免疫组化标准化染色操作_张丽芳

在此
, ,
情况
,
表 明是 不 当 的 固定 导 致 抗 原 破坏
。
操 作 单一
ei 验中应 常 规 加入 v i m n t 染色 n
用 于 指 导 观 察福 尔 马 林 固
我 们 必须 清楚 影 响 抗 原性 的 因 素及 各种 抗 原 修 复 的方法
定后杭 原 表 达 敏 感性情况
1
严格按 照 抗 体 说 明 书进行 抗 原 修 复
,
物质 所 具 有 的抗 原 性 主 要 由分布在 杭 原 表 面 的抗原 决 定簇决定 的可 靠性 原 修复
,
原 表达 的敏 感性
V im
按 福 尔马 林 固 定 后 抗原 损 伤 的 程 度 来 进
几 乎 在 任何 组 织 中 都 有 表 达
。
抗原 修 复 的 好 坏 直 接 影 响着免疫 组 化检 测 结果 在进 行 免 疫组 化 时 并 非所有 的 抗 原 都要 进行 抗
、
6 0 ℃ 一 6 5 ℃ 烤箱 中烤片 3 0 一 6 0
分钟 左 右
。
温 度过 高或 时 间
特别是 即用 型 试 剂 盒 的 出 现 使 抗 体 的 标 记 更 加 简便
捷 规 范化 试剂厂家
、 、
快
、
过 长 均会影响抗原 的活 性
,
原因 是 在高 温 干 操 条 件 下可 以
。
。
但 是 由于 它 是 一 个 多 步 骤
PB S
、
整个免疫组 化 过程步骤较 多
行 冲洗 步 骤 加入
A BC
、
防 止 因 冲 洗 不净 引 起 的 背 景着色
。
缓 冲液 中
每 步应 接操 作 要 求 严格 操 作 可 以 减 少 背景 染 色 外
,
脱 错 时 间一 定 要 充 分
,
每步
,
Twe
.
2 0 可 以增强 冲洗 效果 n
冲洗 时 间 次 数 一 定 不 能省 略
4
2
R E
、
PR
、
定位 于 细胞 核 气泡
、
组 织 的周 边
。
刀痕
、
皱 折 等 部位 往 往 呈
,
封闭 效 果 比较 显著
3
.
。
现 非 特 异 性 阳性 表 达
,
3
抗 体使用
:
一 般来说
抗 体应放在 4 ℃ 冰箱 中保
, ,
4
.
3
染色结果 呈 阴 性 并 非 都是 抗原 不表 达
。
要 考虑
存
,
第一 抗体 可 分 成 小 包 装 于 2 0 ℃ 保 存 使用 时 存放 在
显色 剂 D AB 浓 度过 高或 H 2 后 切 片清洗 不干 净
。
家 已 进 行 过多 次 的实验 检 测
。
可按厂 家 提供 的条 件进 行操
,
; ; 伍 太 多 抗 体不 纯 抗 体孵 育
浓 缩 型抗 体 一 般 按 照 厂家 提 供 的 建议 稀 释 度
。
进行 对
。
倍稀释 预 实验
选 定 最 佳 的 稀释 滴度 后 再 进 行 批 量 实 验
于 大多数抗 体
T
) 0
的 优 点是 染 色 背 景 清 晰
,
适合
由和
EDTA
两 种 修 复液 对 部分抗 原 修复
免疫 组化 结 果 的 关 键 因 素 入 固定 液 或 低温 保 存
,
。
组 织 标本离 体 后 3 0
固 定 时间 为 8 一 2 4 h
固定液 为 1 0
一1 0
,
~
效果较 强
,
但其 染色 背景 同时 加 深
,
选择高
或蛋 白分 子 之 间形成 交 联
抗原修 复 方 法 来 修 正
导 致抗原 位 点遮 盖
。
可以 通 过
,
பைடு நூலகம்
值 的修 复液
抗 原 热修复 在 增 强 抗 原决 定簇表达 的 同 时
组 织 中内探 性 生 物 素 的反 应
一
。
也增 强 了
芝 加抗 体 前不采 用 抗 原 修 复
3
一
则免 为防
疫 组 化染 色 常 不能达 到理 想结果 或 不成 功 用于 免疫 组 织化 学 染色的切片 厚度 为
,
失 以使 长期保 存
骤 与常 规
H&E
,
尤 其是用 于 科研
会 出现较大 差 异 建 立 标准化的染 色 程 序
组 化结果更 具 可 靠性和重 复性
。
改 善和 提 高免
免疫
集 中实 验 的切片更 应 注意切 片的 保存 脱 蜡步 骤 相 同
,
免 疫 组 化的脱 蜡 步
,
疫 组 化实验 的可 靠性 使 免疫 组 化 技 术更 具 标准 化 同时为证实抗 体 和 检 测 试剂 盒 效 价是 否 可 靠
有
使 用 的杭 原 修 复缓 冲 液
和EG
pH
但 也不 能 除 外 某 些 抗 体 适 用 于
,
研究发 现 新鲜组 织 经 过福 尔 马林 一 周 固 定 后 组 织 抗原 丢 失 严重
,
TA
缓 冲修 复 液
。
抗原 比 较 难 于表 达 的 抗 体 多
,
抗 原几 乎 不 能被检 测
, ,
,
因 为 组 织 固 定 后 会 引起 蛋 白
作者 单位
:
福 州总 医院病 理科
切 片 中 没 有 出现 类似 的情 况
在 细 胞浆 中呈 均一 的 细 颗 粒
380
状 的浅棕 色 阴性 达很 相似
,
,
有 时表 达也 非 常强
,
,
与真 阳 性 的 结 果 表
。
染 村染 但 不 能 经 有机 溶剂
4 4
.
,
,
容易 退 色
。
在 以往 的 免疫 组 化 染色 中 内源性 生 物素 的影响
.
标记
、
如果
H& E
切 片都 做 不 出 满 意 的染 色 结 果
,
.
那 么免疫
。
组 化 染色也将 无从 谈起
根本 无 法保 证染色 质 量
2
杭原 修 复 缓冲 液
:
理 想 的取材厚度 是 0
n T c
一0 3
.
n y c
。
,
固定的 目 的之 一 是
、
有 柠檬 酸 盐 缓 冲 液 (PH 6
.
0
.
)
3 79
・
豪会 马全 多屯 习忆
・
免 疫组 化标 准 化 染 色 操 作
张 丽芳
免疫 组 化 技术 在 病理 诊断
为 非常重要的 手 段
。 ,
、
基 础 医 学研 究工 作 中 已成
, 、
止在 染 色 过 程 中脱 片
,
需 要 使 用 硅 化 玻 片娘 片
。
切 片在
随着免疫 组 化试剂 出现 及 方 法 的 改 进
性 反应 均为非 特异性染 色
组 织细胞中定 位 的 改变
。
在 其 他部 位 的 阳
,
不 当的 抗原 修 复 会导 致抗 原 在
CD 3
、 、
免疫组化 染 色实 验 操作规范
1 2
,
根据 所检测 抗原 的不 同 抗原 分
C L口0
、
脱蜡
:
二 甲苯一 ~ 酒 精一 , 蒸馏水
:
。
别定 位在 不 同部位
染色 结果 的观 察
1
对诊 断造成 许多 的误 差
。
却常常被 忽略
,
阴性 对 照 片 必 须
阳 性结果应 定 位在 细 胞相应 的 部 位
, 。
,
在细胞 膜
与一 抗的抗原 修复处 理 条 件 完全相 同 才能准 确发现 内源
性生 物素出现 的部位
3
3 3
.
表达 的抗原 阳 性结果应 定位在 细 胞 膜 上
选 用 何 种 抗原 修 复 法
, ,
在 实 际 工作 中
,
,
究竟
,
免疫组 化染色前 处理 技 术 操 作
、
应根 据抗 原 抗 体 种类 予 以 选 择
,
必
良好的取 材 提
,
固定
、
脱 水过 程 是 免 疫 组 化 标 准化 的 前
要时可 以 多种 方 法 同时使用 结果更理 想
。
样 使其 更 具有针 对 性
、
多 因素 决定 的 一
、
加速组 织切 片中抗 原 的 氧化 切 片保存
, ,
种实验方 法
,
由于 各 实验 室 采 用 的 修 复 方 法
。
,
染色 方法
,
实际工 作可 以采 用 蜡封 切 片来避 免抗 原损
也 可 4 ℃ 冰 箱冷 藏保存
。
,
杭体 克 隆号
,
检 测系 统 等 有 所不 同
染色 结 果
作是 否 正确
, ,
免疫组 化 实验室 中脱蜡 需
否则 可能 导 致
与 H & E 常 规 脱蜡分 离 染色 操 染色 结 果 的异常
2
。
,
以 保证 脱 蜡 彻 底
需 要进 行实 验对 照
,
我 们采 用
V
汕。 t n 染色 i
免疫 组化实验 中 的抗 原 修 复
。
作 为 阳性对 照
行分 析
。
目的是 观 察 组 织 经 福 尔马林 固 定 后 预 期 抗
。
如使 用不 当 易 造成假 可 作 为免 疫 组 化 常 规
中性 缓冲 甲醛溶液
,
固 定液的 量 为组 织 块体 积的 4
阳 性结果 的 判断
目前 还 没有 一 种 杭原 修 复液 能适合于 所
.
倍
有 的抗 体
E D TA
,
柠檬 酸 缓冲 液 (p H 6
,
) 0
注意避免福 尔 马 林 过 度 固 定造成 的 组 织 抗 原 丢 失
,
免疫 组 化 显 色是 酶 促 反 应
,
它 通 过 连 结 在 抗 原 抗 体复
AB
染 色 背景深 大 多是抗体 浓 度 过 高 所 致 抗 体 孵 育 温 度 一 般
以 常温 2 5 ℃ 为 基准或 3 7 ℃3 0 分钟
3
.
合物 上 的过氧 化物 醉或碱 性 磷 酸 酶 与底 物 D 本 组 织来 源 不 同
膜 如C
,
:
如 L CA 和
GF A p
、
等 定 位于 细胞
.
内 源性过 氧化 物酶 的消 除 采 用 过 氧 化 物酶 的
必 须 进行 内源性 过 氧化物酶 封 闭处理
,
琳o
一
k r a
e
,
n i t
、
1 5
00
Cg A
。
A FP
等 定 位于 细
检 测 系统
响
,
用0
.
3%
胞质
,
凡
.
7 6
0 分 钟 对 染色结 果及 抗 原 保存都 没 有 影 Z m 作用 切片 1 H
采用 卵 白素
一
i dn i 生 物 素 (A v
bi
,
o t n i
4
微米
。
) 检测 系 统
,
组 织 中内源 性 生物 素容 易 出 现 人为 假
,
象
在 加 热 抗原 处 理 条 件 完 全相 同 的 阴性对 照 片 中可 以 观
没 有 经 过 热抗 原 处 理 的
。
察 到较 强 的 内源性 生物紊 的 反应
。
e n ti n
,
尤 其适 合
。
活 检 组织 中的免疫 组 化 染 色 观 察
在 与 上 皮 组 织 相连 接 的
,
抗原性保存 良好或 基 本 保 存者 不 需 要 修 复
、
抗原
间质 中雕 着 大 量的 血 管 v i
张切 片 的间质中 出现
V im
m
n e
i t
n
可 阳 性 表达
。
如果 在 同 一
,
,
因 此 选择
序
、
抗 体 的特异性
、
方 法 的敏感性
,
发 生反应
。
,
,
也 可 4 ℃ 冰箱 过 夜
, ,
。
生 成 有色 的 复 合物 沉 淀 在 组 织 细 胞 中的抗 原 部 位 细 胞分 化 不 一
。
,
由于 标
显 色反
, 。
,
4
冲 洗 冲 洗 液为 P B S 或 T B S 缓 冲 液 要 严 格执
:
,
抗 原含量 不 等
应所 需 时间不 可 能完 全一 致
0
,
rS T i
,
P印 (
一
8)
、
最 大限度 地 保 存 组 织 细胞 的抗原 性
固定是 制 作好 的 组 织 切片的 基 础
。
及时
恰当
、
完好 的 内应 进
%
。
D E
,
TA
(p H S 0
.
一 9 0
.
)
、
EGTA
(p H g
) 等
组 织 固 定 的 好 坏是 影 响
。
柠檬酸 盐缓 冲 液 (p H 6
、
、
非 生 物素检 测 系 统 价 钱较 贵
, 、
由于 不 需 通
,
m 防止 出 现边 缘 效应 c
组织浸 液 的温 度
。
切 片 烘烤 的 温度控 制
实 验操 作 过
过 生 物素 的结 合
可 以避免 内源性 生 物素的 干 扰
背景低
:
。
其特 点
:
程 中 的室 内温 度及 杭 体 的 效价 等 都是 影 响 免 疫 组 化 标 记 质
敏感
省时
.
方便
量的重要因 素 化的结 果
,
在 实 际 工作 当 中有许 多 因 紊 影 响 着 免 疫 组
、
3
6
显 色系统
DAB
由于 检 测系 统采用 的是辣根 过 氧化
(棕色 ) 和 AE C (红 色 ) 作为酶 的底
NB T
包括 技术 人 员是 否 熟 练 掌 握 整个 实验 的操作 程
物酶 物 存 艳
。
. .
因
、
PBS
液 内含 有 盐
, 。
3
5
检 测 系统
、
:
通 用 的 检 测 系 统有 生 物素 标 记 的 此 类检 测系统较为 经 济
,
滴 加试 剂 时要 均 匀
,
足够
,
要 比切 片 此
P S
l 另A B
。
等
,
,
目前 仍 有不
上 的组 织界 限 宽 出 0 0 5 一0 3 5
少 医 院在使 用
,
是否 与组 织 中的抗 原 受到 破 坏有关
4
.
4℃
不直 接反 复存 放于 4 ℃ 和 一 2 0 ℃ 之间
。
,
反 复冻融 会 使
,
4
组 织 切 片背景 深与 下列 因 素有 关
:
石 蜡切 片脱
,
抗体效 价下跌
作
。
已 有大 量 的即 用 型 抗 体供 实验 室 使 用
厂
蜡 不干净 ; 第 一 抗 体浓 度过 高或孵 育 时 间过 长 温 度 过 高 ;
修复 的方 法 主 要 有 蛋 白酶消化法
复法 和 热 修 复 法 抗 原 经 热 修复 后
。
,
翻 氢 化 钠 (N a B
。
en t ln
染 色 微 弱或部 分 区 域变 弱 的 所 以 在每 批次 实
,
4 ) 修 H
,
我 们采用 采用 较 短 时 间的 热 修复
染色 结 果 更 易 一 致
。
,
细胞