病毒学 第七章：病毒基因

同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重组。 是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再 连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或 双链片段的交换。
杆状病毒表达体系的优点： 加工和转运体系，其表达的外源基因产物在抗原性、免
• 杆状病毒表达体系具有与高等真核细胞类似的蛋白修饰， 疫原性和功能上均与天然蛋白相似。
cI
LA 32.7
λgt 10 lac Z
EcoR I
RA10.6
LA 19.9
EcoR I
RA21.9
Charon 16A
是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、 抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段， 其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。 在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使 少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用 于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片 段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这 样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段 的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂 IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然 而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补 能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的 筛选，又称为蓝白斑筛选。
DNA，然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大
肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖
而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文库的构建。
2、丝状噬菌体
大肠杆菌的M13噬菌体为单链环状DNA M13噬菌体的生物学特性：
M13噬菌体的外型呈丝状，由外壳包装蛋白和 正链DNA组成。DNA全长6407个核苷酸，基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质， DNA上有11个基 因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔 位于基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 以及基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之间， 其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。成熟的 噬菌体只感染雄性大肠杆菌， M13噬菌体不裂解宿 主细胞，但抑制其生长。 2700个外壳蛋白分子
善和发展，同时使RNA反转录为cDNA成为实验室常规
手段，也使基因工程这门学科得到了飞速的发展。
病毒基因工程就是利用重组DNA技术，以病毒为载
体，高效表达病毒基因及其它外源基因或者对病毒基因
进行基因治疗及开展有关蛋白功能研究。
组进行改造，用于制备防治病毒性疾病的疫苗、杀虫剂、
第一节 病毒载体
一、噬菌体载体
第七章：病毒基因工程
第一节 病毒载体 第二节 病毒基因工程应用举例
本章重点
1.几种重要的基因工程载体 2.噬菌体展示的原理
人们研究病毒，一方面是为了控制病毒性疾病，另
一方面也是为了利用病毒服务人类。
1953年Watson和Crick发现了DNA双螺旋结构，开 创了分子生物学的新时代。 1970年H.M.Temin和D.Baltimore对RNA肿瘤病毒 反转录酶的发现，不仅使DNA复制的中心法则得以完
RFDNA
+ DNA
V + DNA
θ 复制
θ 复制
RFDNA
RFDNA
在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链） 在宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA ，用于 DNA
的复制，因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA
（replicative form DNA） ，即 RFDNA 。 通过θ复制方式， RFDNA进行扩增，基因的转录 也随即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基 因的转录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终
AcMNPV是有囊膜的闭合环状dsDNA病毒，的基因表达分为
4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和 极晚期基因表达。 其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它 们是多角体蛋白和P10蛋白。多角体蛋白是形成包涵体的主要成 分，感染后期在细胞中的积累可高达30％ ～50％，是病毒复制 非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感 染能力。另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病 毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶 解有关。多角体基因和 P10基因现在都已被定位和克隆，这两个 基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆 状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。
说，中段是非必需的。
2、λ噬菌体的缺陷与改造
λ噬菌体的缺陷： ⑴ 基因组太大（49kb）； ⑵ 酶切点太多，它有 5个 BamH1位点（G↓GATCC ）， 6个 BgⅠ位 点（A↓GATCT），5个EcoRⅠ位点（G↓AATTC）。
⑶ 野生型只能接纳一定长度的DNA。接纳49kb×5%=2.45kb的 DNA。
SV40病毒基因组早期基因编码两种肿瘤抗原(tumor antigen， T抗原)，其分子量分别为94000(大T抗原)和17000(小T抗原)。 T抗原有以下的作用: ① 通过抑制宿主细胞Rb和p53基因，促使细胞分裂； ② 阻止细胞凋亡； ③ 结合在SV40的复制起点，起始病毒复制； ④ 关闭病毒早期转录； ⑤ 启动病毒晚期转录； ⑥ 在病毒组装中起作用； ⑦ 小T抗原对于细胞的转化不是必需的，但可起加强作用。
绕模板整整一周时，被取代的正链由基因 Ⅱ 产物切去，
当感染细胞内累计有 100-200 个 RF DNA 时，细胞 内也产生了足够的单链 DNA 结合蛋白，即基因 Ⅴ 蛋
白。该蛋白可以抑制翻译活性，特别是抑制基因 Ⅱ
mRNA 的翻译，并且强烈地结合在新合成的正链 DNA 上，阻止其转化成 RF DNA 。此时， DNA 的合成几乎 只产生子代正链 DNA 。另外，基因 Ⅹ 蛋白和基因 Ⅴ 蛋白也是噬菌体特异 DNA 合成的强力抑制子，从而限
• 构建杆状病毒载体的主要基因为多角体基因ph和p10， 为病毒复制非必须基因。 • 多角体基因ph和p10有非常强大的启动子，可使目的基 因大量表达，可达细胞总蛋白量的25%。
• 杆状病毒基因组较大（130Kb），适合克隆大片段外原
基因，还可以同时表达几个基因。 • 杆状病毒不感染脊椎动物，比较安全。
AcNPV病毒用作外源基因的表达载体，通常是通过体内同 源重组的方法，用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病
毒。BEVS通常由转移载体、亲本病毒和重组介质三部分组成， 其技术路线分以下几步：
① 先将外源片段克隆到转移载体质粒中，置于杆状病毒启动子 控制之下，上下游各有一段与亲本病毒DNA相匹配的侧翼序列， Leabharlann Baidu建成转移载体； ② 然后把转移载体和野生型病毒共转染昆虫细胞，通过同源重 组将外源片段插入到病毒基因组； ③ 再以特定的筛选标记和方法获得重组病毒。
（2）替换型载体：只有DNA的长度大于野生型的75%而
不超过105%，才能包装成噬菌体。插入外源基因20kb。
没有外源基因插入的噬菌体不能包装。
（3）cos质粒：如果将左右臂和中段都去除，仅留下
λDNA两端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒
的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成cos 质粒或称为粘粒的载体。粘粒可插入45kb长的外源
止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。
当基因 Ⅱ 蛋白在亲代 RF DNA 的正链特定位点上
产生一个切口时，便启动噬菌体基因组进行滚环复制。 此时，在大肠杆菌的 DNA 聚合酶 Ⅰ 的作用下，以负 链为模板在切口的 3' 末端加入核苷酸，并持续 DNA 的 合成，用新合成的 DNA 替换原有的正链。当复制叉环 经环化后形成单位长度的噬菌体基因组 DNA 。在感染 开始的 15～20 分钟内，这些子代正链在宿主细胞酶的 作用下，又转变成 RF DNA ，然后以之为模板继续转 录并继续合成子代正链 DNA 。
λ噬菌体的改造 λ噬菌体的改造
⑴ 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更 大）； ⑵ 去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口； ⑶ 增加标记基因（remarker gene）。
（1）插入型载体：
λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用 于cDNA文库或基因组文库的构建，一般容许插入 5-7kb外来DNA。 •cI基因插入失活： 如λgt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoRI及Hind III的酶 切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导 致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。 •LacZ基因插入失活： 如charon16A载体，在非必须区段引入lacZ基因，在lacZ基因 上有EcoRI位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。
制感染细胞内 RF DNA 的数量。结果，感染细胞内 RF
DNA 的数目和子代正链 DNA 的产生速率都能保持适度。
• 单链 DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的 RF DNA。RF DNA 很容易从感染细胞中纯化出 来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方 法再次导入细胞。
M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质: 复制蛋白(基因 Ⅱ，Ⅴ 和 Ⅹ) 形态发生蛋白(基因Ⅰ，Ⅳ 和 Ⅺ) 结构蛋白(基因 Ⅲ 、Ⅵ、Ⅶ、 Ⅷ 和 Ⅸ )。 基因组 DNA 为正链，按基 因 Ⅱ 至基因 Ⅳ 方向合成，与 噬菌体的 mRNA 序列同义。
大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA
M13 DNA载体的构建：
尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的结构蛋白质。 ②中段：长约20kb，位于基因J和N之间，是λDNA整合和 切出，溶原生长所需的序列。 ③右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最
重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区
域内。 左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组
装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来
1、λ噬菌体
线状dsDNA，总长度为48502bp，在DNA分子的两端
各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5’单链突出
序列，即黏性末端。λ噬菌体DNA进入寄主细胞后，通过 两个末端互补结合形成黏性末端位点，使DNA环化，开 始复制。
λ噬菌体整个基因组可分为三个部分
①左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、
III VI I IV II X V VII IX VIII
野生型M13RF-DNA
III VI I IV II X V VII IX VIII
M13mp系列载体
polylinker lacZ
大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA
（+）DNA M13噬菌体的生物学特性： 感染周期 II
滚环复制
+ DNA
三、动物病毒载体
1、SV40（猴病毒40）病毒作为载体
（1）SV40基因组（多瘤病毒科） 其基因组为共价闭合环状双链DNA，只有5243个碱基对。是第一个 完成基因组DNA全序列分析的动物病毒。
（2）SV40的复制和增殖 •SV40感染敏感的猿猴细胞后，经过8-12小时的潜伏期，脱去外 壳， DNA进入细胞核。 •首先启动早期转录，在细胞质中翻译产生T和t抗原。 •当两种抗原积累到足够量时，DNA开始复制，同时启动晚期转录， 翻译产生壳蛋白VP1、VP2、VP3 ，将DNA包装成病毒颗粒。 •当细胞内病毒颗粒多达105时，细胞破裂，释放出大量病毒颗粒。
• 成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这 是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是 无论是RFDNA或ssDNA都能转染E.coli的F+或F细胞。
M13噬菌体载体
6.4 kb单链环状正链DNA基因组。
作载体的优点：
(1) RFDNA和SSDNA都可转染E.coli，产生噬菌斑；
(2) 无包装限制问题（可6倍于M13基因组）； (3) 复制以双链环形DNA为中间媒介； (4）易测出外源DNA的插入方向； (5）可产生能直接测序的单链DNA分子。
二、典型的杆状病毒表达系统
昆虫杆状病毒表达载体系统（bculovrirus expression vector system，BEVS）于20世纪 80 年代初期问世，已被公认为当今基因工程四大表 达系统（即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动 物细胞表达系统）之一，应用最广的是苜蓿丫纹
夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)与S9细胞系。