册1/ 6一、实验概述Real-time Quantitative PCR Detecting System ，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR 。
是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR 从定性到定量的飞跃。
二、实验流程三、实验材料： 1.主要试剂试剂名称 试剂来源 Cat.No. Trizol 上海普飞 3101-100 M-MLV promega M1705 dNTPs promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Bulge-LoopTM miRNA广州锐博 详见实验报告 qPCR Primer Set Rnase Inhibitor promega N2115 Primer(R&F) 上海生工 详见实验报告 SYBR Master MixtureTAKARADRR041B2/ 6样本收集Trizol 法抽取RNARNA 反转录获取cDNAReal-time qPCR2.主要器材器材名称来源Cat.NoNanodrop 分光光度计Thermo 2000/2000C稳压电泳仪上海天能EPS-600超细匀浆机FLUKO公司F6/10Real time PCR 仪器Agilent公司MX3000p反转录耗材Axygen四、实验步骤：1.总RNA 抽提（1）收取样品，Trizol 裂解。
细胞样品：收集细胞（6 孔板 80%细胞密度），2000 rpm 离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置 5 min，然后转移至新的 1.5 mL EP 管中；组织样品：将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃冰箱中取出，无菌刀片于干冰上将组织样品切割成约 3 mm×3 mm×3 mm 大小，置于装有 1 mL Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管中。
Real-Time PCR详细介绍
荧光定量PCR实验指南来源：易生物实验浏览次数：901网友评论0 条荧光定量PCR实验指南关键词：荧光实验指南第一部分一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从/网点的genbank中下载所需要的序列。
下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。
保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。
另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“openentrezsequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后要对所有的序列进行排序。
用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“adda ll”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。
横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。
有时要设定比较序列的开始与结尾。
有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。
再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。
realtime pcr操作流程
realtime pcr操作流程英文回答：Real-time PCR, also known as quantitative PCR (qPCR), is a widely used technique in molecular biology to detect and quantify DNA or RNA molecules. It is a sensitive and accurate method that allows researchers to measure gene expression levels, identify genetic variations, and detect pathogens.The general workflow of a real-time PCR experiment involves several steps:1. Sample preparation: This step involves extracting DNA or RNA from the sample of interest. Various methods can be used for sample preparation, such as phenol-chloroform extraction, column-based purification kits, or automated extraction systems. The quality and purity of the extracted nucleic acids are crucial for the success of the PCR reaction.2. Primer design: Primers are short DNA sequences that specifically bind to the target DNA or RNA region of interest. They are designed using bioinformatics tools and should have high specificity and minimal secondary structures. The forward and reverse primers are designed to flank the target sequence, and ideally, they should have similar melting temperatures.3. Reaction setup: The PCR reaction mixture is prepared by combining the extracted nucleic acids, primers, a DNA polymerase enzyme, and a fluorescent dye or probe. The reaction mixture is typically prepared in a PCR tube or plate. It is important to maintain proper aseptic techniques to prevent contamination.4. Thermal cycling: The PCR reaction goes through a series of temperature cycles in a thermal cycler machine. These cycles typically include denaturation, annealing, and extension steps. The denaturation step separates the DNA double strands, the annealing step allows the primers to bind to the target sequence, and the extension stepsynthesizes new DNA strands using the primers as templates. The number of cycles depends on the initial amount oftarget nucleic acid and the desired level of amplification.5. Data collection and analysis: Real-time PCR instruments monitor the fluorescence emitted by the fluorescent dye or probe during each cycle. The fluorescence signal increases proportionally to the amount of amplified DNA or RNA. The data can be plotted in a graph called the amplification curve, which shows the exponential growth of the target sequence. The threshold cycle (Ct) value, which represents the cycle number at which the fluorescence signal crosses a predetermined threshold, is used to quantify the initial amount of target nucleic acid.Real-time PCR is a versatile technique that can be adapted to various applications, including gene expression analysis, pathogen detection, and genetic testing. Itoffers high sensitivity, specificity, and quantification accuracy, making it an essential tool in molecular biology research and diagnostic laboratories.中文回答：实时荧光定量PCR（real-time PCR），也被称为定量PCR （qPCR），是分子生物学中广泛使用的一种技术，用于检测和定量DNA或RNA分子。
qPCR操作步骤教案资料
q P C R操作步骤QPCR（Real-time Quantitative PCR Detecting System）即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。
标准的两步法：RNA提取→随机引物反转录→反转录产物10倍稀释→real-time PCR.注意：1 高质量的RNA获取，这里的高质量不是强调RNA降解，而是强调RNA的纯度，不能含有基因组DNA,以及其他杂质污染。
基因组DNA的存在会导致定量偏高，给你错误的结果，所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase 处理，消除DNA污染。
而RNA中的杂质的污染会限制real-time PCR的反应，导致扩增失败，给你假阴性的结果。
RNA的降解不是关键，一个是因为定量PCR 的引物扩增目的长度本身很短，150-250个bp，并不用于扩增目标基因的全长。
此外是因为存在内参基因，所以RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。
毕竟一旦发生降解，所有的RNA以同样的速度降解，而相对比率不会改变。
2 减少加样误差，在使用SYBR Green MIX的时候，一定要先按照反应的量（比如8个孔）把所有的试剂一次性配成MIX然后分装，留出5微升的反应体系给模板，使用5微升是因为只有5微升以上，加样枪的误差才会比较小，如果你仅仅是吸取一微升的话，手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差，严重影响你的定量精确度。
3 选择合适的内参基因，一般用于定量PCR的内参基因有好几种，但却没有完全通用的内参基因。
具体到不同来源的细胞，比如不同组织来源，或者是动物等等，内参基因会有差异，最好的办法是，在你的样品上先测试内参基因，找到变化最小，最稳定的一个。
4 合适的引物设计，避免出现引物二聚体，非特异性扩增等。
Q-PCR实验流程：一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
real time-QPCR实验指导
实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR，简称RT-QPCR, 属于Q-PCR的一种，目前该技术已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等。
荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR GreenⅠ的非特异性方法和Taqman 水解探针的特异性方法。
本视频使用LightCycler® 480 SYBR Green I Master试剂盒介绍SYBR Green I 的非特异性方法。
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料，可与所有的各种序列的双链DNA 分子结合。
在游离状态下，SYBR Green I 发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，嵌入至dsDNA，荧光大大增强。
因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关，PCR 扩增不同时期中，dsDNA 含量不同，SYBR Green I 荧光信号强度不同。
可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量，并可根据对照进行相关的计算和分析。
实验前准备实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材。
试剂包括：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA。
使用的试剂盒有：用于合成cDNA第一链的罗氏试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，包含了cDNA反应所需要的所有实验组分以及相关的正对照反应组分。
配套LightCycler® 480使用的试剂盒LightCycler® 480 SYBR Green I Master，包含了PCR所需的各种实验组分，如1号管中包含热启动Taq DNA Polymerase 及反应缓冲液，dNTP mix，SYBR Green I染料和MgCl2正式试验开始前，冰上解冻各个试剂及试剂盒组分，置于冰上待用。
注意：SYBR Green I Master需避光放置。
Real time PCR操作步骤：从采样到数据处理
Real time PCR操作步骤：从采样到数据处理1.采样：1.1采样前的准备：DEPC水，灭菌手术刀剪，75% 酒精，2 mL无RNA酶离心管，2个盛有DEPC水的烧杯，一个用于冲洗样品，一个用于放置手术刀剪，以减少外界污染。
1.2采样过程中的注意事项：采样人员需带好口罩和手套，并且尽量少讲话。
当鸡放血致死后，立即解剖，并优先取RNA试验用样品。
取样量约100 mg左右（根据RNA提取方法不同可改变取样量），尽量保证每管取样大小和部位接近一致（可事先取些样品，有个大概的标准即可）。
RNA样品采集于离心管中，立即投入液氮（或者RNA保存液中）冻存，最后统一转入-70 ℃冰箱。
根据实验条件选择RNA样品的保存方式，优先选择液氮保存。
建议:如果直接投入液氮保存，离心管盖子要盖严，以免液氮渗入管中，导致离心管在转入-70 ℃冰箱时管盖崩开使样品损失。
2.总RNA提取提取组织和细胞总RNA推荐使用Trizol法。
2.1 Trizol提取总RNA的操作步骤以下操作需在超净台中进行，超净台使用前需用75% 酒精擦拭台面，紫外灯照射半小时后，打开风机排除臭氧，减少对实验人员的伤害。
此外，要提前制冰备用。
1)每50-100 mg样品加1 ml Trizol，使用高通量研磨仪研磨30 s。
2)研磨后样品放置5 min，4 ℃12 000 g离心10 min，上清液转移到另一个1.5 ml无RNA酶离心管中（已冰上预冷）。
3)加入200 µL氯仿，用力摇晃15 s，室温放置5 min。
4) 4 ℃ 12 000 g离心15 min，上清液转移至另一个1.5 ml无RNA酶离心管中（已冰上预冷）。
5)加入500 µL异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10 min，沉淀RNA。
6) 4 ℃ 12 000g离心10 min，弃上清。
7)加入1 ml 75% 乙醇（DEPC水配制），用移液器反复吸打乙醇，洗涤RNA沉淀。
Real-time PCR完全手册(有重点)
实时定量PCR完全手册方法简介所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
RT-qPCR是由三个步骤组成:1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;2.扩增:用PCR的方法扩增cDNA;3.检测:实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint):1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。
对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。
存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞3.总RNA或者mRNA4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略5.不同的酶以及酶的不同组合6.变异系数、灵敏度7.多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。
8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。
RNA 质量评价现在RNA 定量的程序很多。
最近EMBO qPCR course(http://www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28) 比较了用Ribogreen, Agilent BioAnalyser, spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品。
Real-time-qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手-生物吧
Real-time-qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手-生物吧Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手时间:2012-03-05 21:22来源:生物吧作者:刘浩点击: 13338 次由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。
由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。
由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。
本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real-time qPCR发展史Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
由于常规的PCR 的缺点，real-time qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。
现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。
在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。
1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了 Taqman技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。
Real-time_PCR(从原理到实验方法及数据分析)
•
绝对定量：从荧光到拷贝数
The well contains 400 target copies
Y= mx+b
Ct values
0
Ct‘s
1
2
3
4
5
6
7
Log copy number
相对定量：参照因子 Calibrator
用以比较结果的基准
time t =0 t=12 t=24 t=48
total RNA total RNA
t=0 t=1h
2.0 1 0.1
t=6h t = 24 h
相对定量研究软件
• • • 同时分析多达10块反应板的基因表达数据 – 多至960个数据点的单击分析 – 数据直观 通过ΔΔCT (比较 Ct)法完全自动分析数据 无须将数据导出至电子数据表或多次数据导出
终点检测 终点检测
等位基因分型 等位基因分型 阴性阳性鉴定 阴性阳性鉴定
Workflow
mirVana™ miRNA Isolation Kit
TaqMan® MicroRNA RT kit TaqMan® MicroRNA Assays
TaqMan® Universal Master Mix,No UNG
Five Fully Integrated Systems for Real-Time PCR
•
•
正常与突变探针在同一管里反应的点突变检测
基因分型检测
FAM VIC Homozygote for FAM-specific allele
VIC FAM Homozygote for VIC-specific allele
FAM VIC
Heterozygote for both alleles
real time quantative PCR(RT-PCR,qPCR)实时定量PCR详细操作流程
1.SYBR Green使用浓度：太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱。
2.引物特异性高，否则扩增有杂带。
3.反应温度和时间，根据酶和引物决定。
4.其他与常规PCR相同。
noise band建议刚好越过实验中设置的阴性孔。
不同的基因不需要相同的阈值，但是每块板上同一对引物扩增的基因使用相同的阈值。
横坐标：扩增循环数纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号收集荧光信号阈值：前15个循环信号作为荧光本地信号baseline，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。
荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
Ct:PCR扩增过程中，扩增产物的荧光值达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
Ct值极具重现性。
定量时多取15-35较好。
1.dye kit：roche lightcycle 480 sybr green 1 masterKit中小瓶：Master 2x, 储存于-20℃，避光，避免反复冻融，使用前上下颠倒混匀，避免气泡，不能震荡Water，PCR grade储存于-20℃配制好的PCR反应液，可于室温稳定保持24h，需避光。
2.template：在20μl体系中，说明书中推荐20ng纯化的cDNA，50-100ng genomic DNA，108拷贝plasmid DNA。
根据以往经验，150-200ng cDNA（也许未纯化）为佳。
模板太多，会影响荧光发光。
如果模板不纯，则模板量不能超过2μl，预变性时间改为10min，可降低模板中杂质的影响。
3.primer：最终工作浓度为0.2-1μM, 推荐0.5μM。
引物浓度的原则是，达到目标荧光浓度时，最低引物浓度，导致最低crossing points，Cp值。
4.products: 产物长度最好不超过500bp5. system✧配制体系时，不能触摸PCR板的上表面以及封口膜，戴手套✧Master mix避光✧冰上加样✧准备好混合样品后，吹打混匀，不能震荡20μlMaster mix 10F（10μM）1（0.5μM）R（10μM）1（0.5μM）Template 1（150ng）DDW PCR grade 76.program：Incubation 95℃ 5min or 10min Amplification 95℃ 10s55-60℃（选58℃），5-20s（选20s）72℃5-30s（选30s）40 or 45 cyclesMelting Curve 95℃ 5s，65℃1min，97℃Cooling 40℃ 10s。
real time pcr
real time pcrReal-time PCRReal-time PCR，即实时荧光定量PCR（qPCR），是一种强大的分子技术，能够在实时状态下监测和测量DNA的扩增。
该技术通过对传统PCR的改进，实现了对特定DNA序列的高精度、高灵敏度和快速检测与定量。
Real-time PCR的核心特征实时监测Real-time PCR在每次扩增循环后测量PCR产物的积累，从而能够在反应的对数增长阶段进行量化。
这种实时监测的特性使得该技术能够准确反映DNA 扩增的动态过程。
通过实时监测，研究人员可以在反应进行过程中观察到DNA 扩增的每一个阶段，而不必等到反应结束后再进行分析。
这种特性不仅提高了实验的效率，还减少了由于后续处理步骤可能引入的误差。
此外，实时监测还允许研究人员在反应过程中进行调整，以优化实验条件，提高结果的准确性。
量化能力该技术提供了一种可靠的量化关系，即初始目标DNA序列的数量与产生的扩增子（amplicon）数量之间的关系。
这种量化能力使得Real-time PCR在需要精确测量DNA或RNA数量的应用中具有显著优势。
通过标准曲线法或绝对定量法，研究人员可以准确地计算出样本中目标序列的初始拷贝数。
这对于需要精确定量的实验，如基因表达分析、病毒载量测定等，具有重要意义。
量化能力的提高也使得Real-time PCR在药物开发、临床诊断等领域得到了广泛应用。
高灵敏度Real-time PCR具有极高的灵敏度，能够检测到极少量的目标DNA。
这种高灵敏度特性使得该技术在病原体检测、基因突变分析等需要高灵敏度的场景中尤为重要。
通过使用特异性探针和优化的反应条件，Real-time PCR可以检测到低至单拷贝水平的目标序列。
这对于早期疾病诊断、微量样本分析等应用至关重要。
高灵敏度的检测能力还使得Real-time PCR在环境监测、食品安全检测等领域得到了广泛应用。
多功能性Real-time PCR不仅可用于定性分析（即检测目标DNA或RNA的存在与否），还可用于定量分析（即测量目标DNA或RNA的拷贝数）。
Real Time PCR介绍
Gene specific Primer
5’
F
目的片段
R
3’
ToTal RNA中Genomic DNA混入的对策
Genomic DNA
exon PCR Primer exon intron
RealTime PCR
cDNA
exon PCR Primer exon
RealTime RT-PCR
Small PCR Product
SYBR Green I：是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具 有绿色激发波长的染料。
SYBR Green I
SYBR Green I法作用机理示意图
热变性
Primer
F
F
F F F
退 火
Primer
Pol.
F
F
F F F
延 伸
Primer Pol.
F F
F
F
F
TaqMan法作用机理
TaqMan探针为一寡核苷酸，
Real Time PCR引物及探针设计
扩增片断大小 Primer长度 GC含量 Tm值 序列
★ ★ ★ ★★★ ★
80-150bp(尽量限制在300bp以内) 17-25base 40-60%(最好45-55%) 两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值
△ 整体上碱基不能过偏 △ 个别部分避免GC rich或AT rich(特别是3’端) △ 避免T/C连续，A/G连续 △ 3’末端避免GC rich或AT rich
RealTime PCR
Long PCR Product or No Product
融 解 曲 线 分 析
Small PCR Product
手把手教你荧光定量PCR（二）
手把手教你荧光定量PCR（二）第二步反转录cDNA合成反转录cDNA比较简单, 将抽提好的RNA稀释终浓度为1ug/ul。
提前将以下试剂在冰上融化，所有酶都要最后从冰箱取出,加入体系。
本步骤在普通PCR管中进行即可，Mix配制一步法：cDNA可保存-80℃备用，一年有效, 稀释10-30倍。
第三步荧光定量RT-PCR一般来讲,进行Real-time qPCR Master Mix都是2×浓缩液,只需要加入模板和引物。
由于Real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔, 以防在后面的数据分析中, 由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。
Real-time qPCR灵敏度非常高, 反应体系的引物终浓度为200-500 μM; 模板总RNA一般是10 ng-500 ng；如果cDNA，通常情况下是1 ul 的10-30倍稀释液, 要根据目的基因的表达丰度进行调整。
当然这些都是经验值，在操作过程中,还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。
在反应体系配置过程中下面几点需要注意:1. Master Mix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。
2. 配制Mix减少加样误差。
最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要换新枪头! 不要连续用同一个枪头加样，不沾的枪头可以反复打。
4. 所有成分加完后, 离心去除气泡。
5. 每个样品至少3个平行孔，多配置mix可以配置4孔量。
小编以 HT-7900，384孔板为例RT-PCR仪器要提前预约，约2-3h。
CD/DVD拷贝数据荧光定量PCR中的阴性对照是以不表达的基因为模板，杂峰出现；阳性对照是以确定表达的基因为模板，融解曲线为单一峰；无模板对照就是加水代替模板，无峰出现；污染对照是两种基因的表达，出现双峰。
上机操作步骤HT-790001新建一个程序（如果已有的话可以直接用）。
File----new-----默认OK02寻找基因的名称（没有的话可以自己添加）。
Real-TimePCR：从原理到步骤详解、再到终极数据分析
Real-TimePCR：从原理到步骤详解、再到终极数据分析作者：解螺旋·猫大如需转载请注明来源：解螺旋·医生科研助手导语小伙伴们，今天我们来解析一下Real-Time PCR，从原理到步骤详解再到数据分析，一个都不能少！在正式开讲之前呢，猫大必须要安利一个网址：/primerbank/ 。
对，这就是著名的哈佛引物库！目前 PrimerBank 收录了超过 306,800 对 Real-Time PCR 引物，涵盖了大部分人类和小鼠基因。
小伙伴们可以用GenBank Accession，NCBI protein Accession，NCBI Gene ID，Gene Symbol，PrimerBank ID 或者关键词去库里搜索引物。
而且还整合了blast 功能，可以拿目的基因序列去 primerbank 的数据库里进行blast。
据说其中收录的26,855 对小鼠引物经过Real Time PCR 验证后，其中22,187 对引物是可用的，成功率有82.6%但是猫大建议小伙伴们，在库里搜索到引物之后呢，别忘了用 oligo 6 评价一下引物，多练习一下 oligo 6 的使用也是很好的嘛。
好，下面开讲 Real-Time PCR，我们就从 Real-Time PCR 的发展史说起，包括Real-Time PCR 的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解Real-Time PCR 。
由于内容比较多，这五个部分会分成 3 讲。
首先是 Real-Time PCR 的原理，实验设计和实际操作。
Real-Time PCR 发展史Real-Time PCR 的技术的发展是伴随着 Real-Time PCR 仪的研制。
1995 年，美国ABI 公司（已经并入Invitrogen 公司）成功研制了Taqman 技术，并推出了首台荧光定量PCR 检测系统7700，通过检测每个循环的荧光强度对PCR 进程进行实时检测。
用于检测细胞因转录水平的实时定量PCR 的操作流程
用于检测细胞 因转录水平的实时定量PCR 的操作流程（Real Time Quantitative PCR Protocol For Detection of Gene Expression ）第一部分 原理real time PCR 是普通PCR 的一项收进，使用了针对扩增DNA 的荧光物质，使得DNA 的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA 的扩增曲线（如，图一）。
图一：引自美国应用生物系统中国公司网站——实时荧光定量PCR ——一种科学准确的定量方法。
名词解释：Rn :一个反应管经n 次热循环后，测得的荧光强度。
Rn+:反应管含有模板DNA 。
Rn-:反应管含有模板DNA 。
无模板对照：No template control ，Rn-，理想情况下，是一条平线，只具有背景荧光数值。
Threshold: 荧光（Rn ）超过本底时的临界数值。
Ct: threshold cycle ，临界循环数，threshold 横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循环数。
线：baseline, 是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。
仪器：热循环仪器（GeneAmp Thermal Cycler 9600）+电脑（装有Sequence Detection System 软件）+荧光检测系统(GeneAmp Sequence Detector 5700)（如，图二）。
易生物 w w w .e b i o e .c o m图二，引自/。
全部实验包括步骤： 1，类似普通PCR 反应的物品混合于反应管，之外还要添加荧光物质（SYBR 染料 或 TaqMan 探针）。
2，使用SDS 软件标明热循环仪器中放入的所有反应管，设定热循环仪器的温度变化，存储热循环仪器的工作情况，存储荧光信号，分析DNA 的扩增曲线。
3，利用SDS 输出的数据，其他专业数据处理软件，近似计算得到原始DNA 的浓度，做必要的误差分析。
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Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手时间:2012-03-05 21:22来源:生物吧作者:刘浩点击: 13338 次由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。
由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。
由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。
本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real-time qPCR发展史Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
由于常规的PCR 的缺点，real-time qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。
现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。
在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。
1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了 Taqman技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。
从而荧光定量PCR获得广泛应用。
现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、 PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM 系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。
随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。
与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-time PCR仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器。
二、Real-time qPCR概述1. Real-time qPCR原理实时PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
一般来讲，定量PCR仪包括：实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。
其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。
独特是这个微量荧光检测系统。
有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。
常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光CCD摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。
在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。
具体数据就是基线，荧光阈值和Ct值。
2. Real-time qPCR的数学原理首先来看一个real-time qPCR中的重要参数Ct值（Ct value），阈值（threshold），和基线（baseline）。
一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。
阈值一般是基线的标准偏差的10倍。
在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。
Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。
所以是一个没有单位的参数。
那么为什么说Ct值跟初始模板的量成反比呢？我们来看PCR的扩增方程：从线性方程上看，斜率（slope）为就可以算出扩增效率（0.99于100%，是由于PCR反应中存在抑制因素；而高于 100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。
3. Real-time qPCR的种类根据real-time qPCR的化学发光原理可以分为2大类：一类为探针类，包括TaqMan@探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；一类为非探针类，其中包括如SYBR@Green I或者特殊设计的引物(如LUX@Primers) 通过荧光染料来指示产物的增加。
3.1 Taqman@探针法Taqman@探针是最早用于定量的方法。
就在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，也就是FRET反应；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
3.2 分子信标法分子信标：一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。
在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。
分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。
荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。
分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。
与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。
当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。
3.3 SYBR@Green 法SYBR@Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。
这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。
SYBR@Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
在PCR反应体系中，加入过量SYBR@Green 荧光染料，SYBR@Green 荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR@Green 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
3.4 LUX@Primers法LUX@ (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。
目标特异的引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。
在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。
在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。
4. Real-time qPCR和常规PCR的区别实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高精确定量据分析（这一部分单独说明）。
1. 实验材料的处理和准备以最基本的基因表达差异分析为例。
实验材料分为对照组（CON）和处理组（TRT）。
组内要有生物重复，可以数据分析此处理是否有统计意义。
在材料收集过程中，尽量避免RNA的降解（尤其对于绝对定量的样品）。
一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻，然后迅速转移到超低温冰箱保存，但这种方法携带不方便，由于对于异地取材。
现在新技术的发展，也有一些非液氮类的样品储存液，比如百泰克的RNAfixer 。
2. 引物设计一般real-time PCR引物的设计遵循下面一些原则：扩增产物长度在80-150bp。
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
产物不能形成二级结构。
产物长度一般在15-30碱基之间。
G+C含量在40%-60%之间。
碱基要随机分布。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物5’端可以修饰。
引物3’端不可修饰。
引物3’端要避开密码子的第3位。
Taqman@探针的设计稍有不同，一般有公司设计合成。
遵循下面以下原则：尽量靠在上游引物；长度30-45bp，Tm比引物高至少5℃；5’端不要是G，G会有淬灭作用，影响定量四、Real-time qPCR操作过程1. RNA提取和反转录在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。
由于RNA酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的。
在实际的操作中应遵循下面一些原则：1. 全程佩戴一次性手套。
皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。
培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
2. 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。
例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含RNA酶。
3. 在提取裂解液中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。
而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。
玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。
塑料器皿可以在0.5M NaOH 中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
当然，这些也不是绝对的要求。
如果是操作熟练。
完全可以用初次开封的离心管和枪头，新过滤的超纯水，进行RNA的提取。
2.Mix配制一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。
由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。
通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。
当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。