PCR-RFLP基因分型方法 PPT课件
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DNA分型技术ppt课件
影响因素
1. 限制性内切酶
一般双酶切 由一个高频内切酶和一个低频内切酶组成 一般高（G+C）摩尔分数的基因组选择识别位 点富含（G+C）的内切酶组合；低（G+C）摩尔 分数的基因组选择识别位点富含AT的内切酶组合 酶切反应对模板质量要求很高 酶切时间1 ～3h DNA含量一般0.5μg左右，DNA含量不应太高
RFLP操作流程图
基 本 方 法
聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术
PCR-RFLP
结合PCR技术与RFLP技术的优点 其基本原理是对目的基因片段 PCR 扩增后，利用 多种限制性内切酶，对扩增产物进行酶切，不同基 因序列，不同限制性内切酶酶切扩增产物，在电泳 后可产生不同电泳图谱，通过对电泳图谱的分析， 得出基因多态性结果。
G AATCC CCTAA G
T TAA AAT T
ACA G AATCCA CCTAA GT
Step 4: Selective PCR
AT TAA TAAT T CAT
G AATCCACA CCTAA GTGT
GTAT TAA CATAAT T
基因组DNA提取
基本程序
酶切与接头连接
PCR扩增
电泳分析
5. 对显示出来的带谱进行分析。
RFLP与PCR-RFLP的应用
Company name
扩增片段长度多态性分析技术
Amplified fragment length polymorphism，AFLP
结合限制性酶切消化的可靠性和严格的 PCR退火条件，有高度特异性 既 克服 了 RFLP 技术中 Southern 杂交 繁琐 和耗时 的缺点，又解决了 RAPD等技术中 非特异PCR扩增引起的可信度问题
pcr ppt课件教程
引物二聚体
总结词
引物二聚体是指引物之间形成的二聚体，影响PCR扩增效率。
详细描述
引物二聚体的形成可能由于引物设计不当、引物浓度过高、退火温度过低等原因 导致。为解决这一问题，可以优化引物设计，降低引物浓度，适当提高退火温度 等措施。
05
PCR 实验设计
选择合适的引物
引物长度
根据基因序列选择合适的引物长度， 通常为18-30bp。
设置PCR 仪温度循环
设置变性温度
将PCR仪温度设置为95℃，进 行变性处理，使DNA双链解开
成单链。
设置退火温度
根据引物特异性，设置适当的 退火温度，使引物与单链DNA 结合。
设置延伸温度
设置适当的延伸温度，使DNA 聚合酶从引物起始合成DNA链 。
设置循环数
根据实验目的和DNA片段大小 ，设置适当的循环数，确保目
PCR PPT课件教程
目录
• PCR 简介 • PCR 原理 • PCR 实验步骤 • PCR 常见问题与解决方案 • PCR 实验设计 • PCR 数据分析
01
PCR 简介
PCR 定义
• 聚合酶链式反应（PCR）：一种在生物体外复制特定DNA的分子生物学技术，通过DNA聚合酶的作用，以一对寡核苷酸引 物定向导引下完成特定DNA的片段扩增。
在PCR中，DNA的复制是通过特定的引物和聚合酶，在特定的温度和循环次数下完 成的。
引物与模板DNA结合后，聚合酶从引物的3’端开始合成新的DNA链。
聚合酶与引物
聚合酶是生物体内负责DNA复 制的酶，具有耐高温的特性。
在PCR中，常用的聚合酶有Taq 酶和Tfl酶等。
引物是人工合成的短片段DNA ，能够与目标DNA特异性结合 ，为聚合酶提供起始点。
PCR详细讲解PPT课件
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引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
29
引物设计的基本原则
3、引物长度一般为18-30个碱基之间。
引物长度与反应的特异性和解链温度成
正相关。
过短：扩增特异性下降 过长：引物自身形成二级结构，以及引物二 聚体。
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引物设计的基本原则
4、G+C含量一般为40%-60%
引物的碱基组成也会对引物的解链温度 产生影响。
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退火温度与时间取决于引物的 碱基组成、长度和浓度。退火温度 可以通过计算推断，通常采用温度 梯度PCR的方法进行摸索。
PC1-P20 退火温度摸索
45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 M
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低温退火
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中温延伸
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• 理论：2n递增（n为循环次数）， 如果扩增30循环，目标DNA可增加 230也就是109倍。
PCR—RFLP
三、实验目的
通过此实验操作， 通过此实验操作，掌握琼脂糖凝胶电 泳技术、 泳技术、DNA的分离鉴定及基因型判 的分离鉴定及基因型判 定方法。 定方法。
实验材料、 四、实验材料、仪器和试剂
材料： 材料：DNA样品 样品 仪器：电泳液、水平凝胶电泳槽、移液器、 仪器：电泳液、水平凝胶电泳槽、移液器、 紫外透射仪、 头 紫外透射仪、Tip头 试剂
PCR反应体系 反应体系
DNA模板 模板 dNTP Taq DNA聚合酶 聚合酶 引物 Mg2+ 缓冲液
PCR反应程序 反应程序
预变性 94℃ 3~5min ℃ 35循环： 循环： 循环 30s~1min 变性 94 ℃ 退火 50~65 ℃ 30~60s 1~2min 延伸 72 ℃ 5~10min 后延伸 72 ℃
动物遗传学实验
鸡基因组的PCR-RFLP分析 实验七 鸡基因组的 分析
一、实验方法
1、鸡基因组DNA的提取 、鸡基因组 的提取 2、目的基因的PCR扩增 、目的基因的 扩增 3、内切酶消化PCR产物 、内切酶消化 产物 4、琼脂糖凝胶电泳（检测基因型） 、琼脂糖凝胶电泳（检测基因型）
鸡DNA的获取 的获取
PCR产物电泳检测结果 产物电泳检测结果
内切酶消化PCR产物 产物 内切酶消化
PCR产物 缓冲液 内切酶 产物+缓冲液 产物 缓冲液+内切酶
5‘-TCATGA-3’ 3’-AGTACT-5’
电泳检测基因（ ） 电泳检测基因（1）
A B
电泳图谱
AA BB AB
电泳检测基因（ ） 电泳检测基因（2）
六、结果分析
1. 将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于自动成像系统的平脑中观察图像； 开通紫外光 3.关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像； 关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像； 关上紫外光电源 4.根据图像结果判定不同个体基因型。 根据图像结果判定不同个体基因型。 根据图像结果判定不同个体基因型
PCR-RFLP
步骤
• • • • • ( 1) 选择目标序列 ( 2) 设计特异引物 ( 3) PCR扩增 ( 4) 酶切 ( 5) 琼脂糖电泳分离与鉴定
特点
• (1) 引物与限制性内切酶组合非常多, 增加了揭示多态性的 机会,而且操作简便,可用琼脂糖电泳分析; • (2) 在真核生物中,CAPS标记呈共显性, 即可区分纯合基因 型和杂合基因型; • (3) 所需DNA的量很少, 且对DNA的浓度要求不严格; • (4) 使用的引物较长, 扩增的结果比较稳定且避免了RFLP 分析中膜转印这一步骤, 又能保持RFLP分析的精确度; • (5) 操作简便、快捷和自动化程度高。
PCR-RFLP
分子标记
• 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的 遗传标记,是DNA水平遗传多态性的直接反映。 • 某种意义上分子标记也指DNA分子标记, 就是指能反映生 物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。它能 够直接反映基因组DNA间的差异。
原理
• PCR-RFLP是酶切扩增多态性序列标记技术, 又称为 CAPS, 主要是对PCR扩增的DNA片段进行限制性酶切分 析。它是根据EST或已发表的基因序列等设计特异引物, 将特异PCR与限制性酶切相结合而检测多态性的一种技术。 • 基本原理是利用己知位点的DNA序列资源设计出一套特异 性的PCR引物( 19~27bp) , 然后用这些引物扩增该位点上 的某一DNA片段,接着用专一性的限制性内切酶切割所得 扩增产物,凝胶电泳分离酶切片SCP的比较
应用
• 植物基因分型、定位、克隆、分子鉴定和动物的遗传多样 性、品种鉴定以及微生物的连锁图谱和品种鉴定等方面。
小概念
• DNA的多态性(不同个体间基因组的核苷酸序列存在的差 异性)可影响限制酶的切割位点，造成限制性片段长度多 态性，即用同一种限制酶消化不同个体的DNA时，会得到 长度各不相同的限制性片段类型。不同个体基因组在同一 段DNA是否有同样的酶切位点，决定了酶切后是否产生同 样大小的片段。当碱基组成的变化改变了限制酶的识别位 点时，就会得到不同的限制性片段类型，这样的位点称为 多态性位点。
PCR的原理与应用课件
加上EcoRI接头，磷酸化，cDNA分级
cDNA合成完毕，准备连接
第一链合成
cDNA合成过程示意图
.
*
cDNA序列的克隆
.
*
（二）PCR的种类 2.Nested PCR: 巢式PCR 原理: 利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 优点: 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。 应用: 一般应用于动物方面。如: 病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
•高灵敏度
•适用于在单个样品中检测几个mRNA
•适用于大量样品分析
一步法和两步法RT-PCR的比较
.
*
EcoRI
寡聚(dT)随机6碱基引物R
寡聚(dT)
随机6碱基引物R
mRNA
(A)n (T)
(A)n
(A)n (T)
R
R
R
R
R
R
第二链合成
(A)n (T)
(A)n
R
R
R
R
R
R
(A)n (T)
EcoRI
很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖, Mullis是其中之一
.
*
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链, 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶, 面对面地合成着DNA, ……
.
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cDNA合成完毕，准备连接
第一链合成
cDNA合成过程示意图
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cDNA序列的克隆
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（二）PCR的种类 2.Nested PCR: 巢式PCR 原理: 利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 优点: 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。 应用: 一般应用于动物方面。如: 病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
•高灵敏度
•适用于在单个样品中检测几个mRNA
•适用于大量样品分析
一步法和两步法RT-PCR的比较
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EcoRI
寡聚(dT)随机6碱基引物R
寡聚(dT)
随机6碱基引物R
mRNA
(A)n (T)
(A)n
(A)n (T)
R
R
R
R
R
R
第二链合成
(A)n (T)
(A)n
R
R
R
R
R
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(A)n (T)
EcoRI
很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖, Mullis是其中之一
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Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链, 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶, 面对面地合成着DNA, ……
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等位基因特异性PCR原理和应用 ppt课件
• 阳性对照（弱阳性对照） FAM通道Ct值≤32，VIC通道Ct值<38， 但可能会由于不同仪器的不同阈值设 置而发生波动。
验证PCR有效性
PPT课件
Hale Waihona Puke 19样品的外控和内控
• 待测样品的外控（8号管FAM信号曲线）应有FAM信号 以友芝友试剂盒为例：FAM通道23≤Ct值≤30；
Ct<23：DNA加 入过量
优点
缺点
灵敏度高（0.1-1%） 操作简便 周期短 不产生PCR产物污染 适用样本类型多（如FFPE） 精确突变类型
方法建立需时较长 仅能检测已知突变
适用于临床检验
PPT课件
12
测序法与等位基因特异性PCR法比较
敏感度 FFPE标本成功率
商用试剂盒 流程与速度 数据分析要求
试剂成本 仪器成本
Sanger测序法 10-20% 低 无 1-2天 高 低 高
System-PCR，ARMS-PCR）
PPT课件
PCR扩增过程中，引物从 3’末端开始延伸，要求3’端
碱基与模板完全配对
6
等位基因特异性PCR基本原理
Two Allele-Specific (AS) primers, one for each allele of a SNP are designed. The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3' end. Two sets of primers, either forward or reverse primers can be designed. If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction, the reaction is called allele-specific PCR (AS-PCR).
验证PCR有效性
PPT课件
Hale Waihona Puke 19样品的外控和内控
• 待测样品的外控（8号管FAM信号曲线）应有FAM信号 以友芝友试剂盒为例：FAM通道23≤Ct值≤30；
Ct<23：DNA加 入过量
优点
缺点
灵敏度高（0.1-1%） 操作简便 周期短 不产生PCR产物污染 适用样本类型多（如FFPE） 精确突变类型
方法建立需时较长 仅能检测已知突变
适用于临床检验
PPT课件
12
测序法与等位基因特异性PCR法比较
敏感度 FFPE标本成功率
商用试剂盒 流程与速度 数据分析要求
试剂成本 仪器成本
Sanger测序法 10-20% 低 无 1-2天 高 低 高
System-PCR，ARMS-PCR）
PPT课件
PCR扩增过程中，引物从 3’末端开始延伸，要求3’端
碱基与模板完全配对
6
等位基因特异性PCR基本原理
Two Allele-Specific (AS) primers, one for each allele of a SNP are designed. The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3' end. Two sets of primers, either forward or reverse primers can be designed. If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction, the reaction is called allele-specific PCR (AS-PCR).
RFLP-ppt精讲
01 2)变异更稳定。其表现不受环境条件的影响, 其他变异均是从表型或基因作用产物来研究 遗传和变异的 , 而 RFLP 则是直接研究基因的 构成
02
03
比生化标记更丰富,区分能力更强。
其标记为共显性 , 能区分纯合显性和杂 合显性,而且非等位基因间无互作。
04
2 基本实验程序和主要影响因素
01
DNA的提 取
14cm左右停止。
基本实验程序
04
转移
DNA支持膜现在均采用带正电荷的尼龙膜。将经酸碱
处理的琼脂糖凝胶放在玻璃板上 , 上面铺上尼龙膜,
其上压约10cm 的吸水纸,用磷酸转移液, 转移24h后, 取出尼龙膜,在94℃烘烤2h以固定DNA。
放射自显影 标记探针,每泳道探针DNA用量为5ng。分子杂交,探针与尼龙膜 保温在65℃ ,缓慢转动16～18h。洗膜压片,取出杂交膜,用SSC、SDS洗去 末杂交上的探针, 直到杂交膜上的放射性到100～200counts /min为止。 用保鲜膜将尼龙膜包好, 压上X光片, 在- 70℃下放射自显影5～ 15d 。洗 片、显影结束后取出,定影、凉干保存。
2 RFLP用于作物育种研究
一副高度饱和的 RFLP 连锁图 , 为基因选择、回交育种、预 测杂种优势以及基因克隆等方面提供了诸多方便。利用与 目标基因连锁的 RFLP 标记进行间接选择 , 就能克服传统育 种方法进行基因选择和回交育种中所遇到的种种困难和麻 烦。因为知道目的基因与 RFLP 标记连锁 , 这使我们相信在 选择 RFLP 的同时 , 也选择了目的基因 , 因为使二者分开的 重组机率太小。另一方面 , 连锁的 RFLP 标记能在植株苗期 进行测定记录 , 因为只需提取少量 DNA, 故不必毁坏整个植 株。不带目的基因的植株能在早期被剔除 , 节省了空间和 费用。
同种免疫性血小板减少症诊断新方法pptPowerPoictfp
新一代血小板抗体测定？
致谢
1、 Justus Liebig University 和临床免疫输注医学研究所 （Giessen, 德国） Ines Socher ， Cornelia Andrei-Selmer ，Tamam Bakchoul，Ulrich Sachs，Hartmut Kroll 2、剑桥大学和国家健康服务血液移植（英国）PrachiStafford， Cedric Ghevaert ，Willem Ouwehand3、血液研究所 ，（密尔沃， 基威斯康星， 美国） Peter Newman，Brian Boylan
人类血小板抗体的分析
动物模型？ 抗体介导的血小板清除和相关 抑制因子的测定
以NOD/SCID 鼠作为
模型进行人类血小板抗体的研究
在NOD/SCID 鼠体内循环期间人类血小板存活的动力学
FNAIT
的病理机制
问题
我们如何改进同种免疫性血小板减少症的诊断呢？
以稳定的细胞系为来源的DNA产品和血小板同种抗原
基因分型，来自于人类血小板同种抗原的表型的献血者的Ｂ淋巴细胞系抗体鉴定，转染的CHO细胞稳定表达的人类血小板同种抗原
以Ｂ淋巴细胞系作为来源获得标准DNA
人类血小板同种抗原基因分型的
Ｂ淋巴细胞系
ISTH/ISBT血小板基因型鉴定实验室
抗HPA-1a 水平和NAIT严重程度
之间的关系
9、静夜四无邻，荒居旧业贫。。10、雨中黄叶树，灯下白头人。。11、以我独沈久，愧君相见频。。12、故人江海别，几度隔山川。。13、乍见翻疑梦，相悲各问年。。14、他乡生白发，旧国见青山。。15、比不了得就不比，得不到的就不要。。。16、行动出成果，工作出财富。。17、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。。9、没有失败，只有暂时停止成功！。10、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。。11、成功就是日复一日那一点点小小努力的积累。。12、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美。。13、不知香积寺，数里入云峰。。14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。15、楚塞三湘接，荆门九派通。。。16、少年十五二十时，步行夺得胡马骑。。17、空山新雨后，天气晚来秋。。9、杨柳散和风，青山澹吾虑。。10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。11、越是没有本领的就越加自命不凡。12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。。16、业余生活要有意义，不要越轨。17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。
PCR详细讲解 ppt课件
2
PCR的基本原理
① DNA半保留复制的机理；
② 体外DNA分子于不同温度下可变 性和复性的性质。
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
3
PCR扩增体系
➢模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA，也可
以是细菌、组织样品等。
➢引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性；确定
1、避免重复碱基，尤其是G。
2、引物退火温度在58-60℃之间。
3、G+C为30-80%。
4、3’端最后5个碱基内不能有多于2个
的G或C。
5、引物的产物大小一般在80-250bp之
间；80-150 bp最为合适（可以延长至
300 bp）。 2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
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Real-Time PCR引物设计原则
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
35
引物设计的基本原则
9、引物的3’端不可以A结尾。
引物3’端错配时，不同碱基引发效率存 在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即 使在错配的情况下，也能有引发链的合成， 而当末位链为T时，错配的引发效率大大降 低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所 以3’端最好选择T。
引物设计的最重要的原则：最大限度 地提高扩增效率和特异性；同时尽可 能减少非特异性扩增。
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
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引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
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引物设计的基本原则
PCR详细讲解PPT课件
对于20bp左右的引物：
2021/3/7
Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）
一般情况下，PCR的最佳退火温度比引
物Tm值低5℃左右。
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32
引物设计的基本原则
6、引物中四种碱基最好是随机分布的
避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。 特别是引物的3’端不应有连续3个G或C，否 则会使引物在G+C富集序列区域产生错配， 降低扩增的特异性。
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Oligo
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Primer BLAST
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常见问题
2.为什么出现多条非特异性条带？
①反应体系被污染。 ②引物特异性差。 ③退火温度不合适。
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常见问题
3.为什么PCR产物很少？
①聚合酶活性过低。 ②循环次数偏低。 ③模板DNA浓度过低。
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常见问题
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引物设计常用软件
Primer Premier 5.0 Oligo 6 Primer 3（在线） Primer-BLAST（在线）
HLA基因分型方法：RFLP法
1）常规制备DNA盐析法1．用淋巴细胞分离液从抗凝血中分离出白细胞。
2．每3ml细胞悬液加10ml红细胞裂解液溶解红细胞两次，再加2ml白细胞裂解液溶解白细胞。
3．加50μl 10％SDS和70μl蛋白酶K消化蛋白质，37℃过夜或55℃3h。
4．加0.25体积饱和醋酸钠溶液，剧烈摇动15s。
5．2000r/min离心15min，收集上清。
6．加入2.5倍预冷无水乙醇沉淀DNA，－20℃过夜。
7．吸取DNA团块用70％乙醇洗3次，每次10 000r/min，10min。
再溶于适量TE缓冲液中，4℃保存。
酚抽提法1．采集EDTA抗凝血0.5ml，加双蒸水2.5ml，溶解红细胞。
2．离心10 000r/min，5min，弃上清。
3．加0.5ml生理盐水，混匀，离心10 000r/min，5min，弃上清。
4．加500μl TES，混匀，再加20％SDS 25μl，蛋白酶K 4μl置55℃水浴4h或37℃水浴过夜。
5．加等体积饱和酚，混匀，离心10 000r/min，5min，吸取上层水相，再加等体积饱和酚抽提一次。
6．加等体积氯仿：异戊醇再抽提一次。
7．吸取上层液，加1/10体积醋酸钠，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃过夜，沉淀DNA。
8．吸出DNA团块，用预冷70％乙醇洗1次，弃尽液体，真空抽干DNA，加适量TE溶解。
4℃保存。
2）限制性内切酶消化在无菌EP管中依次加入双蒸去离子水7μl，10×缓冲液2μl，限制性内切酶1μl，DNA 10μl。
反应体系含1×缓冲液、DNA 5μg、酶10U。
稍离心以混匀，37℃水浴1～1.5h。
酶解结束后向反应管中加1/10体积的终止液终止反应，冷却至4℃，准备电泳。
3）琼脂糖凝胶电泳1．配制1％琼脂糖凝胶板：取0.4g琼脂糖加40ml TBE，微波炉熔化，加少量双蒸水补充蒸发的水分，将其冷却至60℃，倒入凝胶槽内，充分凝固后拔出样品梳。
2．从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入1×TBE，使其液面略高于琼脂糖板。
3 PCR-PFLP
定基因的多态性。 包括：靶基因PCR扩增、限制性酶切图谱分析。 图谱： M A B C D E F
DNA 或RNA 序列突变或重排
酶切位点增加，减少或消失 限制性酶切片段长度发生改变 不同的电泳图谱
4、PCR-RFLP分析应用举例
实验目的：探讨CRP(C-反应蛋白）的基因型与冠心病发病的关系 实验方法：不同人的CRP基因的PCR 产物（744bp)经MaeIII酶切 实验结果：酶切后分为如下3种类型： CC型 GC GG型 型
实验三、PCR-RFLP分析
实验内容： 1、基因组DNA提取
（已完成）
2、以基因组DNA为模板PCR扩增特定基因
（GAPDH基因的PCR，已完成）
3、用内切酶对PCR产物进行消化 4、酶切产物的琼脂糖凝胶电泳和结果分析
实验内容：
第一部分、Restriction enzymes
第二部分、 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳
第三部分、PCR-RFLP原理
第四部分、琼脂糖凝胶电泳的结果分析
PCR产物的酶切消化
• 用限制性核酸内切酶将DNA 消化
• Hind III 限制性酶切位点是A AGCTT
1、PCR产物 2、10×Buffer M
17μl 2μl
3、HindⅢ
总体积
1μl
20μl
混匀 ，37℃ 保温 40min
第一部分、Restriction enzymes
2. Types of Restriction endonuclease
Functions Conditions Recognition sequences Type I Endonuclease & methylase ATP, Mg2+ EcoK: AACN6GTGC EcoB: TGAN8TGCT At least 1000bp away Type II Endonuclease Mg2+ Palindromic (回文序列） Type III Endonuclease ATP, Mg2+ EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 24-26 bp away
DNA 或RNA 序列突变或重排
酶切位点增加，减少或消失 限制性酶切片段长度发生改变 不同的电泳图谱
4、PCR-RFLP分析应用举例
实验目的：探讨CRP(C-反应蛋白）的基因型与冠心病发病的关系 实验方法：不同人的CRP基因的PCR 产物（744bp)经MaeIII酶切 实验结果：酶切后分为如下3种类型： CC型 GC GG型 型
实验三、PCR-RFLP分析
实验内容： 1、基因组DNA提取
（已完成）
2、以基因组DNA为模板PCR扩增特定基因
（GAPDH基因的PCR，已完成）
3、用内切酶对PCR产物进行消化 4、酶切产物的琼脂糖凝胶电泳和结果分析
实验内容：
第一部分、Restriction enzymes
第二部分、 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳
第三部分、PCR-RFLP原理
第四部分、琼脂糖凝胶电泳的结果分析
PCR产物的酶切消化
• 用限制性核酸内切酶将DNA 消化
• Hind III 限制性酶切位点是A AGCTT
1、PCR产物 2、10×Buffer M
17μl 2μl
3、HindⅢ
总体积
1μl
20μl
混匀 ，37℃ 保温 40min
第一部分、Restriction enzymes
2. Types of Restriction endonuclease
Functions Conditions Recognition sequences Type I Endonuclease & methylase ATP, Mg2+ EcoK: AACN6GTGC EcoB: TGAN8TGCT At least 1000bp away Type II Endonuclease Mg2+ Palindromic (回文序列） Type III Endonuclease ATP, Mg2+ EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 24-26 bp away
PCR-技术及应用PPT课件
dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系，一般将其PH调节到7.0～7.5， 小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP 降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L， 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏 低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物 的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓 度降低。
PCR反应的特点
②灵敏度高：过去酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射 免疫分析（RIA）其灵敏度分别为ng和pg级，而PCR检 测灵敏度可达fg级，理论上可检出一个细菌或一个真 核细胞的单拷贝基因的存在；
PCR反应的特点
③简便快速：操作试剂盒时只需将样品简单处理和加 样后即可进行扩增，许多PCR检查项目在两小时左右即 可出报告；④对样品要求低：几乎所有的临床标本都 可用于PCR扩增。
PCR条件的选择
引物：PCR反应成功扩增的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物，所 选择的引物序列决定了PCR产物的大小、位置、扩增区域的Tm值等。
引物设计的长度一般为15-30个碱基，引物长点，反应的特异性相对好， 引物太长，扩增退火时被引发的模板数相对越少，影响反应效率。引 物短点，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板 的速率越大，引物太短，则反应的特异性受到影响。
PCR技术的用途
科研使用 临床医学 法医学 农业 考古学 人类学 环境保护
个体识别与亲子鉴定 GMO
PCR应用类型
一、不对称PCR(asymmetric PCR)
不 对 称 PCR 的 目 的 是 扩 增 产 生 特 异 长 度 的 单 链 DNA。PCR反应中采用二种不同浓度的引物，PCR结 果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用的二种引物 浓度不同一步法，因此称不对称PCR，此法产生的单 链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。
PCR技术的应用ppt课件
PCR技术的应用
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1、PCR技术在分子生物学中 的应用
.
一：基因克隆
基因的克隆和分离是分子生物学和细胞生 物学研究中必不可少的手段。运用PCR技 术进行基因克隆和亚克隆比传统的方法具有 更大的优点。由于PCR可以对单拷贝的基 因放大上百万倍，产生微克(pg)级的特异 DNA片段，从而可省略从基因组DNA中克 隆某一特定基因片段所需要的DNA的酶切 步骤。
.
二：重组PCR
在分子生物学研究中常常需要将两个不同的 基因融合在一起。通过PCR反应可以比较容 易地实现这一目的。
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三：DNA序列的测定
目前广泛采用的DNA测序方法有化学法和双脱氧 法两种，它们对模板的需要量比较大。传统的模 板制备方法是将含目的基因的DNA片段进行酶切 ，建立基因库，筛选克，并亚克隆到M13噬菌体 载体上，经噬菌体产生单链DNA。这是一项比较 复杂的工作。利用PCR方法可以比较容易地测定 位于两个引物之间的序列。
●
由于PCR技术具有高特异性、高灵敏度、
操作快速、简便、对样本要求低等特点，加之它
能与多种分子生物学技术配合使用，PCR技术日
益成为遗传病诊断、发病机理的研究等方面最有
效、最可靠的方法之一。PCR技术的出现为快速
、准确地检测人类遗传病开辟了新途径
●
.
5、PCR在骨髓移植HLA-D位点配型中的应用
● HLA—DRp位点配型方法，即PCR指纹图，该技术是的 DNA经PCR扩增HLA—DR卢区基因的高度多态区域，在 分别扩增后将供、受者产物混合，混合后进行2个PCR循 环，扩增产物经12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，照相后分析 不同个体的指纹图型。当HLA-DRfl基因相合时，其基因 产物在聚丙烯酰胺凝胶中可产生一致的带型，这种多条带 型的产生是由于各种HLA单倍体中的HLA-DRfl基因的不 同亚型以及假基因上的多态性所致。当PCR最后两个匹配 循环退火时，这些基因的单链DNA复性，DRfl基因相同 的个体形成同型双链，而不同的DRfl基因之间的不同序列 形成异型双链，因此，混合匹配可进一步证实HLA—DRfl 是否相合。
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1、PCR技术在分子生物学中 的应用
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一：基因克隆
基因的克隆和分离是分子生物学和细胞生 物学研究中必不可少的手段。运用PCR技 术进行基因克隆和亚克隆比传统的方法具有 更大的优点。由于PCR可以对单拷贝的基 因放大上百万倍，产生微克(pg)级的特异 DNA片段，从而可省略从基因组DNA中克 隆某一特定基因片段所需要的DNA的酶切 步骤。
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二：重组PCR
在分子生物学研究中常常需要将两个不同的 基因融合在一起。通过PCR反应可以比较容 易地实现这一目的。
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三：DNA序列的测定
目前广泛采用的DNA测序方法有化学法和双脱氧 法两种，它们对模板的需要量比较大。传统的模 板制备方法是将含目的基因的DNA片段进行酶切 ，建立基因库，筛选克，并亚克隆到M13噬菌体 载体上，经噬菌体产生单链DNA。这是一项比较 复杂的工作。利用PCR方法可以比较容易地测定 位于两个引物之间的序列。
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由于PCR技术具有高特异性、高灵敏度、
操作快速、简便、对样本要求低等特点，加之它
能与多种分子生物学技术配合使用，PCR技术日
益成为遗传病诊断、发病机理的研究等方面最有
效、最可靠的方法之一。PCR技术的出现为快速
、准确地检测人类遗传病开辟了新途径
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5、PCR在骨髓移植HLA-D位点配型中的应用
● HLA—DRp位点配型方法，即PCR指纹图，该技术是的 DNA经PCR扩增HLA—DR卢区基因的高度多态区域，在 分别扩增后将供、受者产物混合，混合后进行2个PCR循 环，扩增产物经12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，照相后分析 不同个体的指纹图型。当HLA-DRfl基因相合时，其基因 产物在聚丙烯酰胺凝胶中可产生一致的带型，这种多条带 型的产生是由于各种HLA单倍体中的HLA-DRfl基因的不 同亚型以及假基因上的多态性所致。当PCR最后两个匹配 循环退火时，这些基因的单链DNA复性，DRfl基因相同 的个体形成同型双链，而不同的DRfl基因之间的不同序列 形成异型双链，因此，混合匹配可进一步证实HLA—DRfl 是否相合。
PCR-RFLP方法鉴定ABO血型基因型
Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2020, 10(2), 13-18Published Online April 2020 in Hans. /journal/hjbmhttps:///10.12677/hjbm.2020.102003ABO Genotypes Were Identified byPCR-RFLP MethodChenhang Wang, Yujia Kang, Jinlei Shi*School of Life Science and Technology, Shanghai Tech University, ShanghaiReceived: Mar. 29th, 2020; accepted: Apr. 13th, 2020; published: Apr. 20th, 2020AbstractThe substitution of several bases in ABO gene and the deletion of single base lead to the produc-tion of A, B and O alleles, which can make the erythrocyte membrane surface with different anti-gens, and thus form four blood type phenotypes. According to the differences of the key loci of the three alleles, the PCR-RFLP method was used to amplify the DNA fragments and perform specific enzyme digestion. The genotype could be preliminarily determined based on the enzyme diges-tion results, and then the enzyme digestion results are verified by sequencing method. In this study, ABO genotypes were identified for the first author and another student, and the results showed that the PCR-RFLP results were consistent with the sequencing results.KeywordsPCR-RFLP, ABO GenetypesPCR-RFLP方法鉴定ABO血型基因型王晨航，康宇佳，石金磊*上海科技大学，生命科学与技术学院，上海收稿日期：2020年3月29日；录用日期：2020年4月13日；发布日期：2020年4月20日摘要ABO基因中几个碱基的替换、单碱基缺失导致A、B、O三种等位基因的产生，可使红细胞膜表面带有不同抗原，进而形成四种血型表型。