免疫组织化学技术的原理及方法
免疫组化原理、步骤及要注意的事项
免疫组化原理、步骤及要注意的事项免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。
直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。
目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。
免疫组化各步原理
一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry"HC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。
Slide 3:（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
主要步骤:主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃ 烤箱烤片15小时以上一从烤箱中拿出立即放入二甲苯I中5~10 min一二甲苯II 5~10min 一无水乙醇5min 一95%乙醇5min 一80%乙醇5min 一70%乙醇5min 一自来水洗Slide 6:2、3%H2O2阻断20min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS 洗3次，每次5min。
3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。
4、滴加5~10% 正常山羊血清封闭，37℃, 10min （消除背景非特异性着色）Slide 7:5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min 再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min。
6、擦干组织周围PBS, 滴加生物素标记的第二抗体，37c 孵育20min, PBS洗3次，每次5min。
Slide 8:7、擦干组织周围PBS,滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37c 孵育20min。
8、PBS洗3次，每次5min, D.W洗2次，DAB显色（DAB必须现用现配），镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。
染色步骤:染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种常用的实验诊断技术，它通过检测细胞或组织中的特定蛋白质来帮助诊断疾病。
免疫组化的完整步骤包括抗原制备、抗体制备、预处理、染色和结果分析等几个环节。
下面我将详细介绍每个环节的原理及操作步骤。
首先是抗原制备。
抗原是指能够与特异性抗体结合的物质，常见的抗原有蛋白质、多肽和核酸等。
在免疫组化中，我们需要选择一种合适的抗原，并将其制备成适合免疫反应的浓度和形式。
一般来说，抗原可以采用化学合成法、生物来源法或基因工程技术等方法进行制备。
接下来是抗体制备。
抗体是指能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白，它是免疫组化的核心成分。
在抗体制备过程中，我们需要先确定需要检测的抗原类型和数量，然后选择合适的动物或植物源材料，进行细胞融合或表达纯化等步骤，最终得到高纯度的单克隆抗体。
第三步是预处理。
在进行免疫组化之前，我们需要对样品进行一系列的预处理操作，以去除杂质和干扰物质的影响。
预处理包括样品稀释、缓冲液调整、基质效应消除等步骤。
还需要根据具体的实验设计选择合适的预处理方法和条件。
第四步是染色。
染色是免疫组化的核心步骤之一，它可以将标记有抗体的二抗与待测样本中的抗原结合，形成可视化的斑点分布。
常用的染色方法包括直接荧光法、间接荧光法、免疫印迹法等。
在染色过程中，需要注意染料的选择、浓度和作用时间等因素，以保证染色效果的质量和稳定性。
最后一步是结果分析。
免疫组化的结果分析需要综合考虑多个因素，如阳性对照品的比较、背景值的控制、图像处理和统计分析等。
常用的结果分析方法包括图像分析软件(如ImageJ)和统计分析软件(如SPSS)。
在结果分析过程中，需要注意数据的可靠性和准确性，避免误判和漏判的情况发生。
免疫组化是一项复杂而精细的技术，它需要综合运用多种知识和技能才能完成高质量的实验诊断任务。
希望以上的介绍能对您有所帮助！。
免疫组织化学检验技术的材料
免疫组织化学检验技术的材料随着现代医学的发展，免疫组织化学检验技术在临床诊断和研究中扮演着越来越重要的角色。
免疫组织化学检验技术是一种利用抗体特异性与抗原结合的原理，通过特定染色方法对组织或细胞中的蛋白质进行定位和检测的技术手段。
它不仅可以用于诊断各种疾病的组织病理学分子印记，也可以用于肿瘤分子生物学研究和实验室医学检测。
本文将介绍免疫组织化学检验技术的原理、方法和应用。
一、原理免疫组织化学检验技术的原理是基于抗体特异性结合抗原的特性。
在免疫组织化学检验中，首先需要利用免疫组织化学染色方法标记抗体或抗原，然后利用生物学、生物化学、免疫学、组织学和显微镜学的综合知识来检测这种标记。
常用的标记物有辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，辣根过氧化氢酶等。
通过染色显色法观察并分析组织或细胞中的蛋白质分布情况，从而获得与抗体相关的信息。
二、方法免疫组织化学检验技术的方法包括抗原修饰、抗体标记、染色显色和结果分析等步骤。
抗原修饰是将组织或细胞中的抗原提取、定位和识别；抗体标记则是利用特异性抗体对抗原进行识别和结合，通过标记物的作用将这种结合关系可视化；染色显色是指通过添加适当的染料或显色物质，使抗原-抗体结合产生的信号可视化；结果分析则是根据显色结果，观察、统计、记录和分析样品中抗原的分布情况。
通过这些方法，可以对细胞和组织中的蛋白质进行高效、准确地定位和检测。
三、应用免疫组织化学检验技术在临床和科研领域有着广泛的应用。
在临床诊断中，免疫组织化学检验技术可以帮助医生诊断肿瘤、感染、自身免疫性疾病等疾病，并且可以评估患者的预后和治疗反应。
在基础科研领域，该技术可以用于研究细胞信号传导、蛋白质相互作用、细胞分化等生物过程，也可以用于发现新的生物标志物，探索疾病的分子机制。
免疫组织化学检验技术在药物研究、医学影像学和病理科学等领域也有重要应用。
总结免疫组织化学检验技术作为一种重要的分子生物学技术，在临床诊断和基础研究中起着不可替代的作用。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术第一篇：免疫组织化学技术基础免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理对细胞或组织进行化学定位的技术。
该技术可以用于鉴定细胞或组织中某种特定抗原的存在及分布情况，从而为病理诊断、学术研究和药物研发等提供有力的支持。
一、免疫组织化学技术的原理免疫组织化学技术的原理是利用抗体与其靶分子间的特异性结合反应，来实现对目标物的检测和定位。
抗体可以识别并结合到人体或动物体内的大部分蛋白质，包括生物芯片检测、ELISA检测、Western blotting等技术所用的基质和抗原。
在免疫组织化学技术中，针对某种抗原的特异性抗体先与组织样本中的特异性抗原发生特异性结合，然后通过检测抗体所标识的色素或荧光物等发射的信号，加以可视化。
例如，用特异性抗体和明胶酶-抗明胶酶复合物在组织样本上进行化学染色，从而定位并可视化样本中的抗原。
二、免疫组织化学技术的步骤1. 样本制备：第一步是样本的制备，包括切片、固定和脱水等处理。
固定组织样本是为了保持其形态和结构，因此往往使用福尔马林等固定剂进行固定。
在制片时，细胞或组织切割成相对较薄的切片，一般为5-10 μm。
切割后，通常漂洗去除固定剂，然后脱水，通常采用乙醇浓度逐渐递增的方法进行。
最后，将切片放置于有机媒介中，如去石蜡等。
2. 抗原修复：切片离体后，抗原结构可能会发生改变，因此需要进行抗原修复。
抗原修复可以通过热处理、酶解或酸解等方式进行。
热处理方法包括水浴、压力釜等；酶解包括蛋白酶和肝素酶等；而酸解则是利用酸将组织溶解并解离抗原。
3. 抗体标记：抗体标记是免疫组织化学技术的核心步骤。
选择具体的抗体，可以选择单克隆或多克隆抗体等。
接着，抗体常被标记为一种检测信号(如与酶或荧光物质结合)。
免疫荧光技术通常是通过荧光标记的二抗或荧光标记的可溶解复合物来可视化。
荧光地染色颜色有多种不同的方式，如荧光素-醌染料、荧光素-异硫氰酸染料等，可以根据不同的研究目的选择不同的荧光染色方法。
免疫组化的原理及试验步骤
免疫组化的原理及实验步骤一免疫组化的原理免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
二免疫组化的实验步骤固定１．浸入式：将组织样本直接放入固定液（4%的多聚甲醛等固定液）内，4℃浸泡2小时，不超过12小时２. 灌注式：主要适用于脑部组织，用从心室灌注生理盐水排空血管中血液后灌注固定液切片1.石蜡切片：(1) 使用从低浓度到高浓度的乙醇使组织脱水；(2)将组织浸入二甲苯中透明；(3)在溶蜡箱中，组织被石蜡包埋；(4)将包埋好的蜡块冷却后固定于切片机上，切成薄片，并将薄片贴于玻片上；(5)用二甲苯脱蜡并重新从高到底浸泡乙醇；注意：石蜡切片制备好后还需要进行抗原修复以解开被甲醛交联的抗原决定簇上的氨基或羧基，常用方法有微波热修复，煮沸热修复，酶消化方法２. 冰冻切片：将固定的组织放入液氮或干冰-丙酮中迅速冷却，然后切片机切片，并将片贴于玻片上封固1.防止脱片，可以使用树脂胶或多聚赖氨酸进行黏附。
2.避免内源性过氧化酶的影响，可以用3%双氧水处理15min,(针对用过氧化酶标记的抗体)3.避免内源生物素的影响，可以鸡蛋清或卵白素进行封闭；4.避免非特异性染色，可以用二抗来源的血清进行封闭染色1.滴加稀释后的一抗，4℃过夜，PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；2.滴加稀释后的二抗，37℃孵育30min,PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；显色：选择与二抗配套的显色系统，进行反应，PBS终止反应后，用苏木素村然胞核，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，37℃干燥48小时，显微镜下观察。
《病理学》免疫组化讲课-原理及方法
多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一 抗多克隆抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用 至关重要。
多克隆抗体与单克隆抗体及其产生
单克隆抗体的产生
应用细胞融合的杂交瘤技术 （Hybridization），以针对单 一抗原决定簇的小鼠与小鼠骨 髓瘤细胞（肿瘤性B细胞）融 合形成杂交瘤，其特点是既能 产生特异性抗体，又能在体外 无限地增殖。将瘤细胞在体外 培养或注入小鼠腹腔内而获单 克隆抗体，由此产生的小鼠抗 人（抗原）的抗体常以MaH表 示，现在亦有兔的单克隆抗体
市售抗体的种类
某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体，如 角蛋白，一些抗原只有多克隆抗体，如α-胰蛋 白酶
有些抗体的抗原来自动物，利用动物与人抗原 之间的共同抗原性使该种抗体能应用于人的检 测。如Desmin来源于鸡的肌肉
近年来,市售单克隆抗体除小鼠源性外，还有兔 源性
标记抗体
在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使 抗原抗体的结合能用肉眼观察到
三抗是以过氧化物酶为抗 原，在与一抗同种动物身 上诱发产生的抗体，并与 辣根过氧化物酶形成复合 物（PAP）
PAP法
（Peroxidase-AntiPeroxidase，过氧化酶-抗过氧化酶法）
优点：
PAP复合物中含酶更多，且是一种非标记的免 疫组化方法，敏感性更高
PAP复合物常来自两种不同的动物（鼠、兔）， 鼠PAP用于一抗为单克隆抗体的染色，兔PAP多 用于一抗为多克隆抗体的染色
一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和 素+酶标生物素）
优点：
亲和素和生物素有强大亲和力，使其比直 接和间接酶标法更敏感，也超过PAP法。
免疫组化的原理及操作规程
免疫组化的原理及操作规程免疫组化，即免疫组织化学染色技术，是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对定量的研究方法。
该技术广泛应用于临床病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域。
本文将详细介绍免疫组化的原理及操作规程。
一、免疫组化的原理免疫组化的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体是机体的免疫细胞在抗原刺激下产生的具有特异性识别能力的免疫球蛋白。
在免疫组化中，通常将目标抗原（如某种蛋白质或多肽）作为待检测物，通过特定的抗体与之结合，再利用标记技术使抗体可视化，从而实现对目标抗原的定位、定性和定量研究。
免疫组化的标记技术主要有直接法和间接法两种。
直接法是将标记物（如荧光素、酶等）直接标记在抗体上，使其与目标抗原结合后直接显色。
间接法则是利用未标记的抗体（一抗）先与目标抗原结合，然后再通过标记的二抗（与一抗特异性结合的抗体）与一抗结合，最终实现显色。
间接法具有更高的灵敏度和灵活性，因此在实际应用中更为常见。
二、免疫组化的操作规程免疫组化的操作规程主要包括以下几个步骤：1. 标本处理：根据实验需求选择合适的组织标本，并进行固定、脱水、包埋等处理，制备成组织切片或细胞涂片。
固定是为了保持组织或细胞的形态结构，防止抗原丢失；脱水则是为了去除组织中的水分，便于后续操作；包埋则是将组织块包裹在支持物（如石蜡）中，便于切片。
2. 抗原修复：由于固定和脱水等处理过程可能导致抗原表位的遮蔽或改变，因此在进行免疫组化染色前，需要对抗原进行修复。
常用的修复方法包括热修复、酶修复和酸修复等。
具体方法应根据实验需求和抗原性质进行选择。
3. 阻断内源性酶活性：为了避免组织内源性酶对后续显色反应的干扰，需要使用相应的阻断剂（如过氧化氢）对内源性酶活性进行阻断。
免疫组化技术简介
06
04
02
07
失 败
05
技 术
03
基 本
01
原
要
原
质
因
结
点
操
理
基
量
果
作
本
控
判
流
概
制
读
程
念
CONTENTS
目 录
质量控制
试剂的质量控制
➢ 抗体特异性、敏感性测试 ，抗体最佳稀释度的选择 ，稀释剂 ，抗体孵育温度、
时间。
仪器的质量控制
➢ 相关技术设备、仪器和器具定期校对、消毒。
操作过程质量控制
形态和结构；②保持组织细胞的抗原性；③防止细胞层脱落；④去除 细胞内的脂类（妨碍抗体结合）；⑤防腐。
➢ 注意事项：①组织块不宜过大；②固定液的量一般以组织块大小的30
倍为宜；③必须选择对组织渗透力强，同时又不致使组织过度收缩或 膨胀的试剂；④固定时间一般以24小时为宜。
➢ 固定液的选择：所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学
基本概念
抗原（Antigen, Ag）
➢ 一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细
胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物 质。
抗体（Antibody, Ab）
➢ 机体受抗原刺激后由B淋巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与
相应抗原发生反应的球蛋白，称为免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。
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失 败
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原
要
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免疫组织化学检验技术
免疫组织化学检验技术免疫组织化学检验技术的发展和应用一、引言免疫组织化学检验技术是一种重要的生物医学实验技术，通过对组织样本中特定抗原的检测，可以帮助医生诊断病变组织或肿瘤类型，以及评估其分子表达水平。
本文将从免疫组织化学检验技术的基本原理、发展历程以及应用领域等方面综述相关知识。
二、免疫组织化学检验技术的基本原理免疫组织化学检验技术是一种建立在免疫学原理基础上的组织学检测方法。
其基本原理是通过使用专门设计的抗体与标记物的结合来检测组织样本中的特定蛋白质。
常用的标记物包括酶、荧光染料等，可以使抗原表达区域呈现显色或发光的现象，进而实现对组织中抗原的定性或定量分析。
三、免疫组织化学检验技术的发展历程免疫组织化学检验技术的发展经历了多个重要的里程碑。
早在20世纪50年代，Papst和Russell等学者首次使用抗体来检测肿瘤细胞蛋白质的表达。
从那时起，免疫组织化学检验技术逐渐成为研究和诊断领域中不可或缺的工具。
随着抗体和标记物的不断改进以及细胞和分子生物学的进展，免疫组织化学检验技术也日益完善。
四、免疫组织化学检验技术的应用领域免疫组织化学检验技术在生物医学领域中有着广泛的应用。
在肿瘤病理学中，免疫组织化学检验技术可以用来确定不同类型的肿瘤，并分析其分子表达特征。
在研究某些重要蛋白质表达与疾病关系的基础研究中，免疫组织化学检验技术可以帮助寻找新的生物标志物，促进疾病的早期诊断和治疗。
该技术还可以用于药物研发过程中的药物靶点评估、药效评估以及药物安全性评估等方面。
五、个人观点和理解免疫组织化学检验技术作为一种重要的生物医学实验技术，对于促进人类健康和疾病治疗具有重要意义。
通过使用免疫组织化学检验技术，我们可以更加准确地诊断患者的疾病类型，并对其进行个体化的治疗。
免疫组织化学检验技术还可以帮助我们深入了解蛋白质的分子机制，促进生物医学研究的进展。
总结与回顾本文主要介绍了免疫组织化学检验技术的基本原理、发展历程以及应用领域。
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理和步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于组织学和细胞学研究中的实验方法，主要用于检测和定位蛋白质在组织或细胞中的分布和表达水平。
它结合了免疫学原理和组织学技术，通过使用特异性的抗体和染色剂来实现对目标蛋白质的检测和可视化。
免疫组化的原理主要是利用抗体的高度特异性与抗原相结合，然后使用染色技术来显示抗原的位置。
该技术的基本原理可分为抗原-抗体反应、信号放大和信号显示三个步骤。
第一步：抗原-抗体反应免疫组化的第一步是选择合适的抗体，通过与目标蛋白质的特异性结合来形成抗原-抗体复合物。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
单克隆抗体具有高度特异性，只能结合到特定的抗原上。
多克隆抗体具有高度敏感性，可以结合多个位点，从而实现信号放大。
通常，为了提高抗原的可检测性，需要对组织样本进行抗原修复处理。
这可以通过热处理（如蒸汽加热、微波加热）或酶切处理来实现。
修复可以解除组织样本中抗原与蛋白质结构之间的交联，增加抗体的渗透性和可结合性。
当抗原-抗体反应发生时，可通过一系列化学反应来形成抗原-抗体复合物。
例如，可以使用二抗来与抗原-抗体复合物结合，然后使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记的二抗来与二抗结合。
该反应可形成稳定的抗体-酶复合物。
第二步：信号放大由于抗原-抗体复合物的信号很弱，通常需要进行信号放大以便更好地检测到目标蛋白质。
放大信号的方法有很多种，其中最常用的是酶免疫标记联合酶放大技术。
酶免疫标记是通过将抗体与酶结合，使其能够催化特定的化学反应来产生荧光、色素或光学信号。
常用的酶免疫标记包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
这些酶能够催化荧光素、二苯基胺、硝基蓝等底物的氧化还原反应，从而产生可视化的信号。
酶放大技术常用的方法包括：免疫酶化学法（如DAB法）、免疫荧光法和免疫酶学荧光混合法等。
这些方法可通过将底物转化为可见的色素或荧光信号来标记抗原-抗体复合物，从而实现目标蛋白质的检测和定位。
第12章免疫组织化学技术
抗原的保存与修复
酶消化法
盐酸水解法 高压锅法
常用的抗原 暴露、修复
方法
微波法 煮沸法
抗体的处理与保存
抗体的选择： 应注意选择具有高度特异和稳定的抗体，根据需要决定采用 单克隆或多克隆抗体。 抗体的稀释： 抗原抗体反应要求有合适的比例，过量或不足均不能达到预 期结果。 抗体的保存 ： 在保存抗体时，要特别注意保持抗体的生物活性，防止抗体 蛋白质变性。
酶标记抗体免疫组织化学染色
直接法：将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内 相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最 后用酶底物显色。
间接法：将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异 性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再 用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合 ，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色 。
临床免疫学与免疫学检验
第十二章 免疫组织化学技术
免疫组织化学技术（immunohistochemistry technique）又 称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原 进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为：
第四节 免疫标记电镜技术
原理
利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等 ）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密 度产物者如HRP标记抗体，在电子显微镜下对抗原抗体反应 中的高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的 技术。
相较于其他免疫组织化学技术是在光镜下进行抗原定位 ，免疫标记电镜技术在电子显微镜下的定位更为精确，可定 位至细胞膜、细胞器，在探索病因、发病机制、组织发生等 方面有其独特的优点。
免疫组化基本原理及操作流程
免疫组化基本原理及操作流程免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的方法，用于检测和定位特定的抗原或抗体在细胞或组织中的存在和分布。
免疫组化的基本原理是利用抗原与抗体之间的高度特异性结合来实现抗原的检测和定位。
免疫组化的基本操作流程如下：第一步：标本处理标本可以是细胞培养物、组织切片、血液等。
在进行免疫组化前，首先需要对标本进行适当的处理，以使得抗原能够得到良好的保存和定位。
处理方法包括固定、脱水、包埋等。
固定是将标本用适当的化学物质处理，使其固定在载玻片上，并保持其原有的形态和结构。
第二步：抗原检测与定位在标本处理完成后，可以开始进行抗原的检测和定位。
这一步需要使用特异性的抗体来与目标抗原结合。
抗体通常通过动物免疫技术获得，即将纯化的抗原注射到动物体内，激发其产生特异性的抗体。
抗体经过收集和纯化后，将其与抗原所在的标本接触，通过抗原与抗体的特异性结合来检测和定位抗原的存在和分布。
第三步：抗体检测抗体检测是免疫组化中至关重要的一步。
通常使用标记抗体来检测抗原的存在和定位。
标记抗体是一种与特定抗体共价结合的物质，它可以通过荧光染料、辣根过氧化物酶、生物素等标记物来实现抗原的检测和定位。
标记抗体通过特异性结合抗原，使得抗原能够在显微镜下观察到，并确定其存在的位置。
第四步：显色与观察在完成抗体检测后，需要进行显色以使抗原能够在显微镜下观察到。
显色方法包括使用荧光显色、暗场显色、免疫酶染色等。
其中，免疫酶染色是最常用的方法，它通过在抗体中添加酶标记物，如辣根过氧化物酶（HRP），再加入适当的显色底物，使其生成可见的色素沉淀。
经过显色后，使用显微镜观察标本，可见到抗原的存在和定位。
第五步：结果分析与解读在观察到显色结果后，需要对结果进行分析和解读。
根据显色的程度和分布情况，可以判断抗原的阳性与阴性。
阳性表示抗原在样品中存在，而阴性则表示抗原在样品中不存在。
结果的解读需要结合临床和实验的背景知识进行综合分析。
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❖单克隆抗体：针对某一抗原决定簇， 由单株淋巴细胞（克隆）所产生的 抗体
多克隆抗体与单多克隆抗体及其产生
多克隆抗体的产生
❖ 以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个抗原决定 簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理诊断 中，有利划归 肿瘤的基本类型。
酶标亲和素
在AB复合物中，酶是标记 在生物素上，而后与亲和素 合成复合物。在标记的亲和 素-生物素方法中是将辣根 过氧化酶直接标记在亲和素 上，辣根过氧化酶与亲和素 间有极强的结合力，因此 LSAB法比ABC法更敏感
多聚物载体
1、 核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分 子，起到载体的作用
2、 一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗 和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能 与二抗相联结的由HRP标记的多聚物
显示系统
辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程: HRP + H2O2 →HRP·H2O2 →有色分子终末产
物+ HRP DAB（电子供体） HRP：酶 H2O2：底物 HRP·H2O2：酶·底物复合物
显示系统
免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点 在于显色系统的差异： ❖ 间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶 ❖ PAP法： 利用PAP复合物 ❖ ABC法： 利用AB复合物 ❖ LSAB法: 利用直接标记于亲和素的酶 ❖ EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体
标记抗体
1、在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体 的结合能用肉眼观察到
2、标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明 酶：辣根过氧化酶，碱性磷酸酶 金属离子：胶体金颗粒
3、标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性， 从而使染色敏感性降低
酶— 抗酶抗体复合物
通过免疫反应而不是化学方 法，将酶结合到抗体上，形 成具酶活性的免疫复合物。 如PAP复合物 （PeroxidaseAntiPeroxida seComplex），PAP复合物 属非标记性，保护了酶的活 性，比免疫荧光法敏感上千 倍。
多抗，可根据不同染色要求而选用 4、识别系统的组成比较恒定，识别功能由特异的第一抗完成
显示系统
1、也是显色系统。抗体抗原的结合是肉眼看不见的，显示系 统的目的就是使这种看不见的反应变为看得见，从而确定抗 原的存在及其定位
2、 显色系统由酶、底物加上显色剂组成，最终可在标记位点 形成有色分子的终末产物，若显色剂为DAB，则出现棕褐色 细颗粒沉淀 E(酶)+S(底物) → E·S(酶底物复合物) → P(反应产物) + E(酶) E(酶)可循环使用
二、免疫过氧化物酶染色技 术的基本原理
免疫过氧化酶染色技术的 基本原理
显色系统：三抗、酶、底物 联结系统：二抗 识别系统：一抗、组织抗原
识别系统
1、特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。特异性抗体具有 识别并结合靶抗原的功能，这是本技术的理论依据所在
2、特异性抗体品种繁多，应根据待检测抗原的要求选用 3、特异性抗体有的属单抗，有的属多抗，有的既有单抗又有
其目的都是设法提高免疫组化染色的敏感性
联结系统
1、联结或桥联抗体（一般为第二抗体） 2、按免疫学要求将识别系统与显色系统联结成为统一体 3、应采用何种联结抗体决定于特异性第一抗体是多克隆还是
免疫球蛋白的化学结构
❖Fc(Fragment crystalline)是免疫球 蛋白的羧基端，意为结晶片段，因 其纯化时呈结晶状态而名之，该片 段与抗原特异性有关
❖ Fab(Fragment antigenbingding)该 端是抗体与抗原特异性结合的部位， 每分子Ig能结合2个抗原分子
多克隆抗体与单多克隆抗体及其产生
免疫组织化学技术 的原理及方法
目录
一. 基本知识 二. 基本原理 三. 方法 四. 结果的判断及异识
一、免疫组化技术的基本知识
❖ 免疫组化的基本概念
免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原 抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理， 通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、 酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细 胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、 定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术 (immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术 (immunocytochemistry)。
一、免疫组化技术的基本知识
抗体 与抗原能特异性结合—生物学结合是免疫球蛋白Ig
抗原 两个主要属性：免疫原性及特异反应性，蛋白质具 有抗原性
免疫球蛋白的化学结构
❖ 免疫球蛋白根据重链结构命名IgG(γ),IgA(α)， IgD(δ),IgE(ε), IgM(μ)
❖ 五种免疫球蛋白只有两种类型的轻链，即： Kappa(κ)和Lambda(λ) 每个抗体分子的轻链必须相同；某一单独的抗 体分子决不可能既有κ链又有λ链。这一点在免 疫组化的淋巴瘤诊断中十分重要。
抗原的制备：
❖ 传统用蛋白提纯
❖ 近来可应用分子生物学技术：已知抗原 的基因结构，用其合成多肽，作为抗原， 如ER、PR抗原的制备
❖ 现有兔的单抗
多克隆抗体的选用
1、单克隆抗体的制备比多克隆抗体复杂， 价格更贵；在应用中不一定比多克隆抗 体好。
2、单克隆抗体的特异性强，多克隆抗体 则敏感性高，如何选用完全决定于使用 的目的性。
❖ 常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目录 上常以 RaH（Rabbit against Human）表之。
❖ 多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一抗多克隆 抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用至关重要。
多克隆抗体与单多克隆抗体及其产生
❖ 单克隆抗体的产生 应用细胞融合的杂交瘤（Hybridization），以针对 单一抗原决定簇的小鼠与小鼠骨髓瘤细胞（肿瘤性 B细胞）融合形成杂交瘤，其特点是既能产生特异 性抗体，又能在体外无限地增殖。将瘤细胞在体外 培养或注入小鼠腹腔内而获单克隆抗体，由此产生 的小鼠抗人（抗原）的抗体常以MaH表示，现在亦 有兔的单克隆抗体。