酶工程课后题

1.简述酶工程的概念及内容

2.

1.名词解释：诱导物、终产物阻遏、分解代谢产物阻遏、葡萄糖效应

① 诱导物：诱导酶起始合成的物质（通常是酶的底物），可以引起阻遏蛋白的构象变化，使之不利于与操纵基因结合，如乳糖；而能引起阻遏蛋白的构象变化从而有利于其与操纵基因结合，阻遏酶产生的物质称为辅助阻遏，如氨基酸和核苷酸等。② 终产物阻遏：催化某一特异产物合成的酶，在培养基中有该产物存在的情况下常常是不合成的，即受阻遏的。③ 分解代谢产物阻遏：大肠杆菌在含有能分解的两种底物（如葡萄糖和乳糖）的培养基中生长时，首先分解利用其中的一种底物（葡萄糖），而不分解另一种底物(乳糖)，这是因为葡萄糖的分解代谢产物阻遏了分解利用乳糖的有关酶合成的结果，此作用即为分解代谢产物阻遏。④ 葡萄糖效应：由于葡萄糖常对分解利用其他底物的有关酶的合成有阻遏作用，故分解代谢产物阻遏又称为葡萄糖效应。

3.举例说明酶生物合成调节机制在产酶生物菌种改造中的指导意义

若通过基因工程手段和传统诱变的技术获得在抗代谢物存在时也能正常生长的突变株，有的突变株的相关酶系合成对这种抗代谢物不敏感，这也就解除了某些代谢物对有关酶系的反馈阻遏。例如，异亮氨酸合成途径中的关键酶——高丝氨酸脱氢酶受蛋氨酸的反馈阻遏，通过选育蛋氨酸结构类似物抗性突变株或者蛋氨酸缺陷型菌株，可提高该酶量，从而提高异亮氨酸产量。此外，在育种工作中，还可以筛选组成型菌株以提高酶的产量。以β-半乳糖苷酶的生产为例，将诱导型菌株培养在含有抑制物质邻硝基-β -D 岩藻糖苷和乳糖的培养基中时，由于诱导酶的合成被抑制，野生型因不能利用乳糖而不能生长，但组成型酶突变株对于乳糖的利用则不受限制，因而此环境中生长的突变株为组成型酶产生菌。

4.在酶的发酵过程中，提高酶产量的措施有哪些

①添加诱导物：对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物能使酶的产量显著增加。诱导物一般分为三类：酶的作用底物，如青霉素是青霉素酰化酶的诱导物；酶的反应产物，如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生；酶的底物类似物，如异丙基β -D-硫代半乳糖苷对β -半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍。②降低阻遏物浓度：微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法培养液中的碳源保持在不至于引起分解代谢物阻遏的浓度。③添加表面活性剂：在发酵生产中，非离子型的表面活性剂常被用作产酶促进剂，但它的作用机制尚未完全研究清楚。④添加产酶促进剂：产酶促进剂是指那些非微生物生长所必须，能提高酶产量但作用机制尚未阐明的物质，它可能是酶的激活剂或稳定剂.

7.结合酶生物合成模式，浅谈该如何提高酶的合成量

（一）遗传控制①诱变育种 a. 使诱导型变为组成型：选育组成型突变株 b. 使阻遏型变为去阻遏型 c. 解除反馈阻遏：选育营养缺陷型突变株、选育结构类似物抗性突变株 d. 解除分解代谢物阻遏：选育抗分解代谢阻遏突变株②基因工程育种：改变细胞调节基因，使菌种由诱导型变为组成型；增加结构基因的拷贝数，增加细胞专一性酶的生产。（二）条件控制① 添加诱导物酶的作用底物、作用底物的前体、反应产物、酶的底物类似物或底物修饰物② 降低阻遏物浓度: 产物阻遏：除去终产物；添加阻止产物形成的抑制剂分解代谢物阻遏：避免使用葡萄糖、避免培养基过于丰富、添加一定量的cAMP ③ 添加表面活性剂: 离子型( Tween－80),对细胞有毒害作用; 非离子型( TritonX－100),增加细胞通透性. ④ 添加产酶促进剂：酶促进剂对不同细胞、不同酶的效果各不相同，需通过试验选用适当的产酶促进剂并确定最适浓度,其作用机制并未阐明清楚。如添加植酸钙镁可使桔青霉素生产磷酸二酯酶的量提高 10－20 倍。

8.

1.名词解释ATPE:双水相萃取技术等电聚焦IEF 2-DE双向凝胶电泳IEC:离子交换层析根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法. HPLC:高效（压）液相层析利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程

5. 双水相萃取和反胶束萃取的原理?各自如何在酶的分离纯化中应有?

双水相萃取原理：是依据样品中目标组分在两相间的分配系数不同来进行选择性分离，当样品加入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种作用力（如疏水键、氢键和离子键等）的存在和环境条件的影响，各组分在两相中的浓度不同。由于分配系数等于系统平衡时两相中目标组分的浓度比，因此，在双水相萃取体系中可以利用各组分 K 值的不同对物质进行分离。应用：双水相萃取已经用于多种生物酶的分离，如利用 PEG/磷酸盐双水相体系提取发酵液中的碱性木聚糖酶，利用 PEG/羟丙基淀粉体系从黄豆中分离磷酸甘油酸和磷酸甘油醛脱氢酶，利用 PEG/K3PO4 双水相体系萃取纯化葡萄糖淀粉酶，利用PEG/Dextran 双水相体系分离过氢氧化酶等。此外，α -淀粉酶、胆固醇氧化酶、脂肪酶、纤维素酶、L-天冬酰胺酶等在双水相体系中也得到较好的分离。

反胶束萃取的原理：当蛋白质样品与反胶束溶液表面和蛋白质表面的相互作用，在两相界面形成了包含蛋白质的反胶束团，此时蛋白质以最大限度扩散进入反胶束中，从而实现蛋白质的正萃取。然后，含有蛋白质的反胶束与另一水相接触，通过改变水相条件（如 PH、离子强度等），可以调节蛋白质反萃取回水相，从而实现正萃取或反萃取过程，回收目的蛋白质。应用：反胶束萃取已经用于多种酶蛋白的分离，如利用十六烷甲基三甲基溴化铵（CTAB）、异辛烷/正辛醇反胶束溶液萃取纤维素酶，利用二烷基磷酸盐/异辛烷反胶束溶液萃取溶菌酶，利用琥珀酸二酯磺酸钠/异辛烷反胶束溶液提取发酵液中的碱性蛋白酶和α -淀粉酶等。此外，胰蛋白酶、碱性蛋白酶、异柠檬酸脱氢酶、β -羟基丁酸脱氢酶、脂肪酶等也可以利用反胶束萃取进行分离。

3.如何评价固定化酶的固定化效果。

由于选用的固定化方法不同，固定化酶的活力和性质也有所不同，因此需要对不同的固定化方法进行评价。评价的指标主要有：（1）固定化酶的比活每克（毫克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。（2）操作半衰期是衡量稳定性的指标。指在连续使用的条件下，固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）。固定化酶的操作半衰期是影响其实际应用的重要因素。 (3)偶联效率＝（加入的蛋白量－溶液中残留的蛋白量）/加入的总蛋白量×100％ (4)活力回收＝(固定化酶活力/投入的总酶活力)×100％ (5)相对酶活力具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值。 (6)酶载量单位载体所固定的酶活力（或酶蛋白量）。

4.简述固定化对酶性质的影响（固定化酶的性质）。

（1）稳定性大多数酶固定化后，稳定性都增强，操作寿命和保存寿命也延长。（2）固定化酶的最适温度和最适pH 固定化后，大多数酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高。酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶活力－pH曲线常常会发生偏移。带负电荷的载体固定化的酶的最适pH向碱性偏移，带正电荷的载体固定化的酶的最适pH向酸性偏移。（3）固定化酶的动力学特征固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。（4）固定化酶的专一性酶固定化后，一般不会改变其专一性。但也有少数情况酶固定化后专一性会发生改变。