SNP分型方法及科研应用
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定量PCR重复 96次结果示 意图
终点法定量之殇：因PCR效率差异使得同一个实验却获得不同的PCR终产物浓度。
竞争性PCR原理
与实时荧光定量PCR比较，具有相同的准确性！
CNV分型示意图
Reference AC
AC
基因组
质粒DNA
PCR模板完全一样，仅多出2 个碱基，所以扩增效率一致 。 无论处于PCR扩增的哪个时 期，PCR终产物比值即初始 模板比值。
候选基因分析实例
（新）实验思路
利用部分样本重测序UTR区发现SNP，然后在全部样本中进行SNP的相关性 分析。
5’UTR调控区：启动子区 3’UTR调控区：microRNA结合区，RNA转运调控 UTR可进行功能学上的研究，能将传统的遗传统计学在基因功能研究上进
行推进。
GWAS得到的阳性SNP绝大多数不在编码区中，而是在于 基因调控区。
STR
miRNA
mRNA （lnRNA
）
目录
PCR-LDR
MCF
常规片段分 析
SYBR定量 SYBR定量 PCR-ARRAY
MCF
CNV：最
新的分 子遗传 位标
竞争性PCR原理
MCF：Multiplex Competitive Fluorescent-PCR(MCF-PCR ）
竞争性PCR基本原理 竞争性PCR技术是有一段竞争性序列，与目标基因序列基本
LD分析
筛选SNP
，大样本 量统计验
证
功能实验
候选基因分析
方法：
通过选择与性状可能相关的候选基因，用该候选基因的已知或重测序分析 得到标签SNP，通过大样本的统计分析验证该基因是否和该性状相关。
候选基因的来源包括（文献）：
功能分析的结果 模式动物的结果 GWAS的结果。
举例
38
基于PCR ARRAY的科研应用
microRNA 靶基因的验证 信号通路的研究
特定信号途径的研究 基因网络相互作用的分析
相同，两者用共同引物进行扩增，具备相同的扩增效率， PCR终产物的浓度比值反应了起始模板的浓度比值。
*无论PCR扩增是否存在平台期，这个规律一直存在！
竞争性PCR原理
竞争性PCR基本原理 竞争性PCR技术是通过每反应孔中存在相同的竞争性PCR模
板来校对PCR管内多重PCR的扩增差异，获得可靠的结果。
家系分析
方法：
在全基因组范围内进行STR（SSR）标记分析，根据连锁不平衡原理找到与 性状相关的区段。
目的
找到性状相关的染色体定位，可进一步进行精细定位，进而找到和性状相 关的基因（位点）。
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
SNP
CNV
STR
miRNA
mRNA （lnRNA
核酸新技术及科研应用
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
SNP
CNV
STR
miRNA
mRNA （lnRNA
）
目录
PCR-LDR
MCF 常规片段分
析 SYBR定量 SYBR定量 PCR-ARRAY
MCF
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
SNP
CNV
STR
miRNA
mRNA （lnRNA
目的
排除假阳性结果。
或者多基因决定的复杂性状，或者不同基因背景和不同环境（生活状
态），相关位点可能不同。跟踪文献：
Genome-wide association study identifies a
举例
susceptibility locus for schizophrenia in Han Chinese at 11p11.2.（ Nat Genet.）
录 第三步：通过SYBR Green
实时检测PCR产物
31
技术比较
加尾法的技术特点
通用性强 无法区分3p和5p，成熟的和非成熟miRNA。
颈环法的技术特点
特异性强，能区分3p、5p形式及成熟miRNA 每个miRNA需要设计颈环引物 样本损耗 严重，但在一定范围内能够克服。
32
检测范例
利用本方法对野生型小鼠30-6与转基因小鼠30-1、26-4、26-6、26-7 的丘脑（H）与卵巢（O）mir505的3p和5p两种形式进行定量检测，扩增曲线 如下图和转基因相对表达量如右柱状图示。
33
miRNA科研应用
临床中miRNA的科研应用
选取少量 样本
NGS 或芯片
筛选表达 差异 miRNA
12 genes-8 samples
24 genes-4 samples
32 genes-3 samples
48 genes-2 samples
96 genes-1 sample
翼和
客户基因 引物优化 引物固化
定制的PCR ARRAY
客户
Mix cDNA
优势
定制PCR array
无需优化
上机
不惧降解
）
wk.baidu.com
目录
PCR-LDR
MCF
常规片段分 析
SYBR定量 SYBR定量 PCR-ARRAY
MCF
研究热 点
SYBR 颈环法检测 miRNA
基本流程
第一步：基于Stem-Loop 引物的逆转录反应
第二步：通过SYBR Green实时检测PCR产物
30
SYBR 加尾法检测 miRNA
基本流程
第一步：基于poly(A)加尾 第二步： oligo-dT的逆转
候选位点的来源包括（文献）：
模式动物的结果 CGH(或NGS）的结果。
举例
Independent estimation of the frequency of rare CNVs in the UK population confirms their role in schizophrenia（Schizophr Res.）
miRNA
mRNA （lnRNA
）
目录
PCR-LDR
MCF
常规片段分 析
SYBR定量 SYBR定量
PCR-ARRAY MCF
传统遗 传学方 法，家 系分析
STR定义
微卫星标记（Microsatellite）也称为短串联重复序列 （STR）或简单重复序列（SSR），是广泛分布在真核生物
基因组中的简单重复序列。 STR: short tandem repeat SSR: simple sequence repeat
定量技术
临床样本 miRNA有差异 验证
细胞学 实验
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
SNP
CNV
STR
miRNA
mRNA （lnRNA
）
目录
PCR-LDR
MCF
常规片段分 析
SYBR定量 SYBR定量 PCR-ARRAY
MCF
最常规 的检测 方法
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
）
目录
PCR-LDR
MCF
常规片段分 析
SYBR定量 SYBR定量
PCR-ARRAY MCF
SNP:最
常用的 分子遗 传学研 究方法
SNP分型原理
LDR（ligase detection reaction)
*Taq
高温
特异性高 温控循环，信号量大。
原理
只有检测点处的碱基互补配 对时，连接酶的连接反应才 能进行。
CNV分型示意图
CNV科研应用
高通量实验结果的验证 候选区段的研究 肿瘤相关基因的研究
高通量实验结果的验证
方法：
利用CGH研究结果（或NGS测序结果），在少数个体中发现了与性状相关 的CNV，则该结果需要在大样本量中进行验证。
目的
排除假阳性结果。 或者多基因决定的复杂性状，或者不同基因背景和不同环境（生活状
ENCODE （Encyclopedia of DNA Elements， DNA元素百科全书)项 目。
候选基因分析实例
基于“DNA元素百科全书”的科研流程
疾病相关 候选基因
查找 “调控区”
“百科全书” 研究结果
重测序
上个案例的 研究流程
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
SNP
CNV
我公司采取的实验方法：改 进的stem-Loop引物与优化 的SYBR Green提高RT效率
一个说明： 最经典的miRNA荧光定量方法是Taqman实时荧光定量PCR方案，但因大多数 miRNA序列非常特异，SYBR方案已经满足检测需求。当然是如果对于一些家族 miRNA进行差异化鉴定，因为其序列仅有1个碱基差异，所以只能用Taqman方 法检测。
肿瘤相关基因的研究
方法：
肿 瘤 样 本 中 ， 经 常 出 现 相 关 基 因 的 丢 失 （ LOH loss of heterozygosity 杂合性丢失）和扩增，对一定量的临床样本进行验证。 丢失！！
肿瘤组织是个混合物！！
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
SNP
CNV
STR
No Association of PLIN Polymorphisms With Hemorrhagic and
Ischemic Stroke（Stroke）
候选基因分析
标签SNP的选择：
hapmap计划的数据进行标签SNP（tag SNP）分析 重测序
5’UTR，3’UTR调控区 外显子及外显子内含子剪接区 “DNA百科全书”数据库中列出的序列
态），因此相关位点可能不同。
举例
Duplications of the Neuropeptide Receptor VIPR2 Confer Significant Risk for Schizophrenia（Nat Genet.）
候选区段的研究
方法：
根据文献报道的性状和CNV位点相关性，自行收集样本量进行验证。
>D5S818 AGGAATGCTTTAGTGCTTTTTAGCCAAGTGATTCCAATCATAG CCACAGTTTACAACATTTGTATCTTTATCTGTATCCTTATTTAT ACCTCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTAT CTATCTTCAAAATATTACATAAGGATACCAAAGAGGAAAATCA CCCTTG
候选基因分析实例
举例
Functional variant in methionine synthase reductase
intron-1 significantly increases the risk of congenital
heart
disease
in
the
Han
Chinese
population.(Circulation)
Replication Study Confirms Link between TSPAN18
Mutation and Schizophrenia in Han Chinese （Plos One）
GWAS 结果的验证
（新）实验思路：
GWAS阳性 不是原因 位点
重测序
是原因
功能实验
发现新 SNP
SNP
CNV
STR
miRNA
mRNA （lnRNA
）
目录
PCR-LDR
MCF
常规片段分 析
SYBR定量 SYBR定量 PCR-ARRAY
MCF
灵活的 多基因 研究方 案
PCR ARRAY产品形式
把感兴趣基因的qPCR Primers按一定的排布规律交联到 96-well-Plate中，可以形成以下模块方式：
A
PCR
PCR-LDR动画示意
C
长度不同
LDR
A/C T G
A
C
60 65 长度（bp）
实验结果示例
SNP科研应用
GWAS (全基因组关联）及验证 候选基因的分析
标签SNP分析 重测序分析
UTR重测序 “百科全书”重测序
GWAS 及验证
方法：
利用GWAS（Genome Wide Association Study 全基因组关联分析） 研究成果，或自行进行 GWAS 分析，在某群体中发现了与 性状相 关的 SNP，则该结果需要在其他群体中进行验证。
候选基因分析实例
（新）实验思路
2012年9月5日，ENCODE项目的阶段性研究结果被整理成30篇论文发表于 《自然》（6篇），《基因组研究》（6篇）和《基因组生物学》（18篇） 上。研究结果显示，人类基因组内的非编码DNA至少80%是有生物活性的， 而并非之前认为的“垃圾” DNA （junk DNA）。
…… Six PLIN tag single nucleotide polymorphisms (rs7176403, rs8179078, rs6496589, rs8179043, rs894160, rs1052700) were genotyped in 1571 patients with stroke。。。 。。。。。。
终点法定量之殇：因PCR效率差异使得同一个实验却获得不同的PCR终产物浓度。
竞争性PCR原理
与实时荧光定量PCR比较，具有相同的准确性！
CNV分型示意图
Reference AC
AC
基因组
质粒DNA
PCR模板完全一样，仅多出2 个碱基，所以扩增效率一致 。 无论处于PCR扩增的哪个时 期，PCR终产物比值即初始 模板比值。
候选基因分析实例
（新）实验思路
利用部分样本重测序UTR区发现SNP，然后在全部样本中进行SNP的相关性 分析。
5’UTR调控区：启动子区 3’UTR调控区：microRNA结合区，RNA转运调控 UTR可进行功能学上的研究，能将传统的遗传统计学在基因功能研究上进
行推进。
GWAS得到的阳性SNP绝大多数不在编码区中，而是在于 基因调控区。
STR
miRNA
mRNA （lnRNA
）
目录
PCR-LDR
MCF
常规片段分 析
SYBR定量 SYBR定量 PCR-ARRAY
MCF
CNV：最
新的分 子遗传 位标
竞争性PCR原理
MCF：Multiplex Competitive Fluorescent-PCR(MCF-PCR ）
竞争性PCR基本原理 竞争性PCR技术是有一段竞争性序列，与目标基因序列基本
LD分析
筛选SNP
，大样本 量统计验
证
功能实验
候选基因分析
方法：
通过选择与性状可能相关的候选基因，用该候选基因的已知或重测序分析 得到标签SNP，通过大样本的统计分析验证该基因是否和该性状相关。
候选基因的来源包括（文献）：
功能分析的结果 模式动物的结果 GWAS的结果。
举例
38
基于PCR ARRAY的科研应用
microRNA 靶基因的验证 信号通路的研究
特定信号途径的研究 基因网络相互作用的分析
相同，两者用共同引物进行扩增，具备相同的扩增效率， PCR终产物的浓度比值反应了起始模板的浓度比值。
*无论PCR扩增是否存在平台期，这个规律一直存在！
竞争性PCR原理
竞争性PCR基本原理 竞争性PCR技术是通过每反应孔中存在相同的竞争性PCR模
板来校对PCR管内多重PCR的扩增差异，获得可靠的结果。
家系分析
方法：
在全基因组范围内进行STR（SSR）标记分析，根据连锁不平衡原理找到与 性状相关的区段。
目的
找到性状相关的染色体定位，可进一步进行精细定位，进而找到和性状相 关的基因（位点）。
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
SNP
CNV
STR
miRNA
mRNA （lnRNA
核酸新技术及科研应用
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
SNP
CNV
STR
miRNA
mRNA （lnRNA
）
目录
PCR-LDR
MCF 常规片段分
析 SYBR定量 SYBR定量 PCR-ARRAY
MCF
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
SNP
CNV
STR
miRNA
mRNA （lnRNA
目的
排除假阳性结果。
或者多基因决定的复杂性状，或者不同基因背景和不同环境（生活状
态），相关位点可能不同。跟踪文献：
Genome-wide association study identifies a
举例
susceptibility locus for schizophrenia in Han Chinese at 11p11.2.（ Nat Genet.）
录 第三步：通过SYBR Green
实时检测PCR产物
31
技术比较
加尾法的技术特点
通用性强 无法区分3p和5p，成熟的和非成熟miRNA。
颈环法的技术特点
特异性强，能区分3p、5p形式及成熟miRNA 每个miRNA需要设计颈环引物 样本损耗 严重，但在一定范围内能够克服。
32
检测范例
利用本方法对野生型小鼠30-6与转基因小鼠30-1、26-4、26-6、26-7 的丘脑（H）与卵巢（O）mir505的3p和5p两种形式进行定量检测，扩增曲线 如下图和转基因相对表达量如右柱状图示。
33
miRNA科研应用
临床中miRNA的科研应用
选取少量 样本
NGS 或芯片
筛选表达 差异 miRNA
12 genes-8 samples
24 genes-4 samples
32 genes-3 samples
48 genes-2 samples
96 genes-1 sample
翼和
客户基因 引物优化 引物固化
定制的PCR ARRAY
客户
Mix cDNA
优势
定制PCR array
无需优化
上机
不惧降解
）
wk.baidu.com
目录
PCR-LDR
MCF
常规片段分 析
SYBR定量 SYBR定量 PCR-ARRAY
MCF
研究热 点
SYBR 颈环法检测 miRNA
基本流程
第一步：基于Stem-Loop 引物的逆转录反应
第二步：通过SYBR Green实时检测PCR产物
30
SYBR 加尾法检测 miRNA
基本流程
第一步：基于poly(A)加尾 第二步： oligo-dT的逆转
候选位点的来源包括（文献）：
模式动物的结果 CGH(或NGS）的结果。
举例
Independent estimation of the frequency of rare CNVs in the UK population confirms their role in schizophrenia（Schizophr Res.）
miRNA
mRNA （lnRNA
）
目录
PCR-LDR
MCF
常规片段分 析
SYBR定量 SYBR定量
PCR-ARRAY MCF
传统遗 传学方 法，家 系分析
STR定义
微卫星标记（Microsatellite）也称为短串联重复序列 （STR）或简单重复序列（SSR），是广泛分布在真核生物
基因组中的简单重复序列。 STR: short tandem repeat SSR: simple sequence repeat
定量技术
临床样本 miRNA有差异 验证
细胞学 实验
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
SNP
CNV
STR
miRNA
mRNA （lnRNA
）
目录
PCR-LDR
MCF
常规片段分 析
SYBR定量 SYBR定量 PCR-ARRAY
MCF
最常规 的检测 方法
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
）
目录
PCR-LDR
MCF
常规片段分 析
SYBR定量 SYBR定量
PCR-ARRAY MCF
SNP:最
常用的 分子遗 传学研 究方法
SNP分型原理
LDR（ligase detection reaction)
*Taq
高温
特异性高 温控循环，信号量大。
原理
只有检测点处的碱基互补配 对时，连接酶的连接反应才 能进行。
CNV分型示意图
CNV科研应用
高通量实验结果的验证 候选区段的研究 肿瘤相关基因的研究
高通量实验结果的验证
方法：
利用CGH研究结果（或NGS测序结果），在少数个体中发现了与性状相关 的CNV，则该结果需要在大样本量中进行验证。
目的
排除假阳性结果。 或者多基因决定的复杂性状，或者不同基因背景和不同环境（生活状
ENCODE （Encyclopedia of DNA Elements， DNA元素百科全书)项 目。
候选基因分析实例
基于“DNA元素百科全书”的科研流程
疾病相关 候选基因
查找 “调控区”
“百科全书” 研究结果
重测序
上个案例的 研究流程
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
SNP
CNV
我公司采取的实验方法：改 进的stem-Loop引物与优化 的SYBR Green提高RT效率
一个说明： 最经典的miRNA荧光定量方法是Taqman实时荧光定量PCR方案，但因大多数 miRNA序列非常特异，SYBR方案已经满足检测需求。当然是如果对于一些家族 miRNA进行差异化鉴定，因为其序列仅有1个碱基差异，所以只能用Taqman方 法检测。
肿瘤相关基因的研究
方法：
肿 瘤 样 本 中 ， 经 常 出 现 相 关 基 因 的 丢 失 （ LOH loss of heterozygosity 杂合性丢失）和扩增，对一定量的临床样本进行验证。 丢失！！
肿瘤组织是个混合物！！
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
SNP
CNV
STR
No Association of PLIN Polymorphisms With Hemorrhagic and
Ischemic Stroke（Stroke）
候选基因分析
标签SNP的选择：
hapmap计划的数据进行标签SNP（tag SNP）分析 重测序
5’UTR，3’UTR调控区 外显子及外显子内含子剪接区 “DNA百科全书”数据库中列出的序列
态），因此相关位点可能不同。
举例
Duplications of the Neuropeptide Receptor VIPR2 Confer Significant Risk for Schizophrenia（Nat Genet.）
候选区段的研究
方法：
根据文献报道的性状和CNV位点相关性，自行收集样本量进行验证。
>D5S818 AGGAATGCTTTAGTGCTTTTTAGCCAAGTGATTCCAATCATAG CCACAGTTTACAACATTTGTATCTTTATCTGTATCCTTATTTAT ACCTCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTAT CTATCTTCAAAATATTACATAAGGATACCAAAGAGGAAAATCA CCCTTG
候选基因分析实例
举例
Functional variant in methionine synthase reductase
intron-1 significantly increases the risk of congenital
heart
disease
in
the
Han
Chinese
population.(Circulation)
Replication Study Confirms Link between TSPAN18
Mutation and Schizophrenia in Han Chinese （Plos One）
GWAS 结果的验证
（新）实验思路：
GWAS阳性 不是原因 位点
重测序
是原因
功能实验
发现新 SNP
SNP
CNV
STR
miRNA
mRNA （lnRNA
）
目录
PCR-LDR
MCF
常规片段分 析
SYBR定量 SYBR定量 PCR-ARRAY
MCF
灵活的 多基因 研究方 案
PCR ARRAY产品形式
把感兴趣基因的qPCR Primers按一定的排布规律交联到 96-well-Plate中，可以形成以下模块方式：
A
PCR
PCR-LDR动画示意
C
长度不同
LDR
A/C T G
A
C
60 65 长度（bp）
实验结果示例
SNP科研应用
GWAS (全基因组关联）及验证 候选基因的分析
标签SNP分析 重测序分析
UTR重测序 “百科全书”重测序
GWAS 及验证
方法：
利用GWAS（Genome Wide Association Study 全基因组关联分析） 研究成果，或自行进行 GWAS 分析，在某群体中发现了与 性状相 关的 SNP，则该结果需要在其他群体中进行验证。
候选基因分析实例
（新）实验思路
2012年9月5日，ENCODE项目的阶段性研究结果被整理成30篇论文发表于 《自然》（6篇），《基因组研究》（6篇）和《基因组生物学》（18篇） 上。研究结果显示，人类基因组内的非编码DNA至少80%是有生物活性的， 而并非之前认为的“垃圾” DNA （junk DNA）。
…… Six PLIN tag single nucleotide polymorphisms (rs7176403, rs8179078, rs6496589, rs8179043, rs894160, rs1052700) were genotyped in 1571 patients with stroke。。。 。。。。。。