实验三预习报告 硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定
谷氨酰胺合成酶活性的测定
谷氨酰胺合成酶活性的测定谷氨酰胺合成酶活性的测定一．试剂（1）酶提取缓冲液（0.05mol/L Tris- HCl，pH 8.0；内含2mmol/L Mg2+、2mmol/L DTT、0.4mol/L蔗糖）称取Tris[三（羟甲基）氨基甲烷]1.5295 g，MgSO4·7H2O 0.1245g，DTT（二硫苏糖醇）0.1543 g和蔗糖34.23 g，去离子水溶解后，用0.5~1.0 mol/L HCl调至pH 8.0，最后定容至250 mL。
（2）酶反应液1.对照反应液A（0.1mol/L Tris- HCl缓冲液，pH 7.4；内含80mmol/L Mg2+、20mmol/L谷氨酸钠盐、20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EDTA-Na2）称取1.2236 g Tris、1.9918 g MgSO4·7H2O、0.3451 g谷氨酸钠盐、0.2422 g半胱氨酸、0.0744 g EDTA-Na2，分别用去离子水浴解后，用0.5~1.0mol/L HCl调至pH 7.4，定容至100mL。
2.完全反应液B（含盐酸羟胺、pH 7.4的0.1mol/L Tris- HCl缓冲液）除了反应混合液A的成分外，再添加80mmol/L盐酸羟胺（每100 mL 中含0.5560 g盐酸羟胺）。
（3）显色剂（0.2mol/L TCA、0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）称取3.3176 g TCA（三氯乙酸）和10.1021 g FeCl3·6H20，用去离子水溶解后，加5mL浓盐酸，定容至100mL。
（4）40mmol/L ATP溶液称取0.2420 g ATP溶于10 mL去离子水中（临用前配制）。
二．实验步骤（1）粗酶液的提取取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加5mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,12000g离心20min,上清液即为粗酶提取液（2）GS活性的测定取1.0mL完全反应液B于10mL离心管中，加入0.5mL粗酶液和0.5mL ATP溶液，混匀，于37℃下保温0.5 h，加入1mL显色剂终止反应，摇匀，室温下放置5min后，于3500r/min下离心10min，取上清液于540nm下测定吸光度，以加入1.0mL对照反应液A的为对照。
硝酸还原酶活性测定实验报告
硝酸还原酶活性测定实验报告硝酸还原酶活性测定实验报告引言：硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内负责将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
硝酸还原酶活性的测定对于研究生物体对硝酸盐的代谢和环境污染物的检测具有重要意义。
本实验旨在探究硝酸还原酶的活性测定方法，并通过实验验证其可行性和准确性。
材料与方法：1. 实验材料：- 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 mol/L 硝酸钠溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵溶液- 1% 硫胺素溶液- 10% 硝酸盐还原酶提取液- 10% 硝酸盐还原酶抑制剂- 2% 硝酸盐还原酶底物溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵铵铁硫氰化物溶液- 0.1 mol/L 醋酸溶液- 蒸馏水2. 实验仪器：- 分光光度计- 定量移液器- 离心机- 恒温水浴槽- 试管架- 显微镜实验步骤：1. 提取硝酸盐还原酶：a. 取一定量的样品（如细胞或组织），加入磷酸盐缓冲液，用搅拌器充分破碎。
b. 将破碎后的样品转移至离心管中，以12000 rpm离心10分钟。
c. 取上清液，即为硝酸盐还原酶提取液。
2. 硝酸还原酶活性测定：a. 准备一组空白对照组，加入相同体积的磷酸盐缓冲液代替硝酸盐还原酶提取液。
b. 准备一组实验组，加入一定体积的硝酸盐还原酶提取液。
c. 分别加入一定体积的硝酸钠溶液、硫酸铵溶液、硫胺素溶液和硝酸盐还原酶底物溶液。
d. 在恒温水浴槽中，将反应体系恒温30分钟。
e. 加入硝酸盐还原酶抑制剂停止反应。
f. 加入硫酸铵铵铁硫氰化物溶液，使反应产生红色沉淀。
g. 加入醋酸溶液，混匀后离心10分钟。
h. 取上清液，以分光光度计测定其吸光度。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了一组吸光度数据。
根据吸光度与硝酸还原酶活性之间的关系，我们可以计算出样品中硝酸还原酶的活性。
在本实验中，我们采用了硫酸铵铵铁硫氰化物法测定硝酸还原酶活性。
该方法利用硝酸还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐，再与硫酸铵铵铁硫氰化物反应生成红色沉淀。
实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定
实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定一、硝酸还原酶的测定[原理]:硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(或对-氨基苯磺酰胺)及α-萘胺(或萘基乙烯胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以每克鲜重含氮量表示，即以-1-1ug.g.h为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
[试剂]1(亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO0.9857g溶于去离子水后定容至1 2-1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml的标准液; 2(0.1molpH7.5的磷酸缓冲液:NaHPO.12HO30.0905g与NaHPO.2HO 2422422.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml;-13(1%(W/V)溶液:1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.LHCL中(25ml浓-1盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.LHCL);(0.02%(W/V)萘基乙烯胺溶液:0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，4贮于棕色瓶中;-1-15(0.1mol.LKNO溶液:2.5275g KNO溶于250Ml 0.1mol.LPh7.5的磷酸缓冲33液中; -16(0.025mol.LPh 8.7 的磷酸缓冲液:8.864 0g NaHPO12HO，0.0570g 24.2KHOP.3HO，溶于1 000ml去离子水中; 2427( 30%三氯乙酸溶液:30g三氯乙酸。
水溶后定容至100ml。
[方法];1. 标准曲线制作:管号 1 2 3 4 5 6 7亚硝酸钠标准液 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 试剂蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 (ml) 1%磺胺 4 4 4 4 4 4 40.02%萘基乙烯胺 4 4 4 4 4 4 4每管含亚硝态氮(ug) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。
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首都师范大学生命科学学院实验报告实验题目硝酸还原酶活性的测定一、实验原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO 使之还原为NO 。
NO -+ NADH + H +— NO 2- + NAD ++ H 2O产生的NO 可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。
因此，测定反 应液中NO 含量的增加即表明酶活性的大小。
NO 含量的测定----磺胺法NO 2-与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm 下读 取光密度值。
—、实验用品1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液 枪，tip 头(两种规格：1000卩I ，200卩I ) 三、实验步骤1. 分别配制反应液于小烧杯中(1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml(2) 0.1M 磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNQ 5ml 2. NO 2-的获得(1) 称取新鲜叶片0.5g 共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。
(2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其 中的空气，内部产生的NO 可渗透到外部溶液中。
3.将小烧杯转到30 r 温箱,使其不见光,保温20min 。
4.用5卩g/ml NaNQ 母液配制标准梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml 。
5.吸取不同浓度的NaNOmI 于试管中，加入磺胺试剂2ml 及a -萘胺试剂2ml ，混 合均匀，在60r 水浴中保温20min ，于比色杯中，在520nm 下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度一浓度曲线，以光密度为纵坐标， 体步骤及结果如下表和下图所示。
课程名称植物生理实验 实验时间2010331成绩姓名唐倪文班级_3学号 1090800032NaNO 浓度为横坐标。
具试剂管号12 3 4 5 6 7 8 NaNO 母液(ml)0 0.02 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml ） 1 0.98 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1%磺胺(ml)22 2 2 2 2 2 2 0.2 %a -萘胺 (ml) 22 2 2 2 2 2 2 每管亚硝酸氮含 量（卩g ） 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 每管NaNO 浓度 （卩 g/ml ） 0 0.1 0.5 1.02.03.04.05.0 光密度0.0150.0520.1040.2020.3020.3960.493小麦幼苗完全培养液缺N 培养液KNOHO KNO HO 小麦鲜重（g ） 0.51 0.51 0.49 0.48 光密度0.178 0.176 0.065 0.039 亚硝酸钠浓度 （卩 g/ml ） 1.791 1.7710.6540.392亚硝态氮含量 （卩g ） 1.791 1.771 0.654 0.392 酶活性105.39104.1840.0424.505.吸取反应液各1 ml 于试管中加入磺胺和粉红色化合物.用比色法在520nm 下读取光密度值，从标准曲线上查得NO 的含量, 结果如下表。
硝酸还原酶活性的测定.
硝酸还原酶活性的测定一、原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，与作物吸收和利用N肥有关的不同品种，年龄、器官组织以及环境条件对硝酸还原活性都有影响，硝酸还原酶作用于NO3使还原为NO2NO3⎯+NADH+H→NO2⎯+NAD+H2O产生的NO2⎯可以从组织内渗到外界溶液中，并积累在溶液中因此测定反应溶液中NO2⎯的含量的增加，即表明酶活性的大小。
NO2⎯含量的测定用对氨基苯磺酸化比色法，亚硝酸对氨基苯磺酸和α-萘胺在酸性条件下生成红色化合物，颜色在2-3小时稳定，可用比色法定量，该法非常灵敏，能测定每毫升0.5微克的Na NO2。
二、仪器和药品721型分光光度计（或其他型号比色计），剪刀，真空泵（或注射器），小天平，温箱，烧杯，移液管，小烧杯（50ml）0.2MKNO3：将20、22克KNO3溶于100ml蒸馏水中。
0.1M磷酸缓冲液（PH=7.5）：将85.2%ml 1/15M磷酸氢二钠与14.8ml 1/15M磷酸二氢钾混合均匀。
1/15MNa2HPO4溶液：1000ml中含Na2HPO4•2H2O11.878克。
1/15M溶液：1000ml中含KH2PO49.078克。
对氨基苯磺酸试剂：1克对氨基苯硝酸加加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml.。
α–萘胺试剂，0.2克α–萘胺加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml。
NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO2 5微克，用时稀释之。
三、实验步骤：1、将新鲜叶片（蓖麻、向日葵、小麦、棉花等），用水冲洗净，并用吸水纸吸干，用剪刀剪成小块(注意块小为宜)，然后在小天平上称取等重的两份叶片，每份约0.5克。
分别置于含有下列溶液的小烧杯中。
（1）1M磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml（2）0.1M磷酸缓冲溶液5ml+0.2M KNO35ml然后将小烧杯置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后叶片便沉于底部（如没有真空泵，也可以20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器使之真空，如此进行抽气、放气反复多次，溶液即可渗入叶组织内取代了叶片内的空气，叶片便沉于溶液底部），取出小烧杯置于30℃温箱中，使不见光保温作用30分钟。
硝酸还原酶活性的测定实验报告
硝酸还原酶活性的测定实验报告硝酸还原酶活性的测定实验报告引言：硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内起着关键的作用。
它能够将硝酸根离子还原为亚硝酸根离子，参与到氮代谢中。
本实验旨在通过测定硝酸还原酶活性的方法，探究其在不同条件下的变化规律，从而深入了解这一酶的功能及其对生物体的重要性。
材料与方法：1. 实验材料：- 萝卜组织样品- 硝酸还原酶提取液- 硝酸还原酶底物溶液- 甲酚硫酸溶液- 氨水溶液- 高锰酸钾溶液- 氯化亚铁溶液- 硝酸铜溶液- 硫酸亚铁溶液- 硫酸铵铁溶液- 蒸馏水2. 实验方法：- 提取硝酸还原酶：将萝卜组织样品切碎并加入硝酸还原酶提取液，搅拌均匀后离心，取上清液作为硝酸还原酶提取液。
- 测定硝酸还原酶活性：将硝酸还原酶提取液与硝酸还原酶底物溶液混合，反应一段时间后，加入甲酚硫酸溶液停止反应。
然后，分别加入氨水溶液和高锰酸钾溶液，测定吸光度。
- 构建标准曲线：分别取一系列浓度的硝酸铜溶液，加入硫酸亚铁溶液和硫酸铵铁溶液，测定吸光度。
根据吸光度与浓度的关系，绘制标准曲线。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了硝酸还原酶活性的数据，并根据标准曲线计算了不同样品中硝酸还原酶的活性。
首先，我们观察到在不同温度条件下，硝酸还原酶活性的变化。
结果显示，在较低的温度下，硝酸还原酶活性较低，随着温度的升高，酶活性逐渐增加，但在一定温度范围内，酶活性会达到峰值后开始下降。
这表明硝酸还原酶对温度敏感，适宜的温度能够促进酶的活性，但过高的温度则会导致酶的变性和失活。
其次，我们研究了不同pH值对硝酸还原酶活性的影响。
结果显示，在中性pH范围内，硝酸还原酶活性较高，而在酸性或碱性条件下，酶活性明显下降。
这说明硝酸还原酶对于酸碱度有一定的适应范围，过高或过低的pH值都会影响酶的活性。
此外，我们还研究了不同浓度的底物对硝酸还原酶活性的影响。
结果显示，在一定范围内，随着底物浓度的增加，硝酸还原酶活性呈现出增加的趋势。
实验三 硝酸还原酶活性测定
3. 材料与试剂
两种处理的小麦： 两种处理的小麦：水 (ck)， KNO3（N） ， ） A液：磷酸缓冲液: 水: DNP溶液 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 液 磷酸缓冲液 溶液: 溶液 B液：磷酸缓冲液: KNO3: DNP溶液: 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 液 溶液
磷酸缓冲液(pH7.5): 0.2mol/L； KNO3溶液 0.2mol/L 溶液: 磷酸缓冲液 ； DNP (2-4-二硝基苯酚 溶液 1mmol/L； 蔗糖溶液 2.5mmol/L 二硝基苯酚)溶液 二硝基苯酚 溶液: ； 蔗糖溶液:
NO2-含量测定（磺胺比色法） 含量测定（磺胺比色法）
在酸性溶液中， 与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与α在酸性溶液中，NO2-与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与 萘胺偶联，形成紫红色的偶氮化合物。该偶氮化合物在 540nm有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（OD540）。 有最大吸收峰， 有最大吸收峰 可以用分光光度计测定（
酶反应要在暗条件下进行的原因是叶绿体在光合作用时可产生 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白， 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白，与亚硝酸还原酶同时存在时 可还原NO2- ，所以在暗条件下进行反应可阻止 所以在暗条件下进行反应可阻止NO2- 的继续反 可还原 以保证测定结果的准确。 应，以保证测定结果的准确。
处 理 A液 吸光度 [ NO2- ] NR活性 活性 B液 吸光度 [ NO2- ] NR活性 活性
（uMol/ml）（uMol/h•gfw） ） ）
（uMol/ml）（uMol/h•gfw） ） ）
H2 O KNO3 对照 [ NO2- ] （uMol/ml）= 0.0026＋0.359OD520 ） ＋ NR活性（ NO2- , uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重 ×0.5h） 活性（ 鲜重g× 活性 ） ）
硝酸还原酶(NR)活性的测定
硝酸还原酶(NR)活性的测定硝酸还原酶是一种重要的酶，参与植物的氮代谢和植物的抗逆能力等生理过程。
硝酸还原酶的活性可以反映出植物对外界环境变化的适应能力和生长发育状态。
因此，硝酸还原酶活性的测定具有重要的生物学意义。
一、实验目的本实验主要目的是通过测定植物中硝酸还原酶活性的变化，探究外界环境对硝酸还原酶活性的影响。
另外，本实验还旨在掌握硝酸还原酶活性的检测方法。
二、实验原理硝酸还原酶 (NR) 是一种能将 NO3- 还原为 NO2- 的酶。
其催化反应的速率与硝酸还原酶的活性密切相关。
因此，硝酸还原酶活性的测定，是利用一定体系中 NO3- 还原成NO2- 的速率或反应产物的含量，来评价細胞內硝酸还原酶活性大小的一种生化方法。
实验中通常采用光度法来测定硝酸还原酶的活性。
光度法是将产生的 NO2- 与苯磺酸二苯胺 ( sulfanilamide) 反应生成硝基苯偶氮苯磺酸 (N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride，NED) ，然后用紫外可见分光光度计测定产生的吸光度。
三、实验步骤3.1 实验前准备1）制备显色液：将 1g 苯磺酸二苯胺和 0.02 g NED 加入 10mL 硫酸中，用水稀释至100 mL 。
2）制备反应液：在无氧条件下，将浓硝酸滴入 50mL 去离子水中，制备100μM 硝酸钾溶液。
3）制备酶提取液：将新鲜植物组织（如叶片、幼芽等）用磨汁机研磨成细胞浆，加入0.05M 磷酸盐缓冲液 (PH=7.5) 中，按 1：5 的比例(即 1g 组织加 5mL 缓冲液) 收集悬液，离心 15 分钟，将上清液称取至 1mL，即为酶提取液。
3.2 检测方法1）在96孔板中加入100μL 酶提取液，40℃孵育20分钟。
2）加入100 μL 反应液，制备最终反应物质的浓度应为：10mM NaNO3、2mM Na2S2O4、0.05M 磷酸盐缓冲液 (pH 7.5)。
硝酸还原酶(NR)活性的测定
硝酸还原酶(NR)活性的测定
制作人： 车永梅 单 位： 生命科学学院
一、实验目的
了解硝酸还原酶在氮代谢中的地位，掌握硝酸还
原酶活性测定的方法。
二、实验原理
植物吸收的硝酸根离子，首先通过硝酸还原酶的 催化，被还原成亚硝酸根离子。其反应如下： NO3-+NADH+H+ → NO2-+NAD++H2O 产生的亚硝酸根离子可以从组织内渗到外界溶液中， 测定反应液中亚硝酸含量，通过一定公式计算就可 得硝酸还原酶活性的大小。
2. 取样
3. NaNO2 含量测定
五、实验结果
按下式计算酶活性： NR活性（gNO2-/gFW· h）＝
查表值×(46/69) 材料鲜重（g）×反应时间
六、思考题
1.NR活性测定时取材前为什么要进行一段时间光合
作用？ 2.测定Байду номын сангаас促反应时为什么要在暗处保温？ 3.NR活性测定时加入磺胺、盐酸萘乙二胺和KNO3 的作用各是什么？
试剂（ml）
试管号
1
0 1 2 2 0
2
0.1 0.9 2 2 0.5
3
0.2 0.8 2 2 1
4
0.4 0.6 2 2 2
5
0.6 0.4 2 2 3
6
0.8 0.2 2 2 4
7
1 0 2 2 5
NaNO2标准液(5微克／ml) 蒸馏水 对氨基苯磺酸(或磺胺) 盐酸萘乙二胺(或α-萘胺) 每管含NaNO2的微克数
亚硝酸离子的测定用比色法。其反应如下： 对氨基苯磺酸(或磺胺)+2H++NO2- → 叠氮化合物 叠氮化合物+α-萘胺（或盐酸萘乙二胺） → 偶氮化 合物(红色) 生成的红色偶氮化合物在520nm波长比色，其光密 度值与NO2-含量成正比。
硝酸还原酶活性的测定实验报告
硝酸还原酶活性的测定实验报告一、实验目的硝酸还原酶（NR）是植物氮代谢中的关键酶之一，其活性的高低与植物氮素利用效率密切相关。
本实验旨在掌握硝酸还原酶活性的测定方法，了解不同植物材料或不同处理条件下硝酸还原酶活性的差异，为进一步研究植物氮代谢机制和氮素营养调控提供依据。
二、实验原理硝酸还原酶能够催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐。
在一定条件下，产生的亚硝酸盐量与硝酸还原酶活性成正比。
通过测定反应体系中亚硝酸盐的含量，可以间接反映硝酸还原酶的活性。
本实验采用磺胺比色法测定亚硝酸盐含量。
在酸性条件下，亚硝酸盐与磺胺发生重氮化反应，生成重氮盐，再与 N（1-萘基）乙二胺盐酸盐（NED）偶联，形成红色偶氮化合物。
该化合物在 540nm 波长处有最大吸收峰，其吸光度与亚硝酸盐含量成正比。
三、实验材料、仪器与试剂1、实验材料选取新鲜的植物叶片，如小麦、玉米、大豆等。
2、仪器分光光度计、离心机、恒温水浴锅、移液器、研钵、容量瓶、刻度试管等。
3、试剂（1）01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液；（2）02mol/L KNO₃溶液；（3）1%磺胺溶液（磺胺溶于 30%乙酸中）；（4）002% N（1-萘基）乙二胺盐酸盐溶液（NED）；（5）5μg/mL 亚硝酸钠标准溶液。
四、实验步骤1、酶液提取称取新鲜植物叶片 05g，剪碎后放入研钵中，加入 5mL 01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液，在冰浴中研磨成匀浆。
将匀浆转移至离心管中，在4℃下以 10000r/min 离心 15min，上清液即为酶提取液。
2、反应体系设置取两支刻度试管，分别标记为对照管（CK）和测定管（T）。
对照管：加入 1mL 01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液和 1mL 02mol/L KNO₃溶液。
测定管：加入 1mL 酶提取液和 1mL 02mol/L KNO₃溶液。
将两支试管置于 30℃恒温水浴锅中保温 30min。
3、终止反应保温结束后，向对照管和测定管中分别加入 1mL 磺胺溶液和 1mL NED 溶液，摇匀，以终止反应。
实验报告-硝酸还原酶活性的测定
实验报告-硝酸还原酶活性的测定实验目的：通过测定差示分光光度法下重铬酸钾氧化还原的反应，间接测定硝酸还原酶的活性。
实验原理：硝酸还原酶是一种以二价铁离子为电子受体的酶，能将NO2-还原为NO，是硝化作用的逆反应。
硝酸还原酶活性含量的测定常用于土壤、水环境等环境污染的检测。
本实验采用差示分光光度法来测定硝酸还原酶活性。
本实验中的差示分光光度法，利用重铬酸钾通过氧化还原反应，证明硝酸还原酶活性的存在。
重铬酸钾可以与硫酸铵和硝酸根离子反应，生成过氧化双铬离子和金属铵盐，同时溶液中的硝酸根离子被还原成氨氮产生气体释放出来。
通过测定溶液中氨氮的浓度，就可以计算出硝酸还原酶的活性含量。
实验步骤：1.准备A、B、C三个样品液。
A液：葡萄糖酸钙0.2g、1.5ml缓冲溶液、0.3ml菌液，加水至50ml。
B液：A液中再加菌液0.1ml。
C液：A液中再加无菌蒸馏水0.1ml代替菌液。
2.分别在三个位于水浴中的试管中加入A、B、C液各5ml并在水浴中孵育30分钟。
3.在孵育A液和C液试管的时间中，用硫酸铵和硝酸铵配制1%的硝酸根离子的溶液，重铬酸钾以及0.05%的草酸铁溶液。
4.在孵育后立即对A、B、C液各加入10ml配制好的硝酸根离子溶液。
5.再依次加入相同体积的重铬酸钾、草酸铁溶液，灵敏管测定氨氮的相对吸收值。
实验结果：样品重铬酸钾溶液的吸光度草酸铁溶液的吸光度比值氨氮浓度（mg/L）A 0.87 0.28 3.11 4.7B 0.77 0.25 3.08 4.6C 0.05 0.03 1.67 2.5实验分析：由上表可知，A、B两个样品的吸光度比值相差不太明显，说明A液中添加的0.1ml菌液对硝酸还原酶的活性没有显著的提高作用，而C液则比较显著地破坏了硝酸还原酶的活性，其氨氮浓度只有A、B两个样品的一半。
通过本次实验的差示分光光度法测定硝酸还原酶活性的方法，我们发现添加微生物菌液可以提高硝酸还原酶的活性，而加入无菌蒸馏水则会对其产生损害。
硝酸还原酶(NR)活性测定
实验三：硝酸还原酶（NR）活性测定一、实验目的了解硝酸还原酶的活性测定的原理，掌握活体测定硝酸还原酶地方法二、实验原理硝酸还原酶是植物氮元素代谢过程中的关键酶，于作物的吸收和利用氮元素有关，他们作用于硝酸根，使之还原为亚硝酸根根：NO3-+NADH++H+ NR NO2-+NAD++H2O产生的亚硝酸根可以从组织内渗入到外界溶液中，从而测定溶液中亚硝酸根的含量的增加即为NR活性大小测定时间磺胺与亚硝酸钠形成重氮盐，再与α-奈氨偶联形成紫色物质。
反应液的酸度和温度都会对反应产生影响。
三、试剂与器材1、材料：小白菜叶片2、试剂：0.1mol/L ph7.5磷酸缓冲液，磺胺试剂、α-奈氨、0.2mol/LKNO3、NaNO2标准溶液3、器材：分光光度计、注射器、试管、天平、烧杯、移液管、恒温箱四、实验步骤1、按下列表格配置不同浓度的NaNO2溶液2、另取7支试管编号，取上述配置好的溶液各1ml，分别加入磺胺2ml、α-奈氨2ml摇匀静置30min，在520nm处比色以NaNO2终浓度为横坐标绘制标准曲线3、将小白菜叶片剪成0.5cm2大小称取两分，每份各0.5g放入另个烧杯中，一个烧杯中加入0.1ml/L磷酸缓冲液5ml再加入蒸馏水5ml，作为对照组。
林一个烧杯中加入0.1mol/L磷酸缓冲液5ml和0.2mol/LKNO3溶液5ml作为实验组。
将材料与溶液混合置于射器中抽气至材料沉入溶液。
4、将含材料的烧杯置于30℃恒温箱中30min，之后分别取1ml溶液按第二步进行NO2-含量测定5、结果分析：酶活性（NO2- μg g-1h-1）=（实验组NO2-含量-对照组NO2-含量）/材料重量（g）/时间（h）五、实验结果实验分析及感悟:由于实验过程中，移液管的混用可能会导致部分溶液污染导致实验产生误差。
叶片剪切的由于抽气不够是结果偏小。
本次试验经历了很长时间，我们从上午10点一直做到下午一点才做完。
当然经过努力的数据分析我们最终得到了我们所渴求的实验结果。
水稻硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶测定
水稻硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶测定下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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硝酸还原酶活性测定实验报告
硝酸还原酶活性测定实验报告硝酸还原酶（nitrate reductase）是峰莱斯郎（Pierre van Laerzem）和卡尔·诺顿·塞尔西格（Carl Norton Searcy）于1943年发现的一种负责将硝酸还原为亚硝酸的酶。
该酶在许多生物体中都很常见，包括细菌、真菌、植物和动物等。
硝酸还原酶在土壤中特别重要，因为它可以将植物的主要氮源硝酸盐还原为植物可以利用的亚硝酸盐。
本实验旨在测定硝酸还原酶活性，从而了解该酶在样本中的含量及其催化亚硝酸盐的能力。
下面将详细介绍实验步骤和结果。
实验步骤：1. 取样本：从实验样本中获取合适的样品，如土壤样品、植物组织等。
2. 制备样品提取液：将样品加入合适的缓冲液中（一般为磷酸盐缓冲液），并进行均匀混合。
3. 离心：离心样品提取液，以去除悬浮的杂质及固体颗粒。
4. 超声处理：用超声波仪器对样品进行超声处理，破坏细胞结构，释放出硝酸还原酶。
5. 萃取：将样品提取液进行适度的萃取，以得到含有硝酸还原酶的萃取液。
6. 酶活性分析：将萃取液与适量的硝酸盐和辅助酶（如辅酶、酶辅酶等）混合，并在适合的温度和pH条件下孵育，一段时间后停止反应。
7. 颜色反应：使用格里希法或其他适当的方法，在反应停止后通过颜色反应测定亚硝酸盐的生成量。
亚硝酸盐的浓度与硝酸还原酶活性成正比。
8. 计算硝酸还原酶活性：根据样品的反应结果和标准曲线，计算出硝酸还原酶的活性。
实验结果：实验结果应包括标本中硝酸还原酶的活性以及对照组的活性值。
通常，对照组是以无酶萃取物为基准进行分析。
硝酸还原酶活性的测定单位为μmol/min/g（或μmol/h/g）。
讨论和结论：根据实验结果，可以比较不同样本之间的硝酸还原酶活性。
较高的活性值表明样本中含有较高水平的硝酸还原酶。
这可以用来评估土壤氮素转化能力、植物对硝酸盐的吸收能力等。
同时，本实验的成功与否也与实验流程相连。
在实验中，合适的采样技术、样品提取和超声处理等步骤对保证提取液中酶的完整性和活性至关重要。
硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶的测定
硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶活性的测定摘要本实验以小麦为实验材料，对小麦进行预处理，提取酶液进行硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶活性的测定，说明小麦对氮素的利用途径。
关键词小麦硝酸还原酶谷氨酰胺合成酶酶活性引言硝酸还原酶(NR)是植物代谢中十分重要的一种酶,它主要是在硝酸亚硝化过程中起催化作用。
同时, 它对其他代谢如光合作用、碳代谢和能量代谢都有重要影响[1]。
就植物的生长和发育而言 ,氮素的同化是个十分重要的生理过程。
其中 ,无机氮必须同化为谷氨酰胺和谷氨酸等有机氮才能被植物体所吸收和利用。
谷氨酰胺合成酶 (GS) 是高等植物氮代谢中十分重要的酶 ,它和谷氨酸合成酶联合作用 ,催化氨的同化 ,使其转变成 Gln 和 Glu ,在小麦植物体内含氮有机物的生物合成中作为 N 的供体[2]。
1、实验材料与方法1.1实验材料与试剂小麦、亚硝酸钠、磷酸氢二钠、对氨基苯磺酸、浓盐酸、萘基乙烯胺、硝酸钾、三氯乙酸、反应液、终止液、显色液、亚硝态氮标准溶液、三羟甲基氨基甲烷、硫酸镁、二硫苏糖醇、蔗糖、浓盐酸、谷氨酸钠盐、半胱氨酸、乙二醇双（氨乙基醚）四乙酸（EGTA）、盐酸羟胺、氯化铁、三氯乙酸、三磷酸腺苷（ATP）。
1.2实验原理1.2.1硝酸还原酶活性的测定硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
此红色偶氮化合物在540nm下有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
故硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示，而亚硝态氮的量可有标准曲线查的。
1.2.2谷氨酰胺合成酶活性的测定谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它能催化植物体内在硝酸还原过程中产生的氨与谷氨酸形成谷氨酰胺，实现氨的同化，在生物体内，谷氨酰胺既是氨的贮存形式（消除氨毒），又可用于谷氨酸的合成，在进一步合成其他氨基酸。
植物生理生化实验3硝酸还原酶
硝酸还原酶活性(ug／h·g)=C酸还原酶活性，并解释。
硝酸还原酶将N03-还原为N02-，产生的N02-可 以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中， 测定反应液中的N02-含量的多少，就表示硝酸还 原酶活性的大小。
N02-含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液 中磺胺与N02-形成重氮盐，重氮盐再与α-萘胺 偶联形成紫红色的偶氮染料，这种偶氮染料在 520nm处有最大吸收峰，因此选用波长520nm分光 光度法进行测定。
根据Lambert-Beer定律：物质对光的吸收，吸 收的光量与物质的浓度、溶液的厚度成比例关系， 用公式表示为
A=KLC
K为吸收系数，表示物质对光的吸收特性，为定值 L为溶液厚度，比色杯直径为1cm KL为固定值，C溶液浓度越大，则吸光度越大
器材与试剂
油菜叶片、小白菜叶片、 UV-1100型紫外/ 可见分光光度计、20毫升针筒、打孔器、恒温 箱、天平、比色皿、三角瓶、移液枪、擦镜纸、 吸水纸
0.1 mol/L pH7.5磷酸缓冲液、O.2M KNO3 溶液、磺胺试剂、α-萘胺试剂、超纯水
2、绘制标准曲线
用磺胺比色法测定N02-这个方法很灵敏，可 以检测出0.5ug/ml的NaN02含量。吸取六个浓度 的NaN02溶液，分别为0、1、2、3、4、5 ug/ml 各1ml，加入磺胺试剂2ml及α-萘胺试剂2ml， 混合摇匀，静置30分钟，然后用分光光度计进 行测定。
3、N02-含量测定 溶液(1)1ml + 磺胺试剂2ml + α-萘胺试剂2ml 溶液(2)1ml + 磺胺试剂2ml + α-萘胺试剂2ml
2、绘制标准曲线（见P34）
3、N02-含量测定 溶液(1)1ml + 磺胺试剂2ml + α-萘胺试剂2ml
硝酸还原酶活性的测定
2. NO2- 含量测定
反应液1ml 反应液 磺胺试剂2ml 磺胺试剂 α- 萘胺 萘胺2ml 搅匀，静置30min 搅匀，静置
比色A520 比色
3. 计算 C×反应液总体积（10ml） ×反应液总体积（ ） ＝ 反应时间（0.5hr） 样品重量（g） 反应时间（0.5hr）×样品重量（g） ug / g·FW·h
作业： 作业：
测定硝酸还原酶活性时，反应过程中为何要在避光 测定硝酸还原酶活性时， 条件下进行？ 条件下进行？
实验三 硝酸还原酶活性的测定 活体法） （活体法）
【实验原理】 实验原理】
本身不存在该酶， 本身不存在该酶，外加 NO3-，诱导生成 ，
硝酸还原酶（ ） 该酶为诱导酶 诱导酶。 硝酸还原酶（NR）是植物氮素代谢作用中的关键性的酶 ，该酶为诱导酶。
NO3
NR
NO2
- 可以从细胞中很快地分泌到反应液中， NO2 可以从细胞中很快地分泌到反应液中，故只要测
⑴ 叶片水洗吸干
钻孔得小圆片（直径 钻孔得小圆片（直径1cm） ）
称取2份 每份 称取 份，每份0.4g
NO.1: 磷酸缓冲液 5ml ＋蒸馏水 5ml ⑵ 取2只三角瓶 只三角瓶 NO.2: 磷酸缓冲液 5ml ＋0.2M KNO3 5ml
⑶ 加入叶片
抽气至叶片沉淀（抽气彻底，以使溶液与质膜充分接触， ⑷ 抽气至叶片沉淀（抽气彻底，以使溶液与质膜充分接触，使反应 顺利进行） 顺利进行）
的增加，可计算该酶活性的大小。 定反应液中的 NO2- 的增加，可计算该酶活性的大小。
NO2 ＋ 磺胺
酸性 重氮盐 ＋ α- 萘胺 紫红色偶氮染料
小时内稳定） （颜色在2～3小时内稳定） 颜色在 ～ 小时内稳定
实验报告-硝酸还原酶活性的测定
首都师范大学生命科学学院实验报告课程名称植物生理实验实验时间2010331 成绩__________ 姓名唐倪文班级_3 __________ 学号1090800032实验题目硝酸还原酶活性的测定_______________________________________一、实验原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO使之还原为NO。
NO-+ NADH + H+—NO2- + NAD+ + H2O产生的NO可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。
因此，测定反应液中NO含量的增加即表明酶活性的大小。
NO含量的测定----磺胺法NO 2-与磺胺和:-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm下读取光密度值。
二、实验用品1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液枪，tip 头(两种规格：1000卩I，200卩I )三、实验步骤1. 分别配制反应液于小烧杯中(1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml(2) 0.1M 磷酸缓冲液5ml + 0.2MKNQ 5ml2. NO2-的获得(1) 称取新鲜叶片0.5g共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。
(2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其中的空气，内部产生的NO可渗透到外部溶液中。
3. 将小烧杯转到30 T温箱，使其不见光，保温20min。
4. 用5卩g/ml NaNO2母液配制标准梯度溶液5、4、3、2、1、0.5、0.1、0 卩g/ml。
5. 吸取不同浓度的NaNOml于试管中，加入磺胺试剂2ml及a -萘胺试剂2ml，混合均匀，在60C水浴中保温20min,于比色杯中，在520nm下进行比色，读取光密度，然后做出光密度一浓度曲线，以光密度为纵坐标，NaN染度为横坐标。
具体步骤及结果如下表和下图所示。
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实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定
一、硝酸还原酶的测定
[原理]：
硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
[试剂]
1．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液；2．0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O
2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml；
3．1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）；
4．0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中；
5．0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中；
6．0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中；
7．30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。
水溶后定容至100ml。
[方法]；
摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。
以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。
2.样品中硝酸还原酶活力测定
1.在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。
2.称取作物叶片0.5g（共3份，剪成1cm 左右的小段（均匀），放入3只三角瓶中，其中
1份作对照，另外2份作酶活性测定用。
3.反应：先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml
0.1mol/L KNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气30分钟（期间几次通入空气，再
抽真空，使叶片完全沉入瓶底，后在25℃黑暗中反应0.5小时，分别向测定瓶（对照瓶除外）加入1ml30%三氯乙酸终止酶反应。
4. 比色测定：将各瓶摇匀静置2min 后，各取2ml 反应液，加入1ml 磺胺，摇匀后再加入
1ml 萘基乙烯胺，再在35℃水浴中显色15min ，后比色，540nm
5. 空白溶液：2ml 蒸馏水+1ml 磺胺+1ml α-萘胺。
同样和样液一样进行水浴15min 。
结果计算 单位鲜重样品中硝酸还原酶活性t
W x
v v ⨯⨯=1
2
[μg/ (g .h)] 式中：为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量，μg ；V 1为提取酶时加入的缓冲液体积，ml ；V 2为酶反应时加人的粗酶液体积，ml ；W 为样品鲜重，g ；t 为反应时间，h 。
二、谷氨酰胺合成酶的活性的测定
【原理】
谷氨酰胺合成酶（GS ）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和Mg 2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol ·mg ﹣1protein ·h ﹣1。
也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1。
【仪器与用具】
冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml 、1ml ）。
【试剂】
提取缓冲液：
0.05mol/L Tris-HCl ，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+，2mmol/L DTT ，0.4mol/L 蔗糖。
称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.5295g ，0.1245g MgSO 4·7H 2O ，0.1543g DTT （二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml ；
反应混合液A （0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：
内含80mmol/L Mg 2+，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2mmol/L EGTA ，称取3.0590g Tris ，4.9795 gMgSO 4·7H 2O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA ，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml ；
反应混合液B （含盐酸羟胺，pH7.4）：
反应混合液A 的成分再加入80mol/L 盐酸羟胺，pH7.4；
显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3和0.6mol/L HCl 混合液）：
3.3176g TCA （三氯乙酸），10.1021g FeCl 3·6H 2O ，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml ；
40mmol/L ATP 溶液：0.1210g ATP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。
【方法】
1.粗酶液提取 称取植物材料1g 于研钵中，加3ml 提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g 离心20min ，上清液即为粗酶液。
2.反应 1.6ml 反应混合液B ，加入0.7ml 粗酶液和0.7ml ATP 溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml ，摇匀并放置片刻后，于5,000g 下离心10min ，取上清液测定540nm 处的吸光值，以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。
3.粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液0.5ml ，用水定容至100ml ，取2ml 用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质（见实验28）。
4.原始数据记载
结果计算：
GS 活力(A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1)＝t V P A
⨯⨯
式中 A —540nm 处的吸光值；
P —粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml ）；
V —反应体系中加入的粗酶液体积（ml ）；
T —反应时间（h ）。