杂交瘤细胞的复苏与冻存
杂交瘤细胞培养注意事项
杂交瘤细胞培养注意事项1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。
此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。
如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）选择进口产品。
3. 离心前须加入少量培养液。
细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。
4. 离心问题：目前主要有两种见解。
一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第2天换液。
因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。
此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。
另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。
我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。
5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。
6. 复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。
7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。
所以如果你的冻存液的浓度是10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。
杂交瘤细胞的冻存与复苏
1．杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。
因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。
如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。
杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含
1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以装一支安瓿冻存。
细胞冻存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。
冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。
冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。
也可用细胞冻存装置进行冻存。
冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。
2．细胞复苏方法将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5%CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。
杂交瘤技术基本程序与方法
杂交瘤技术基本程序与方法一、杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。
1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。
他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。
融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。
在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HA T培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。
实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。
用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。
生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。
这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。
细胞冻存和复苏的原则
细胞冻存和复苏的原则细胞冻存和复苏是一种先进的技术，可以将细胞保存在极低温下，并在需要时重新复苏。
它在医学和科学研究领域有着广泛的应用，包括细胞治疗、尸体保存和生物研究等。
然而，细胞冻存和复苏并不是一件简单的事情，它涉及到许多原则和技术。
本文将介绍细胞冻存和复苏的原则和一些常见的方法。
细胞冻存的原则主要包括细胞处理、冷冻保护剂和冷冻过程等。
1.细胞处理：在冻存细胞之前，需要进行适当的处理。
首先，需要确保细胞的纯度和活力。
通常使用细胞培养的方法，将细胞培养至富有生长活力的阶段，然后进行冷冻。
同时，还需要对细胞进行适当的处理，如细胞除膜、固定细胞骨架等，以增加细胞的抵抗力。
2.冷冻保护剂：冷冻保护剂是一种在冷冻过程中起到保护细胞的作用的物质。
常见的冷冻保护剂包括甘油、DMSO（二甲基亚砜）和微生物发酵的液体。
这些保护剂可以减少细胞在冷冻过程中的损伤，防止冰晶的形成，从而保证细胞的完整性和功能。
在添加保护剂时，通常需要控制浓度和时间，以避免对细胞的毒性。
3.冷冻过程：冷冻过程是细胞冻存的核心环节。
一般来说，冷冻过程需要经历冷冻速率的调控、冷冻温度的选择和冷冻存储条件的维护等步骤。
细胞的冷冻速率是决定细胞成活率的一个重要因素，过快或过慢的冷冻速率都会导致细胞死亡。
冷冻温度的选择也非常重要，通常选择深度冷冻，即将细胞冰冻至极低温下，以防止细胞的新陈代谢和生物活动。
冷冻存储条件的维护是确保细胞冷冻的安全和稳定性的关键，包括低温保存、无菌保存和无氧保存等。
细胞复苏的原则主要包括解冻过程和恢复过程等。
1.解冻过程：解冻过程是将冷冻细胞重新回温至正常温度的过程。
在解冻过程中，需要控制解冻速率和解冻温度，以避免细胞的损伤。
解冻速率过快或温度过高都会导致冰晶的形成和细胞的破坏。
因此，解冻过程需要缓慢而温和，可以通过温水浴、离心和悬液稀释等方法进行。
2.恢复过程：细胞在解冻后需要进行恢复过程，以恢复其正常的生理和生化功能。
细胞冻存与复苏的主要操作步骤
细胞冻存与复苏的主要操作步骤细胞冻存和复苏听起来像是高深的科学术语，其实说白了，就像把细胞装进冰箱里暂时“冷藏”，然后再拿出来“解冻”一样。
这样做的目的，是为了保存细胞的活性和功能，方便未来的研究或治疗。
那具体怎么操作呢？来，我给你一步步拆解这门科学。
1. 细胞冻存1.1 准备工作首先，你得确保你手头有一切所需的材料。
想象一下，你要出门旅行，得先把行李打包好对吧？冻存细胞也是一样，你需要准备冻存管、冻存液（通常是含有二甲基亚砜（DMSO）的冻存液）、冷冻设备等。
1.2 细胞收集接下来就是收集细胞了。
像是在收集宝贵的珍珠一样，你要小心翼翼地操作。
取出细胞时，要确保培养基是温暖的，细胞在里面像小鱼在水中一样舒适。
把细胞离心后，用吸管轻轻地取出细胞沉淀物，别弄成一团糟。
此时，你的细胞就像小小的珍宝，正准备“打包”进冻存管。
1.3 冻存液准备冻存液的准备很重要。
通常，冻存液里含有二甲基亚砜（DMSO），它能帮助保护细胞免受冷冻过程中冰晶形成的伤害。
用时，一般是按照比例混合好，倒入已经准备好的细胞悬液中，搅拌均匀。
这就像是给你的细胞穿上一件防寒大衣，确保它们在寒冷的“冰箱”里不会感冒。
1.4 冻存过程好了，液体准备好了，接下来就要将细胞放入冻存管中，然后开始冷冻过程了。
细胞冻存管要放进预冷的冰箱里，逐渐降温。
这时候，温度得降得非常缓慢，不能急功近利。
通常，我们会在80°C的冰箱里慢慢降温，直到彻底冻住。
记住，冷冻过程就像等待一锅慢炖汤，急不得。
2. 细胞复苏2.1 取出冻存管当你需要使用冻存的细胞时，首先要把冻存管从冷冻设备里拿出来。
这个步骤就像你从冰箱里拿出刚冷藏好的冰淇淋。
速度要快，不然细胞受热时间过长，可能会损失活性。
拿出来后，立刻放入37°C的水浴中，快速解冻。
2.2 解冻解冻的时候，就像把冰淇淋从冰箱里拿出来放在桌上，过一会儿就开始变得柔软。
细胞的冻存管要在水浴中不断摇晃，确保液体均匀加热。
细胞冷冻及复苏操作流程
细胞冷冻及复苏操作流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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杂交瘤细胞冻存时间长短对其复苏后成活率的影响
摘要杂交瘤细胞通常是由小鼠骨髓瘤细胞与脾脏细胞融合产生的。
杂交瘤细胞分泌产生的单克隆抗体具有诸多优点，这也使得其在医学上应用广泛。
产生单克隆抗体的融合细胞可以在液氮中冻存，达到随取随用的效果，但融合细胞的冻存时间长短可能会对复苏后细胞的成活率有很大的影响。
本实验旨在测定不同冻存时间杂交瘤细胞复苏后的成活率，从而保证在杂交瘤细胞复苏成活率较高的时间期限内将细胞及时的取用，防止杂交瘤细胞由于冻存时间太长而失效。
关键词杂交瘤细胞、单克隆抗体、抗体筛选、原代培养、传代培养、冻存时间、复苏、成活率、细胞计数实验目的1.熟悉细胞融合的步骤以及产生单克隆抗体骨髓瘤细胞的筛选；2.掌握对骨髓瘤细胞进行原代及传代培养的方法；3.熟悉细胞冻存与复苏的实验操作；4.熟练掌握细胞成活率测定的方法。
实验原理A.杂交瘤细胞的制备杂交瘤技术即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。
它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。
Kohler和Milstein证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。
这一技术的基础是细胞融合技术。
骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。
如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。
杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。
这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B 淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。
在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
杂交瘤细胞培养过程的问题、原因及解决方法
杂交瘤细胞培养过程中遇到的问题、产生的原因及解决办法1.杂交瘤细胞初次培养及复苏效果不佳，如何解决此问题？解析：杂交瘤细胞系种类繁多，并不是所有的细胞系都能直接适应无血清培养基，如无法适应请先按照购买公司驯化适应程序进行细胞驯化，驯化后的细胞即可完全适应本公司的无血培养基。
复苏问题：如冻存的杂交瘤细胞活率较低，复苏时可加5%胎牛血清于无血清培养基中，可修复受损细胞的状态，细胞复苏时接种密度要求大于1x105cells/mL，可保证更好的复苏率。
2.杂交瘤细胞传代最低接种密度是多少？最佳的接种密度是多少？解析：经过我们反复测试，最低接种密度极限值,1x104cells/mL，此密度仍可正常培养杂交瘤细胞，但细胞生长周期较长，6-7天达到峰值。
最佳接种密度为1-2x105cells/mL，3-4天可达到峰值，细胞生长周期短，适合工业客户。
3.无血清培养杂交瘤细胞最大生长支持密度多少？怎么我养的几种杂交瘤细胞差距很大？解析：由于杂交瘤细胞系种类繁多，不同的细胞系最大生长密度也不一致，目前我们测试的细胞株最高的密度可到3x106cells/mL，最低的密度在1.6x106cells/mL。
这取决于所培养的细胞株本身的特性。
4.我培养的杂交瘤细胞抗体表达量总是很低，有办法进一步提高抗体表达量吗？解析：北京友康公司在杂交瘤细胞培养方面，引入了全新的培养袋法，IgG 表达量可从300~400mg/L提高到480~520mg/L，我们可提供相关技术支持。
5.贵公司无血清培养杂交瘤细胞抗体表达一般在什么水平？目前我公司测试的两株细胞系，IgG抗体最高表达量在480~520mg/L，国外培养基IgG抗体最高表达水平在400~500mg/L，我公司的产品在抗体表达量上有明显的优势。
友康恒业生物科技（北京）有限公司渠道部。
细胞冻存与复苏的主要操作步骤
细胞冻存与复苏的主要操作步骤嘿，大家好！今天我们来聊聊细胞冻存和复苏的那些事儿，别担心，我会把这些操作讲得通俗易懂，带点幽默感，让你听得轻松又开心。
准备好了吗？那我们就开始吧！1. 细胞冻存的准备工作1.1 细胞的准备首先，细胞冻存之前，你得准备好你的“细胞宝宝”。
这就像给小朋友穿上厚厚的冬衣，你得确保细胞们在冻存前的状态良好。
先要确认细胞生长得旺盛、状态好，这样冻存后复苏才不会掉链子。
别让它们觉得自己快要去北极了，还是要保持好心情哦！1.2 冻存液的配制接下来，你得准备冻存液。
这东西就像给细胞们准备的“冰淇淋”，它的作用是防止细胞在冷冻过程中被冻坏。
通常冻存液里会有含有保护细胞的成分，比如二甲基亚砜（DMSO）或者甘油。
把这些成分混合在一起，就像调制一杯鸡尾酒，让细胞在寒冷中也能有滋有味地待着。
2. 细胞冻存的操作2.1 冻存前的处理冻存的过程开始啦！首先，你得把细胞从培养瓶里取出，像搬家一样，把它们小心放入冻存管里。
记住，操作时要尽量轻柔，别让细胞们觉得自己被“抛弃”了。
然后，把之前准备好的冻存液加入细胞管中，确保每个细胞都得到“冬衣”的保护。
2.2 冷冻过程现在来到了关键一步，冷冻！这个过程就像给细胞们上“冰雪世界”的体验了。
细胞管要放进冷冻箱中，逐渐降低温度，最好是每分钟下降1°C，这样可以防止细胞内形成大的冰晶，保护细胞不受伤害。
记得设置好降温曲线，确保细胞们能平安度过寒冬。
3. 细胞复苏的操作3.1 复苏前的准备好了，细胞们在冷冻中已经度过了漫长的冬季，现在该是复苏的时候了。
首先，你得把冻存管从冷冻箱里取出来，像迎接老朋友一样，准备好温暖的环境。
复苏液的温度要在37°C左右，就像给细胞们提供一个温暖的春天。
3.2 细胞复苏最后一步是复苏！把冻存管放在37°C的水浴中，温柔地摇晃一下，直到细胞液完全融化。
注意啊，动作要轻柔，千万别让细胞感到惊吓。
然后，把细胞转移到预热的培养基中，让它们重新恢复生长。
杂交瘤细胞的培养,保存和复苏
杂交瘤细胞培养冻存与复苏杂交瘤细胞适用于无血清的培养基，无血清培养的基础培养基和添加物质杂交瘤细胞的无血清培养基通常是在标准的基础培养基中添加小分子和大分子物质，以代替血清的各种功能。
不同基础培养基对细胞的无血清培养有一定的影响。
不同细胞系对基础培养基也有选择性。
最常用的基础培养基有RPMI 1640，F12，IMDM，DMEM+F12,DMEM+F12+RPMI 1640。
形成的无血清培养基常能支持杂交瘤细胞在分批培养中生长到1×106细胞/ml以上，最终的单抗浓度可达10 μg/ml~100 μg/ml。
基本上你说的那两种都有可能，你可以参考以下操作：【转贴】细胞融合和杂交瘤细胞培养用试剂的配制① RPMI-1640基础培养液，1 000mlRPMI-1640粉10.4g丙酮酸钠0.11g用900ml三蒸水(或无离子水再经过双蒸)，通CO2搅拌溶解。
称取1.8g NaHCO3，用少量三蒸水溶解，边搅拌边加入1640液中。
补足1 000ml，通过0.22μm滤膜正压过滤除菌 (用CO2钢瓶加压)，分装，置30℃，菌检48小时4℃存放。
效期不超过三个月。
② RPMI-1640完全培养液，100ml双抗(青、链霉素)0.1ml3％L-谷氨酰胺2.5ml犊牛血清15.0ml1640基础培养液81.5ml用时现配，4℃下存放不超过一周，用于细胞融合和克隆化培养的全培养液，可将小牛血清增至20％。
③ 200mmol/L(3％)L-谷氨酰胺溶液L-谷氨酰胺5.846g三蒸水200ml加热至50℃使全溶，0.22μm膜滤除菌，按每管4ml分装，-20℃保存。
④双抗溶液青霉素(钠盐)100万iu链霉素(硫酸盐)1g溶于100ml灭菌三蒸水中，小量分装，-20℃冻存。
杂交瘤细胞的保存当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。
杂交瘤细胞生产抗体技术细胞筛选
杂交瘤细胞生产抗体技术细胞筛选杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。
抗体检测的方法很多，通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定。
但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便，便于一次处理大量样品等特点。
因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报告结果，以便决定杂交瘤细胞的取舍。
所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。
一般说来，在融合之前就必须建立好抗体检测方法，并克服可能存在的问题。
另一个重要问题是抗体检测方法所需要的“动力学范围”，即检出背景以上的最强与最弱信号之比，依所用的检测抗原是否纯净而定。
如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的，100%的抗原参与反应，一个阳性/阴性判别系统就够了。
另一方面，如果杂交瘤抗体是针对细胞表面微量的蛋白抗原，检测系统可能需要能测出微弱信号，则动力学范围至少应为10：1，最好为100：1。
另外，检测方法的选择还受所需杂交瘤抗体的类型和预定的用途的影响。
结合补体的抗体可以用基于细胞毒性反应的检测方法来选出。
如需结合A蛋白的杂交瘤抗体，就要用结合蛋白A的检测方法。
杂交瘤细胞的冻存与复苏（1）杂交瘤细胞的冻存在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故，如停电、污染、培养箱的温度或CO2控制器失灵等给正在建立中的杂交瘤带来灾难，通常尽可能早地冻存一部分细胞作为种子，以免遭到不测。
在杂交瘤细胞建立以后，更需要冻存一大批，以备今后随时取用。
细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度（0℃—— -20℃，每分钟下降1℃；-20℃—— -40℃每分钟下降2℃），可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。
下面介绍我们实验室的细胞冻存方法，经几年来对多种细胞的使用，细胞复苏存活率均在80%以上。
杂交瘤技术(hybridoma technique)基本程序与方法 5
杂交瘤技术（hybridoma technique）基本程序与方法 5（3）间接血凝试验间接血凝试验又称被动血凝试验（PHA），是目前应用较广的检测方法之一。
本试验是以包被可溶性抗原的红细胞作为指示系统，当被检抗体与包被在红细胞上的抗原产生特异性反应时，导致红细胞呈凝集现象。
可见，该法具有灵敏、快速、容易操作和无需昂贵仪器等优点，而且经改用醛化红细胞以后，克服原来重复性差的缺点。
①器材和试剂a、绵羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。
b、缓冲液：PBS（PH7.2）；醋酸缓冲液。
c、甲醛，丙酮醛，NaN3，抗凝剂等。
d、血凝板，振荡器等。
②多糖抗原的间接血凝试验a、甲醛化绵羊红细胞的制备：无菌采集绵羊颈静脉血50ml，用枸橼酸钠作抗凝剂；用5倍于红细胞压积的PH7.2 PBS（Na2HPO4•12H2O 3.58g，KH2PO4 0.41g，NaCl 8.01g，蒸馏水1000ml）充分洗涤5次，每次1500r/min 5-10分钟，直至上清测定无蛋白质（用饱和硫酸铵滴定上清，观察有无白色沉淀），再以相同缓冲液配成25%红细胞悬液；将25%红细胞悬液与20%甲醛以2.5：1的比例混匀，37℃水浴作用2小时，每15分钟振荡一次，红细胞颜色逐渐由鲜红色转变为棕色；以PH7.2 PBS洗涤4次，每次2000r/min 10分钟，再以同样的PBS制成25%红细胞悬液；其后，重复醛化一次，方法同前；最后配成20%醛化绵羊红细胞悬液，加甲醛至0.3%防腐，4℃保存备用。
b、脂多糖抗原致敏甲醛化绵羊红细胞的制备：取脂多糖（LPS），以0. 2mol/L PH8.0 PB液，调整多糖浓度至120ug/ml，然后100℃水浴处理1小时；将冷却至37℃的热处理LPS与6%醛化红细胞等量混合，37℃搅拌作用45分钟；取出离心2000r/min 10分钟，以0.01mol/L PH7.2 PBS洗涤4次；配制成4%致敏血球，分装，保存于4℃备用，或冻干保存。
单克隆抗体制备——细胞株的冻存与复苏24
细胞株的冻存与复苏1. 细胞株的冻存：杂交瘤细胞冻存是单抗中重要环节。
1.1 将处于对数生长期的杂交瘤细胞重悬起来，1,500rpm离心5min，去除上清。
1.2 加入适量的细胞冻存液（10% DMSO，20%～50%胎牛血清，1640培养基），轻轻吹打重悬细胞，使终浓度达到0.5～1×107个/ml。
1.3 将细胞分装入细胞专用冻存管，每管1.0～1.5ml，在管子上标准细胞名称、冻存日期和冻存人。
1.4 冻存降温程序：-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。
（如果实验室的实验条件受限，可以采取以下的操作流程：-20℃冰箱2h ，-70℃冰箱过夜，然后移入液氮中；还可以直接将细胞冻存管裹上厚厚的棉套，直接放入-80℃冰箱过夜，次日转入液氮保存；细胞冻存中常用冻存液为DMSO,DMSO的纯度对冻存细胞至关重要，建议使用细胞冻存专用级别的；细胞融合孔检测到阳性，如果来不及亚克隆往往只能忍痛看着细胞株丢失，为了解决此类问题专门研发96孔板整板细胞冻存液，冻存液使用方便，加入冻存板直接放入-80℃冰箱即可。
）2. 单克隆细胞株细胞复苏2.1 从液氮容器中取出细胞冻存管，迅速浸入37℃温水中不断摇动令其尽快融化。
2.2 待其完全融化，取出冻存管，打开盖子，吸取细胞悬液转移到离心管，并滴加10倍以上不完全培养基，混匀。
2.3 离心，1,500rpm，5min。
2.4 弃上清液，加入含10%胎牛血清完全培养基重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种到培养瓶中，37℃培养箱静置培养。
2.5 次日更换一次培养液，继续培养。
（将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤。
冻存和复苏最好用新配制的培养液。
）。
细胞冻存与复苏步骤 原理及注意事项
细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项细胞冻存与复苏步骤.原理及注意事项培育细胞的冷冻保存与衰退polge等人（1949）发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用，他们仍然以精子进行研究发现，加入甘油能够大大提高贮存于-790c下精子的存活率。
接下来的重大进展是luyet（1951）与lovelock（1953）等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。
他们的结论是，电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。
冷冻理论后来得到merryman（1956）、rey（1957）以及smith（1961）等学者的继续和发展。
1949年至1960年这一段时间可以称作冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存通常都就是以甘油做为保护剂。
lovelock（1959）等人辨认出了一种代莱化学保护剂，这就是人们熟识的二甲基亚砜（dmso）。
而且，用作冷冻保存的仪器也存有显著的发展。
目前，无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷藏用品和设备以及各种生物材料的留存与衰退技术都已十分明朗和完善。
冷冻保存与复苏原理在高于-700c的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至中止。
水在高于零度的条件下能结冰。
如果将细胞漂浮在纯水中，随着温度的减少，细胞内外的水分都会结冰，所构成的冰晶可以导致细胞膜和细胞器的毁坏而引发细胞死亡。
这种因细胞内部结冰而引致的细胞受损称作细胞内冰晶的受损。
如果将细胞漂浮在溶液中，随着温度的减少，细胞外部的水分可以首先结冰，从而使未结冰的溶液中电解质浓度增高。
如果将细胞曝露在这样低溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子可以受损毁，细胞便出现渗水，在复温时，大量水分可以因此步入细胞内，导致细胞死亡。
这种因留存溶液中溶质浓度增高而引致的细胞受损称作溶质受损或表示溶液受损。
当温度进一步上升，细胞内外都结冰，产生冰晶受损。
但是如果在溶液中重新加入冷藏保护剂，则可以维护细胞免遭溶质受损和冰晶损伤。
细胞冻存与复苏
细胞冻存与复苏高博，苏州大学医学部药学院药理学系冻存（1）传统方法：冷存管置于4℃，10 min→ -20℃，30 min→ -80℃ 16～18 h（或隔夜）→液氮罐长期储存。
-20℃不可超过1 h，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/min之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮罐中长期储存。
适用于悬浮型细胞与杂交瘤之保存。
一、步骤：（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
（2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，终浓度为10 %，混合均匀，置于室温下待用。
（3）依细胞传代培养操作，收集培养细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1 ml）计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
二、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（对数生长期，logphase）且存活率高之状态，约为80～90%致密度。
（2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如杂交瘤应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
（3）注意冷冻保护剂之品质。
DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22 micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10 ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。
甘油（Glycerol）亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。
在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
复苏1、从液氮中取出冻存管、迅速置于37℃温水中并不断搅动。
使冻存管中的冻存物在1 min之内融化。
2、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
常规细胞冻存和复苏方法
常规冻存方法下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例，介绍常规冻存细胞的详细过程。
✧主要材料（1）仪器设备：普通冰箱和-700C～-800C超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机等；（2）冻存管：容量为1ml或1.5ml；（3）冷冻保护液：一般是以5份小牛血清、4份细胞培养基与1份DMSO 混合而成。
现配现用，或配制后放入普通冰箱冰盒内冷冻保存。
使用前，于室温下水浴溶解；（4）待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。
✧操作过程1.待冻存细胞悬液的制备(1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；(2)将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；(3)向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml；(4)按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；(5)在冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。
2.分级冷冻(1)先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），约30min；(2)接着将冻存管臵于普通冰箱冷冻室（-100C～-200C），约30～60min；(3)将冻存管转入低温冰箱（-800C），放臵过夜；(4)最后将冻存管投入液氮保存。
3.记录做好冻存记录。
记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位臵以及操作人员。
✧冻存结果如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。
✧讨论在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。
高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。
在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。
在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。
若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。
操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。
应注意控制冻存细胞的质量。
既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤细胞冻存是将细胞保存在极低的温度下，以延缓其新陈代谢过程，从而达到长期保藏的目的。
细胞复苏则是将冻存的细胞重新恢复到正常生活状态的过程。
下面将详细介绍细胞冻存和细胞复苏的方法步骤。
细胞冻存的方法步骤：1.细胞培养：首先，需要获得足够数量和质量的细胞进行冻存。
通过细胞培养技术，将细胞培养在含有适当营养物质的培养基中，使其生长繁殖。
2.细胞分离和检测：将细胞从培养基中分离出来，并进行质量检测，确保细胞的纯度和活力。
3.冻存液的制备：制备适当的冻存液，通常是含有细胞保护剂的冻存液，可以起到保护细胞免受低温伤害的作用。
4.冻存管的准备：准备干净的冻存管，并确保管内没有污染物。
5.细胞冻存：将细胞悬浮液和冻存液混合，将混合液加入冻存管中。
随后，将管子放入冷冻器中，逐渐降低温度，使其达到细胞存活所需的最低温度，通常为液氮温度（-196℃）。
6.冻存管理：冻存后的细胞需要进行管理，包括记录存储位置、维护存档和监测保存条件等。
细胞复苏的方法步骤：1.细胞解冻：将冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的温水中，并轻轻摇晃，以加快冻存液的溶解。
待细胞解冻完成后，立即将细胞转移到含有培养基的离心管中。
2.细胞复苏培养：将细胞悬浮液转移到培养基中，然后放入培养箱中进行培养。
培养基的组成与之前的培养条件相似，以帮助细胞适应新的环境。
3.细胞复苏检测：在细胞复苏后的一段时间内，需要对细胞进行监测和检测，包括细胞存活率、生长状况、形态特征等。
4.细胞复苏管理：对细胞进行管理和维护，包括定期更换培养基、检测细胞的多项指标、记录细胞的生长状态等，以确保细胞的健康状态和长期保存。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤需要严格控制和执行，以保证细胞的活性和质量。
冻存和复苏过程中的温度、冻存液的配方、时间等因素都会对细胞的生存和恢复产生影响，因此，在实施这些方法时需要权衡各种参数，并根据具体情况进行调整和优化。
同时，冻存和复苏过程中的操作要保持无菌、无污染，以保证细胞的无菌状态和纯度。
杂交瘤单克隆抗体研制中细胞的冻存与复苏
杂交瘤单克隆抗体研制中细胞的冻存与复苏
余荣汉
【期刊名称】《生物学杂志》
【年(卷),期】1989(000)002
【摘要】细胞的冻存与复苏是杂交瘤单克隆抗体(MCAb)研制中的一个重要环节.
如果这个问题不解决,不但融合得不到成功,而且得到有价值的杂交瘤也会丧失掉.一、细胞的冻存在液氮中冷冻是保存杂交瘤细胞(或骨髓瘤细胞)最好的方法.在MCAb
的研制中,一旦测得较有价值的阳性孔,就要一面进行克隆化,一面扩大培养,并冻存起来。
【总页数】2页(P27-28)
【作者】余荣汉
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】R954
【相关文献】
1.抗旋毛虫单克隆抗体杂交瘤细胞系复苏方法的探讨 [J], 李春华
2.单克隆抗体研制中杂交瘤细胞的冻存与复苏 [J], 谢琴;何存利
3.抗堆型艾美球虫子孢子单克隆抗体杂交瘤细胞的复苏及其活性的初步鉴定 [J],
康桂英;秦建华;翟丽娟;钟罡;赵静雯;梅花
4.杂交瘤细胞的复苏及分泌单克隆抗体稳定性的观察 [J], 方美玉;陈翠华;李冬山;
饶颐年
5.不同温度冻存对杂交瘤细胞及其单克隆抗体活力的影响 [J], 张文元;杨亚冬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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杂交瘤细胞的复苏与冻存
一． 杂交瘤细胞的复苏
杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。
复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的-5℃—0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。
通常情况下，冻存时细胞数量多，生长状态好的杂交瘤细胞系以及其他细胞的复苏可采用以下方法，这也是各个实验室普遍采用的程序。
不过，冻存的细胞并不都能100%复苏成功，其原因较多，如冻存时细胞数量少或生长状态不良，或复苏时培养条件改变或方法不当，也可能细胞受细菌或支原体污染，以及液氮罐保管不善等。
在出现上述情况时，可采用一些补救方法复苏这些细胞，如小鼠皮下形成实体瘤法，脾内接种法，小鼠腹腔诱生腹水和实体瘤法，以及96孔板培养法等。
二 杂交瘤细胞的冻存
细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度（0℃- -20℃，每分钟下降1℃；-20℃--40℃每分钟下降2℃），可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。
下面的细胞冻存方法，细胞复苏存活率均在80%以上。
1.材料：
带盖吸管筒一只（铝质或洋铁皮制），内壁（包括筒底和盖）衬1-2层石棉纸或石棉布； 含10-20%血清、5-10% DMSO 的HT 培养基，冰浴降温至0℃左右（用作冻存液）；灭菌安瓶或带盖小瓶；-70℃冰箱；液氮及液氮罐；处于对数生长中期、健康而活力好的杂交瘤细胞。
方法：复苏时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴融化，待最后一点冰块快要融化时，从水浴中取出，置冰浴上。
用5-10ml HT 培养基稀释，1000r/min 10分钟，弃上清，再悬浮于适量HT 培养基中，转入培养瓶或24孔板，置37℃，7.5% CO2培养。
如果细胞存活力不高，死细胞太多，可加104-105/ml 小鼠腹腔细胞进行培养。
2、方法：
（1）. 将杂交瘤细胞（或其他细胞）离心，重新悬浮于预冷的冻存液中，浓度为106-107左右/ml ，分装安瓶，每瓶1ml ，置冰浴上；安瓶上标明细胞名称、冻存日期、批号等。
（2）安瓶封口后仍置冰浴上。
（3）将安瓶放入一带收口绳的小布袋内，布袋上标明冻存号、细胞名称等，立即将布袋放入吸管筒内，置-70℃冰箱。
（4）2-4小时后或过夜后从-70℃冰箱取出吸管筒，将盛有细胞的布袋移入液氮罐；在布袋的线绳上作好标记或代码；最后在液氮冻存簿上作详细记录。
（5）液氮罐应定期补充液氮（最好是专人管理）；补充液氮及存取细胞时应带保护眼镜。