【培训课件-临床基因组学】_临床基因组学-Sanger测序及高通量测序技术-广州医学大学

第二代测序 Next Generation Sequencing (NGS)
二代半测 序
Hale Waihona Puke Baidu
半导体测序技术
第三代测序 Third Generation
Sequencing
人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入了基因组学时代
第一代测序
传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在其基础上发展起来的各种DNA 测序 技术，统称为第一代DNA 测序技术。
1)开发了蛋白质化学结构的测量方法、并测定了胰岛素的氨基酸序列，从而确定胰岛素的分子结构。
2)发明了测定DNA序列的双脱氧链终止法，该方法对人类基因组计划功不可没，因此被称为基因组学之父。
dNTP vs ddNTP
DNA 聚合酶I 能够催化脱氧核苷三磷酸
(deoxyribonucleoside triphosphate, dNTP)核糖上第3 位的羟基与下 一个dNTP 核糖上第5 位的磷酸羟基之间脱 水缩合形成3′,5′-磷酸二酯键，通过磷酸二酯 键的不断形成DNA按5′→3′方向不断延伸。
第一节 核酸测序技术的发展
基因测序的前世今生
测序作为基因组研究的基石，每一次技术的变革都对该领域产生巨大的推动作用。
一般来说，人们将测序技术发展分为三个阶段（三代）
一代、二代、三代测序技术是人为规定区分的，主要依据是测序过程中对碱基信号识别方法的不同来区分的。
第一代测序 Sanger
Sequencing
基于Sanger 测序原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，大大提高了DNA 测序的速度 和准确性
➢ 第一代测序仪的第2个版本出现在20世纪末
以集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳，灵敏度更高，测序过程更加快速，并可实现在线检测，自动化程 度更高
第一代测序
近20 多年来，ABI 公司(Thermo Fisher Scientific)提供了各种系统，以应对遗传分析应用扩展并满足如今不断 变化的研究环境的需要，成为遗传分析领域的引领者。
第二代测序与第三代测序之间最主要的区别是测序模板：
前者使用的模板是PCR 产物， 后者测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序
三代测序主要平台：
美国螺旋生物公司（Helicos BioScience ）开发的tSMS技术(ture Single Molecule Sequencing)、 美国太平洋生物公司（Pacific Biosciences ）开发的SMRT 技术(Single-Molecule Sequencing in Real Time) 英国牛津纳米孔公司（Oxford Nanopore Technologies ）公司开发的纳米孔单分子技术(nanopore sequencing)
单分子实时测序
特点
读长较长，检测通量中等，单 孔成本低，适用于少数基因的 少量位点测序
大 高点可规 ，的自模 开测动平 机序完行 运，成测 行由数序 成生据， 本物分检 高信析测 ，息通 适技量 用术高 于处， 多理检 基产测 因生灵 、的敏 多数度 位据，读 检 83长测%）长通；，量开特高机别，运适准行合确成性de本n低o很v（o高测81序%-，
➢ 成熟的DNA 测序技术始于20 世纪70 年代中期——
1976-1977年，美国科学家Maxam 和Gilbert 报道了通过化学降解测定DNA 序列的方法。 1977 年，英国科学家Sanger 发明了双脱氧核苷酸链终止法（同位素标记，在第一台全自动测序仪出现之前，使用最为广泛）
➢ 最早版本的第一代测序仪发明于20 世纪80 年代中期
应用范围
研究和临床检测
研究和临床检测
目前只用于研究
第二节 Sanger测序 双脱氧核苷酸链终止法
Sanger测序是DNA测序技术的金标准，曾在人类基因组计划中发挥了关键推动作用， 目前仍被用来获得高度准确且可信赖的测序数据。
Fred Sanger
1958年
1980年
Frederick (Fred) Sanger, twice winner of the Nobel Prize in Chemistry—the first in 1958, for revealing that proteins have a unique molecular structure, and the second in 1980, for developing the knowhow for sequencing DNA.
临床基因组学
Sanger测序及高通量测序技术
内容
第一节 核酸测序技术的发展 第二节 Sanger测序技术 第三节 高通量测序技术及其应用
教学目的
1. 了解核酸测序技术的发展 2. 掌握Sanger 测序及高通量测序的原理 3.了解Sanger测序结果的分析 4.了解高通量测序结果的分析 5. 了解核酸测序技术的意义及其在临床上的应用
第三代测序
Oxford nanopore 掌上测序仪 MinION
PacBio RS II: the original long-read sequencer
三代测序技术的比较
一代测序
二代测序（NGS）
三代测序（3GS)
技术原理 Sanger测序法+毛细管电泳
Roche454：高通量焦磷酸测序； Illumina：桥接PCR+边合成边测序； IonTorrent：H+电位信号检测+半导体芯片
第一代测序与第二代测序之间的主要差别是测序通量：
前者每个反应 仅测一个DNA 片段 后者每次反应可检测几百万个DNA 片段
第二代测序
Roche 454 焦磷酸测序 ABI SOLiD 连接法测序
ABI ion torrent 半导体测序
Illumina SBS测序
第三代测序
第三代测序技术是指单分子测序技术，也被称为下下代测序 (Next-Next-generation sequencing)
Applied Biosystems® 3730系列基因分析仪
Applied Biosystems® 3500xl 系列基因分析 仪
第二代测序
进入21 世纪，以Roche 公司的454 技术、Illumina 公司的Solexa 技术和ABI 公司的 SOLiD 技术为标志，诞生了第二代DNA 测序技术（next generation sequencing， NGS）