实验三预习报告 硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定

实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定

一、硝酸还原酶的测定

[原理]：

硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。

生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。

[试剂]

1．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液；2．0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O

2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml；

3．1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）；

4．0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中；

5．0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中；

6．0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中；

7．30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。水溶后定容至100ml。

[方法]；

摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。

2.样品中硝酸还原酶活力测定

1.在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。

2.称取作物叶片0.5g（共3份，剪成1cm 左右的小段（均匀），放入3只三角瓶中，其中

1份作对照，另外2份作酶活性测定用。

3.反应：先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml

0.1mol/L KNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气30分钟（期间几次通入空气，再

抽真空，使叶片完全沉入瓶底，后在25℃黑暗中反应0.5小时，分别向测定瓶（对照瓶除外）加入1ml30%三氯乙酸终止酶反应。

4. 比色测定：将各瓶摇匀静置2min 后，各取2ml 反应液，加入1ml 磺胺，摇匀后再加入

1ml 萘基乙烯胺，再在35℃水浴中显色15min ，后比色，540nm

5. 空白溶液：2ml 蒸馏水+1ml 磺胺+1ml α-萘胺。同样和样液一样进行水浴15min 。

结果计算 单位鲜重样品中硝酸还原酶活性t

W x

v v ⨯⨯=1

2

[μg/ (g .h)] 式中：为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量，μg ；V 1为提取酶时加入的缓冲液体积，ml ；V 2为酶反应时加人的粗酶液体积，ml ；W 为样品鲜重，g ；t 为反应时间，h 。

二、谷氨酰胺合成酶的活性的测定

【原理】

谷氨酰胺合成酶（GS ）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和Mg 2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol ·mg ﹣1protein ·h ﹣1。也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1。

【仪器与用具】

冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml 、1ml ）。

【试剂】

提取缓冲液：

0.05mol/L Tris-HCl ，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+，2mmol/L DTT ，0.4mol/L 蔗糖。称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.5295g ，0.1245g MgSO 4·7H 2O ，0.1543g DTT （二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml ；

反应混合液A （0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：

内含80mmol/L Mg 2+，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2mmol/L EGTA ，称取3.0590g Tris ，4.9795 gMgSO 4·7H 2O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA ，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml ；

反应混合液B （含盐酸羟胺，pH7.4）：

反应混合液A 的成分再加入80mol/L 盐酸羟胺，pH7.4；

显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3和0.6mol/L HCl 混合液）：

3.3176g TCA （三氯乙酸），10.1021g FeCl 3·6H 2O ，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml ；

40mmol/L ATP 溶液：0.1210g ATP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。

【方法】

1.粗酶液提取 称取植物材料1g 于研钵中，加3ml 提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g 离心20min ，上清液即为粗酶液。