现代药物分析重点

现代药物分析选论

光学小分子设计及应用

一、荧光的基本原理

荧光物质的分子吸收了特征频率的光能后，由基态跃迁到能级较高的第一电子激发态单线态或第二电子激发态单线态，然后通过无辐射跃迁返回到第一电子激发态单线态的最低振动能级上，再从该能级降落至基态的各个不同的振动能级上，同时释放出相应能量的分子荧光，最后以无辐射跃迁形式回到基态的最低振动能级。

二、常见的染料种类

荧光素类染料：FITC（异硫氰酸荧光素）FAM（羟基荧光素）TET（丝氯荧光素）

罗丹明类：R101 RB200 TAMRA

菁染料：噻唑橙（TO）恶唑橙（YO）

其他类：二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶芘类

三、分析化学药物分子相关的期刊名称

Springer、Chemical Reviews、Talanta、Organic Letters、dyes and pigments

体内药物分析

一、生物样品处理方法以及特点

【生物样品的特点】

样品珍贵，浓度低、量少；来源广泛、组成复杂、基质复杂；样品脆弱，容易失活；提纯步骤繁琐。【生物样品处理方法】

1.不稳定样品的预处理（氧化水解）

（1）易被氧化药物：a.样品中加入抗氧剂（VitC+EDTA、半胱氨酸、2-巯基乙醇）

b.将不稳定的药物转化为稳定的衍生物

（2）易水解药物预处理：酯酶抑制剂

2.常规方法：

（1）蛋白质沉淀法：加入甲醇、乙腈等有机溶剂，同时采用超速离心机；加入中性盐沉淀；

（2）超滤法：操作条件温和，没有相态变化，能量消耗小，破坏有效成分可能小需要血量少

（3）液液萃取法：一次提取可取出大量杂质，根据不同的有机溶剂，可具有高选择性

（4）SPE（固相萃取技术）特点：基质效应小

（5）直接进样技术与柱切换技术在线处理和分离（样品处理柱和样品分析柱）

（6）衍生化可以提高稳定性检测特性等问题

（7）离子交换树脂：具有高选择性，但较麻烦适用于高极性，可电离的物质。

（8）其他（顶空GC、制备HPLC、微透析技术）

二、体内药物分析评价指标、合格标准

1.方法特异性：特异性是指样品中存在干扰成分的情况下，分析方法专一的测定分析物的能力，注意在待测物出峰位置，空白基质应无干扰

2.标准曲线与线性范围：定量范围应查文献，结合预实验结果确定；至少6个点线性大于0.99 每个浓度点和加入浓度的差异，L<20% 其他<15%

3.方法定量限LOQ：满足3~5个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出Cmax的1/10~20时的药物浓度

4.精密度与准确度；三个浓度点每个浓度点五份样批内批间精密度低<20%中高

<15% 准确度不单独考察

5.提取回收率；中低3个浓度（80%、100%、120%）的提取回收率,其结果应当

精密和可重现. 应考察高中低三个浓度的提取回收率= 样品处理过程后/纯标准品* 100%

6.介质效应（ME）；用LC-MS测定样品时，由于内源性干扰物的存在，待测物在离子化过程中发生离子增强或离子抑制的作用.使测物响应值不稳定在85%--115%范围内可认为没有介质效应

措施：

（1）选择合适样品前处理方法，LLE和SPE介质效应相对较少

（2）改变待测物的色谱分离条件，优化色谱条件使内源性物质与待测物分开

（3）采用小进样量

（4）利用液相色谱电解质效应，加入有机酸或碱，促进离子化

（5）使用较低流速，降低了待测成分与基质成分在离子源的竞争

（6）改用不同的离子源，考虑APCI和APPA，ESI对基质的敏感性更高

7.样品稳定性：室温放置8h时间、反复冻融、长期冰冻、进样器放置8—9h

三、代谢物研究的制备方法

1.体外方法：肝微粒体温孵法、肝细胞温孵法、基因重组酶温孵法、肝组织切片法、离体肝灌流法肠道菌群体外温孵法（甘草皂苷）

2.体内方法：胆汁尿液粪便血液其他（乳汁肝匀浆等）

蛋白质组学

一、蛋白质组学的定义和特点

蛋白质组学是指在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。

蛋白质组学从蛋白质的水平上，对蛋白质进行定量，动态、整体的研究、阐明生物体全部蛋白质，表达模式及功能模式

【特点】

蛋白质组学是动态的，表现出多样性。

1）从mRNA表达水平并不能预测蛋白质表达

2）蛋白质动态修饰和加工并非必须来自同一基因序列

3）蛋白质组动态反映生物系统所处的状态

4）蛋白质组学较之前的基因组学对于生命现象的解释更直接、更准确。

二、蛋白质组学的定量方法

1.利用荧光染料进行定量的蛋白质组分析技术。适用于检测蛋自质的荧光染料有两类:

1）用于蛋白质荧光染色，如Sypro Ruby 和 RuBS

2) 用于蛋白质的荧光标记，如Cy2,Cy3和Cy5,可进行荧光双向差示凝胶电泳。

2运用质谱进行定量的蛋白质组分析技术：

a稳定同位素代谢标记技术

b同位素亲和标签技术

主要是使用一种称为ICAT的化学试剂。其结构由三部分组成：第一亲和标签（生物素），用来分离经标记后的多肽；第二连接子，用来整合稳定的同位素；第三活性基团，用来特异结合巯基。

三、二维电泳

第一相等电聚焦电泳分离第二相按质量分离

固相PH梯度等电聚焦优点：克服了载体两性电解质阳极漂移，可精确设定PH

准备步骤：样品准备——第一维固相PH梯度——第二维SDS-PAGE——染色考马斯亮蓝——图像分析，自动扫描

优点：可分离10～100 kD 范围内蛋白质；高灵敏度和高分辨率；便于计算机进行图像分析处理；与质谱分析匹配缺点：极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化

创新药物研发中的难点

一、杂质分析

杂质分类：无机杂质（试剂、配位体、催化剂、重金属、其他金属、无机盐、活性炭）、有机杂质（起始原料、副产物、中间体、降解产物、试剂、配位体、催化剂、几何异构立体异构）残留杂质

已鉴定杂质：已确证了结构特征的杂质

特定杂质：在质量标准中规定杂质并有自己限度标准的杂质已鉴定或未鉴定

潜在杂质：按照理论推测在生产或储藏过程中可能产生的杂质，实际生产中不一定存在