激光共聚焦技术优秀课件
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激光共聚焦技术课件
激光共聚焦技术课件
荧光探针的种类及应用
原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚 细胞形态结构
• 检测蛋白质、抗体及其他分子：荧光蛋白（GFP、
YFP等）
活体细胞或组织功能的实时动态监测
• 实时定量测定细胞内Ca2+变化：fluo-3/AM，fura-2
激光共聚焦技术课件
荧光探针标记样品的过程
样品预处理 给药、切片或细胞标本的制备 荧光探针标记样品
需有光路转换装置。即汞灯与激光转换，同时 汞灯光线强度可调。
荧光镜座要有防震动装置。
激光共聚焦技术课件
激光共聚焦显微镜工激作光共原聚焦理技示术课意件 图
激光经放大、 分光后由物镜 聚焦于焦平面 上，同时，焦 平面上被激光 扫描的点F所发 出的一定波长 的荧光通过检 测针孔光栏达 到检测器，并 成像于显示器 上，得到相应 的荧光图象。
激光共聚焦技术课件
目的蛋白细胞器定位观察
35S:GFP
Bright
a
GFP
b
Merged
c
35S:BrTTG1-GFP
d
e
f
TTG1在津田芜菁洋葱表皮细胞中的瞬时表达检测 A-C：GFP蛋白在洋葱表皮细胞中的表达；D-F：TTG1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的表达； A、D：透射光下的表皮细胞；B、E：发射光下的洋葱表皮细胞；C、F：发射和透射复合光下的洋葱表皮细胞
激光共聚焦显微镜基本操作
获取共焦图像的步骤
在 VIS 模式中观察样品 装入 LSM 配置 扫描图像 保存图像
激光共聚焦技术课件
不同厚度光切图像
激光共聚焦技术课件
Z轴扫描
Z轴扫描、时间系列扫描
时间系列扫描
荧光探针的种类及应用
原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚 细胞形态结构
• 检测蛋白质、抗体及其他分子：荧光蛋白（GFP、
YFP等）
活体细胞或组织功能的实时动态监测
• 实时定量测定细胞内Ca2+变化：fluo-3/AM，fura-2
激光共聚焦技术课件
荧光探针标记样品的过程
样品预处理 给药、切片或细胞标本的制备 荧光探针标记样品
需有光路转换装置。即汞灯与激光转换，同时 汞灯光线强度可调。
荧光镜座要有防震动装置。
激光共聚焦技术课件
激光共聚焦显微镜工激作光共原聚焦理技示术课意件 图
激光经放大、 分光后由物镜 聚焦于焦平面 上，同时，焦 平面上被激光 扫描的点F所发 出的一定波长 的荧光通过检 测针孔光栏达 到检测器，并 成像于显示器 上，得到相应 的荧光图象。
激光共聚焦技术课件
目的蛋白细胞器定位观察
35S:GFP
Bright
a
GFP
b
Merged
c
35S:BrTTG1-GFP
d
e
f
TTG1在津田芜菁洋葱表皮细胞中的瞬时表达检测 A-C：GFP蛋白在洋葱表皮细胞中的表达；D-F：TTG1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的表达； A、D：透射光下的表皮细胞；B、E：发射光下的洋葱表皮细胞；C、F：发射和透射复合光下的洋葱表皮细胞
激光共聚焦显微镜基本操作
获取共焦图像的步骤
在 VIS 模式中观察样品 装入 LSM 配置 扫描图像 保存图像
激光共聚焦技术课件
不同厚度光切图像
激光共聚焦技术课件
Z轴扫描
Z轴扫描、时间系列扫描
时间系列扫描
共聚焦激光扫描PPT课件
.
4
共聚焦显微镜的优点
减少由于光散射产生的图像模糊 增加有效分辨率 提高信噪比 厚标本的清楚细查 Z轴扫描 可以实现数字放大倍率的调节
.
5
Wide-field microscopy
.
6
Fluorescent Microscope
Objective
Arc Lamp
Excitation Diaphragm Excitation Filter
12
基于共聚焦原理的皮肤在体三维成像技术
探测器 激光束
小孔
聚焦透镜 分光器
光学扫描 物镜
组织样品
Quarter Wave Plate 窗口
.
13
.
14
色素痣
A
明亮的黑素细胞巢围绕真 皮乳头呈圆形或椭圆形分布， 细胞形态规则，大小及明亮度 均一。细胞间有间隔。
B
.
15
对皮肤疾病的治疗与疗效评估需 要先进的皮肤诊断技术
Emission Filter
Emission Filter Emission Pinhole
.
10
原理示意图
光源（激光） 二色镜。 物镜 样品 针孔 检测仪 共焦显微镜的最大优点是可以只 从一个平面收集光。 针孔同焦平面成对（即共焦）， 使得来自焦平面以外的光远离检 测仪。 激光扫描显微镜按顺序一点一点 地、一行一行地扫描样品，将象 素资料合成一个图象。通过移动 焦平面，单个图象（光限幅）可 以放在一起，形成可以以后进行 数字处理的三维栈。
Ocular
Emission Filter
.
7
Confocal microscopy
.
8
Confocal Principle
激光扫描共聚焦显微镜(研究生)1ppt课件
Pathway415、 Pathway435 800系列
CARVⅡ C1 TCS-SP2 FV300
FV1000 尼Ul康tra（Vnieikwo™n）C1-plus
IN Cell Analyzer 3000
TauMap
LSM 510 SYSTEM LSM 510 PASCAL SYSTEM
精选课件PPT
精选课件PPT
35
荧光光谱
精选课件PPT
36
精选课件PPT
37
分隔发射的荧光
精选课件PPT
38
Separation of fluorescence emissions by means of dichroic filters
精选课件PPT
39
（四）计算机系统
控制硬件的软件功能：
①控制电动显微镜； ②选择激光波长，调节激光强度； ③拍摄2-5维图像； ④选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光 挡片位置。
（10）、可即时或延时进行扫描
ROI(region of interesting，感兴趣区域） 实时（real time）显示
（11）、有线和帧方式的多重扫描功能
精选课件PPT
27
（12）、在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无 须很复杂地对仪器参数重新设置
（13）、有记忆功能
（14）、有专用的图象数据库 （15）、系统采用模块化设计，便于整个系统 的扩展和升级换代
有多种方式选择，支持盲法拆分，方便用户使用；
⑾具有专业的FRAP（荧光漂白），FRET（荧光能
量共振转移）软件包。 精选课件PPT
41
精选课件PPT
42
三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤
（一）样品制备
激光共聚焦(简化版)课件
和观察。
技术挑战与解决方案
荧光漂白问题
采用低能量激光束进行扫描，降低对样本的损伤，同时采用快速 恢复的荧光蛋白或染料。
光学切片厚度问题
采用光学切片技术，减少切片厚度，提高成像分辨率。
荧光穿透深度问题
采用多波长激光激发和光谱成像技术，提高荧光穿透深度。
未来发展趋势
更高分辨率和更深的成像
利用超分辨技术和光片显微成像技术，实现更高分辨率和更深层次的成像。
曝光时间
根据荧光强度和显微镜性 能，调整曝光时间以确保 图像的动态范围和细节。
图像处理
色彩校正
伪彩色
对图像进行色彩校正，确保颜色准确 性和对比度。
将灰度图像转换为彩色图像，增强视 觉效果和目标识别。
背景消除
去除图像中的背景噪声，提高目标结 构的可见度。
定量分析
细胞识别
利用图像处理算法自动识别细胞 和其他组织结构。
激光共聚焦(简化版)课 件
目录
Contents
• 激光共聚焦技术简介 • 激光共聚焦显微镜 • 图像处理与分析 • 实验技术与应用 • 激光共聚焦技术前沿与展望
01 激光共聚焦技术简介
定义与特点
定义
激光共聚焦技术是一种光学显微 技术，利用激光作为光源，通过 共聚焦显微镜观察和解析细胞或 组织的结构和功能。
定量测量
对识别出的细胞或组织结构进行定 量测量，如面积、周长、形状因子 等。
统计分析
对测量结果进行统计分析，比较不 同样本或条件下的差异。
04 实验技术与应用
样本制备
样本选择
选择适合观察的样本，如细胞、 组织切片或活体样本。
固定与透明化
对样本进行固定和透明化处理， 以便于观察。
《激光共聚焦简化》课件
显微镜设置与校准
激光器选择
根据所使用的荧光染料选 择适当的激光器波长。
滤色片配置
选择合适的滤色片以减少 背景噪声并提高信噪比。
校准与调整
确保显微镜的焦距、放大 倍数和视野等参数设置正 确，以便获得清晰的图像 。
图像采集与处理
采集模式选择
图像处理
根据观察需求选择单帧采集、多帧平 均或实时扫描模式。
技术培训
参加相关技术培训，提高操作和维护显微镜的能 力。
05 案例展示与解析
细胞生物学研究案例
细胞骨架结构观察
利用激光共聚焦显微镜技术观察细胞 骨架的动态变化，解析细胞生长、分 裂和迁移过程中的骨架重构过程。
细胞器定位与功能研究
通过共聚焦显微镜对细胞内特定细胞 器进行高分辨率成像，分析其在细胞 代谢、信号转导等方面的功能。
《激光共聚焦显微镜技术简 化操作与解析》
contents
目录
• 激光共聚焦显微镜简介 • 激光共聚焦显微镜操作流程 • 激光共聚焦显微镜解析技术 • 激光共聚焦显微镜的维护与保养 • 案例展示与解析
01 激光共聚焦显微 镜简介
定义与工作原理
定义
激光共聚焦显微镜是一种光学显微镜技术，利用激光作为光 源，通过共聚焦方式获取样品的高分辨率、高对比度图像。
优点
色彩复原技术能够提供高对比度和高 分辨率的图像，同时能够选择性地标 记和染色细胞或组织的特定结构，有 助于研究者更深入地了解细胞或组织 的生理和病理变化。
缺点
由于荧光染料可能会对细胞或组织产 生一定的毒性作用，因此需要严格控 制染料的浓度和作用时间。
定量分析技术
01 02
定量分析技术
利用激光共聚焦显微镜的定量分析软件，对获取的图像进行定量分析和 数据提取。这种技术能够提供更准确和可靠的实验数据，有助于研究者 更深入地了解细胞或组织的生理和病理变化。
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
扫描速度与分辨率设置
根据实验需求，调整扫描速度和分辨率以确 保图像质量。
图像采集
校准
确保显微镜处于校准状态，避 免图像出现畸变或失真。
采集参数设置
设置合适的曝光时间、增益和 数字位数等参数，以确保图像 质量。
多区域采集
如需观察大范围样品，可设置 多个采集区域，并确保各区域 间无缝拼接。
实时预览
在采集过程中实时预览图像， 确保图像质量满足要求。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度 、无损检测、能够观察活细胞等 。
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑 ；
02
光斑通过扫描器在样品 表面进行扫描，同时收 集反射光或荧光；
03
反射光或荧光通过共聚 焦系统汇聚到光电倍增 管上，转换成电信号；
04
电信号经过处理后形成 图像，显示在计算机屏 幕上。
根据实验需求设置采集参数，如曝光 时间、增益等，以获取高质量的图像 。
CHAPTER 04
激光扫描共聚焦显微镜实验 案例
细胞膜流动性研究
总结词
通过观察细胞膜荧光标记物的扩散和 分布，了解细胞膜的流动性。
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
高速成像
研发更快的扫描速度和数据处理能力，实现实时动态观察 ，缩短实验时间，提高实验效率。
多维成像
拓展激光扫描共聚焦显微镜的成像维度，从二维平面扩展 到三维立体成像，甚至包括时间序列的四维成像，以更全 面地揭示细胞活动和分子交互过程。
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
根据实验需求，调整扫描速度和分辨率以确 保图像质量。
图像采集
校准
确保显微镜处于校准状态，避 免图像出现畸变或失真。
采集参数设置
设置合适的曝光时间、增益和 数字位数等参数，以确保图像 质量。
多区域采集
如需观察大范围样品，可设置 多个采集区域，并确保各区域 间无缝拼接。
实时预览
在采集过程中实时预览图像， 确保图像质量满足要求。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度 、无损检测、能够观察活细胞等 。
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑 ；
02
光斑通过扫描器在样品 表面进行扫描，同时收 集反射光或荧光；
03
反射光或荧光通过共聚 焦系统汇聚到光电倍增 管上，转换成电信号；
04
电信号经过处理后形成 图像，显示在计算机屏 幕上。
根据实验需求设置采集参数，如曝光 时间、增益等，以获取高质量的图像 。
CHAPTER 04
激光扫描共聚焦显微镜实验 案例
细胞膜流动性研究
总结词
通过观察细胞膜荧光标记物的扩散和 分布，了解细胞膜的流动性。
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
高速成像
研发更快的扫描速度和数据处理能力，实现实时动态观察 ，缩短实验时间，提高实验效率。
多维成像
拓展激光扫描共聚焦显微镜的成像维度，从二维平面扩展 到三维立体成像，甚至包括时间序列的四维成像，以更全 面地揭示细胞活动和分子交互过程。
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
共聚焦激光扫描显微术ppt课件
放
四．细胞内PH值的测定，脑缺血，损伤时细 胞内PH变化
荧光漂白恢复技术(FRAP)与细胞间通讯研究
Gap junction的分布，密度，调控因素，网络阻断剂(Othanol , Dieldrin)
6. 激光手术切除神经细胞突起 光陷阱技术，套除细胞器，移动染色体
7. 神经细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD) 与细胞内钙的关系
通过基团修饰以掩蔽生物活性分子，使其以惰性前体形式 存在。通常是可逆的。
原理：紫外线照射→共价键断裂→释放生物活性分子
PART ONE
锁化合物的两种光化学反应原理： 氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光 分解作用
#2022
偶氮苯衍生物：
邻硝基甲 苯衍生物：
01.
目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯 的光敏性质合成。
髓，否则容易造成观者的阅读压 力，适得其反。正如我们都希望 改变世界，希望给别人带去光明，
但更多时候我们只需要播下一颗
种子，自然有微风吹拂，雨露滋
养。恰如其分地表达观点，往往
事半功倍。
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到 样品上
反射光或荧光经目镜汇聚于探测 器
探检测器前有一小孔(Pinhole) 汇聚光束
五、在神经 生物学的应 用
1.神经细胞参数测定及三维重建
细胞外形 浦肯野氏细胞及其突起的投射 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 神经骨架重组的研究
二．神经递质、调质及细胞内活性物质受体 的荧光定位
三．细胞内钙离子的测定
○ 细胞内信号传导的研究 ○ 钙内流与神经递质释放的关系 ○ 微环境变化，受体激活，电刺激与钙的释
0.00
四．细胞内PH值的测定，脑缺血，损伤时细 胞内PH变化
荧光漂白恢复技术(FRAP)与细胞间通讯研究
Gap junction的分布，密度，调控因素，网络阻断剂(Othanol , Dieldrin)
6. 激光手术切除神经细胞突起 光陷阱技术，套除细胞器，移动染色体
7. 神经细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD) 与细胞内钙的关系
通过基团修饰以掩蔽生物活性分子，使其以惰性前体形式 存在。通常是可逆的。
原理：紫外线照射→共价键断裂→释放生物活性分子
PART ONE
锁化合物的两种光化学反应原理： 氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光 分解作用
#2022
偶氮苯衍生物：
邻硝基甲 苯衍生物：
01.
目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯 的光敏性质合成。
髓，否则容易造成观者的阅读压 力，适得其反。正如我们都希望 改变世界，希望给别人带去光明，
但更多时候我们只需要播下一颗
种子，自然有微风吹拂，雨露滋
养。恰如其分地表达观点，往往
事半功倍。
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到 样品上
反射光或荧光经目镜汇聚于探测 器
探检测器前有一小孔(Pinhole) 汇聚光束
五、在神经 生物学的应 用
1.神经细胞参数测定及三维重建
细胞外形 浦肯野氏细胞及其突起的投射 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 神经骨架重组的研究
二．神经递质、调质及细胞内活性物质受体 的荧光定位
三．细胞内钙离子的测定
○ 细胞内信号传导的研究 ○ 钙内流与神经递质释放的关系 ○ 微环境变化，受体激活，电刺激与钙的释
0.00
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
缺点
昂贵
激光扫描共聚焦显微镜的价格相对 较高，不是所有的实验室都能够负
担得起。
需要专业操作
使用该显微镜需要一定的专业知识 和技能，对操作者的要求较高。
样本制备要求高
由于该显微镜对样本的厚度和折射 率等参数敏感，因此需要精心制备 样本。
维护成本高
激光扫描共聚焦显微镜的维护成本 也相对较高，需要定期检查和保养 。
04
激光扫描共聚焦显微镜的 优缺点
优点
高分辨率
激光扫描共聚焦显微镜利用激光束进行 扫描，可以实现比传统显微镜更高的分 辨率。
灵敏度高
由于激光束的强度高，该显微镜对样本 的灵敏度也相应提高，可以检测到较弱 的荧光信号。
减少光损伤
共聚焦技术只对焦点处的样本进行照明 ，有效减少了光损伤。
三维成像
激光扫描共聚焦显微镜可以采集样本的 三维图像。
仪器清洁
清洁显微镜的透镜和其他部件，以确保观察的清晰度和准确 性。
图像获取
参数设置
在获取图像前，需要设置激光扫描共聚焦显微镜的参数，如扫描速度、扫描分辨 率、激光波长等。
图像获取
通过激光扫描共聚焦显微镜获取细胞样本的图像。
数据分析
对获取的图像进行处理，以提 高其清晰度和对比度。
02
数据测量
01
图像处理
显微镜控制和分析软件。
02
基于图形用户界面，方便用户进行样本观察、图像获
取和数据分析。
03
支持多种组织样本类型，包括免疫荧光、荧光原位杂
交等。
Definiens Developer
一种基于规则和智能图像分析软 件，用于构建细胞和组织图像分
析流程。
提供强大的图像处理和分析工具 ，包括图像预处理、特征提取、
《激光共聚焦技术》课件
多模态成像技术结合
将激光共聚焦技术与其它成像技术（如超声、MRI等）相 结合，可以实现多模态、多尺度的成像，为科学研究提供 更多信息。
人工智能与大数据分析
结合人工智能和大数据分析技术，对激光共聚焦图像进行 深度挖掘和定量分析，提高实验结果的可靠性和可重复性 。
05
实验操作与注意事项
实验前的准备
实验材料
将激光束转换为扫描线，并控 制显微镜的X和Y轴移动。
检测器
用于检测荧光信号，并将信号 转换为电信号。
激光器
用于产生激发光，常用波长为 405nm、488nm、561nm和 640nm。
物镜
用于将激光束聚焦到样品上， 并收集荧光信号。
计算机
用于控制扫描头、物镜和检测 器，并收集和处理荧光信号。
性能指标
光漂白与光毒性
强激光束可能会引起荧光分子的光漂 白和光毒性，影响实验结果和细胞活 性。
未来发展与展望
提高成像速度
未来可以通过改进扫描技术和提高探测器性能来提高激光 共聚焦技术的成像速度，以适应更多动态观察的需求。
拓展应用领域
随着技术的进步和应用需求的增加，激光共聚焦技术有望 在更多领域得到应用，如医学诊断、药物研发等。
细胞生物学研究
细胞形态与结构研究
利用激光共聚焦技术观察细胞形态、细胞器结构以及细胞骨架等，有助于深入 了解细胞生物学特性。
细胞分子定位与相互作用
通过荧光标记技术，对特定分子进行定位和追踪，研究分子在细胞内的分布、 动态变化以及与其他分子的相互作用。
医学诊断与治疗
疾病诊断
利用激光共聚焦技术对活体组织进行无创检测，有助于早期发现和诊断肿瘤、炎 症等疾病。
显微镜设置
根据实验需求，设置 激光波长、扫描速度 、分辨率等参数。
激光共聚焦简化版ppt课件
序列扫描的方法排除荧光串色
如图所示是使用序列扫描的方法排除荧光串色的例子： 使用 DAPI （蓝色）来标记细胞核、Cy2 （绿色）来标记 Na+/K+ ATPase、Alexa 568 phallodin （红色）来标记 F-actin。 未使用序列扫描的时，DAPI 的信号串到了 Cy2 通道，Cy2 的信号又串到了 Alexa 569 通道。 同一个标本使用序列扫描后，所有的颜色都被清楚的分开，排除了荧光串色的影响。
紫外 蓝 绿
高压汞灯
被荧光探针染色的生物样本
激发
被标记结构的荧光光学图像
光学 成像
滤镜 分光
488nm 520nm
FITC
450nm 490nm
普通荧光显微镜是广视场显微镜
普通荧光显微镜是广视场显微镜
荧光相互干扰－－图象清晰度降低
激发的特异性差－－背景荧光高
显微镜＋
各种染色 标记技术
荧光标记技术
优点：1.灵敏度高，比常规免疫组织化学的灵 敏度高1000倍。 2.通过不同颜色荧光标记可以清楚的观 察多种物质的共定位。 3.可以观察活细胞中离子或蛋白的动态 变化
荧光串色是指两种或多种荧光染料的发射光谱互相重迭的现象：当使用多种荧光染料标记标本时，或当标本具有很强的自发荧光时，很容易产生串色现象。
最简单的用来确定有无荧光串色的方法是使用单荧光标记的标本作对照： 首先观察第一种荧光染料单标记的标本，使用第一种荧光染料的激发光，在第二种荧光染料的探测通道上观察有无荧光串色；然后观察第二种荧光染料单标记的另一个标本，使用第二种荧光染料的激发光，在第一种染料的探测通道上观察有无荧光串色。 如果发现有荧光串色，则根据不同情况，使用序列扫描或光谱扫描的方法来排除串色的影响。
如图所示是使用序列扫描的方法排除荧光串色的例子： 使用 DAPI （蓝色）来标记细胞核、Cy2 （绿色）来标记 Na+/K+ ATPase、Alexa 568 phallodin （红色）来标记 F-actin。 未使用序列扫描的时，DAPI 的信号串到了 Cy2 通道，Cy2 的信号又串到了 Alexa 569 通道。 同一个标本使用序列扫描后，所有的颜色都被清楚的分开，排除了荧光串色的影响。
紫外 蓝 绿
高压汞灯
被荧光探针染色的生物样本
激发
被标记结构的荧光光学图像
光学 成像
滤镜 分光
488nm 520nm
FITC
450nm 490nm
普通荧光显微镜是广视场显微镜
普通荧光显微镜是广视场显微镜
荧光相互干扰－－图象清晰度降低
激发的特异性差－－背景荧光高
显微镜＋
各种染色 标记技术
荧光标记技术
优点：1.灵敏度高，比常规免疫组织化学的灵 敏度高1000倍。 2.通过不同颜色荧光标记可以清楚的观 察多种物质的共定位。 3.可以观察活细胞中离子或蛋白的动态 变化
荧光串色是指两种或多种荧光染料的发射光谱互相重迭的现象：当使用多种荧光染料标记标本时，或当标本具有很强的自发荧光时，很容易产生串色现象。
最简单的用来确定有无荧光串色的方法是使用单荧光标记的标本作对照： 首先观察第一种荧光染料单标记的标本，使用第一种荧光染料的激发光，在第二种荧光染料的探测通道上观察有无荧光串色；然后观察第二种荧光染料单标记的另一个标本，使用第二种荧光染料的激发光，在第一种染料的探测通道上观察有无荧光串色。 如果发现有荧光串色，则根据不同情况，使用序列扫描或光谱扫描的方法来排除串色的影响。
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荧光样品的制备要求
荧光标记反应的特异性强、荧光定位准确 保持样品应有的结构形态完整性 荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性 荧光强度适宜 荧光稳定性好 样品的荧光分布均匀 两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉
可以消除 图象背景干净、干扰杂质少
荧光探针的种类及应用
原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚 细胞形态结构
图3-9 pA7-TTG1重组质粒酶切鉴定及PCR鉴定 酶切：重组质粒酶切产物；M：Marker DL 2000；PCR：重组质粒PCR产物
目的蛋白细胞器定位观察
含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞
(1)将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及pA7-GFP载体约20 μL分别 加入1.5 mL离心管中，分别加入500 μL的蒸馏水，两管分别标号P1，P2。 (2) 分别取4片约1.5 cm*1.5 cm大小的洋葱表皮放入P1，P2。 (3)将P1，P2管管盖打开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。 (4)将P1，P2管进行抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共抽三次。 (5)取MS培养基并在其上铺上一层滤纸。 (6)取出P1，P2管中的洋葱表皮，将其铺在MS培养基的滤纸上，加少量的水 培养16小时。
激光共聚焦显微镜基本操作
获取共焦图像的步骤
在 VIS 模式中观察样品 装入 LSM 配置 扫描图像 保存图像
不同厚度光切图像
Z轴扫描
Z轴扫描、时间系列扫描
时间系列扫描
Z轴扫描＋时间系列扫描
组织和细胞样品中荧光的来源
自发荧光 荧光染色 免疫荧光－荧光抗体法产生荧光 外源性荧光物质进入组织细胞内产生荧光 酶致荧光
成为形态学、分子细胞生物学、神经 科学、药理学和遗传学等领域中新的 有力研究工具。
激光共聚焦显微镜在生物学中的应用
原位鉴定细胞或组织内生 活体细胞或组织功能的实
物大分子、观察细胞及亚 时动态监测
细胞形态结构
实时定量测定细胞内Ca2+变
检测核酸
化
检测蛋白质细胞定位
测定细胞内pH变化
检测细胞凋亡
检测蛋白质、抗体及其他分子：荧光蛋白（GFP、
YFP等）
活体细胞或组织功能的实时动态监测
实时定量测定细胞内Ca2+变化：fluo-3/AM，fura-2
荧光探针标记样品的过程
样品预处理 给药、切片或细胞标本的制备 荧光探针标记样品
百合花粉管钙离子浓度梯度检测
液体培养基中培养百合花粉
观察花粉管生长情况，长度大概为花粉粒直径 的2－5倍，过长的花粉管会弯曲扭转不利于观 察。
需与扫描器连接。使激光能进入显微镜物镜照 射样品，并使样品发射的荧光到达检测器。
需有光路转换装置。即汞灯与激光转换，同时 汞灯光线强度可调。
荧光镜座要有防震动装置。
激光共聚焦显微镜工作原理示意图
激光经放大、 分光后由物镜 聚焦于焦平面 上，同时，焦 平面上被激光 扫描的点F所发 出的一定波长 的荧光通过检 测针孔光栏达 到检测器，并 成像于显示器 上，得到相应 的荧光图象。
另外Fluo 3对于紫外光照射下可裂解的螯合钙或其 它形式的钙也有作用。
Projection
save “projection”
图7～10. 7. 连续降温下生成 Ca2 + 荧光随时间变化的曲线 同时记录的荧光图像, 显示冬 小麦胞内荧光有相同的变化趋 势。8. 连续降温下生成Ca2 + 荧光随时间变化的曲线同时记 录的荧光图像, 显示春小麦胞 内荧光有相同的变化趋势。9. Fluo-3/ AM染色后,静息态下冬 小麦原生质体的三维重组图像。 10. Fluo-3/ AM染色后,静息态 下春小麦原生质体的三维重组 图像。
刘炜等，低温处理对冬、春小麦细 胞Ca2 + 时空变化的影响，植物学报， 2001，43 (12) :1218 －1223
A
B
C
D
图 11-4 荧光蛋白扫描结果 A,B 检测 CFP 发现目的基因在核膜上表达 C,D 检测 CFP 发现目的基因在含有荧光蛋白的载体pA7-GFP 目的基因 洋葱表皮
检测膜电位变化
细胞器的观察及测定 检测细胞融合 观察细胞骨架 检测细胞间缝隙连接通讯 检测细胞内脂肪
检测细胞内活性氧物种的产 生
检测药物等跨膜进入组织或 细胞过程及其定位
检测荧光共振能量转移
检测荧光漂白恢复
荧光显微镜系统
激光共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体 与常规荧光显微镜相同，但又有其特点。
荧光探针
Fluo-3（/AM）
属于单波长染料，用于测定钙离子的相对浓度。
Fluo-3/AM是fluo-3的一种乙酸甲酯衍生物， fluo 3/AM是脂溶性物质，能跨膜进入细胞。在细胞浆中 被水解脱掉AM后，变成游离的fluo-3，因其不具备 跨过完整细胞膜的特性因此停留在细胞内。
游离配体形式的fluo-3是非荧光性的，但是当它与 Ca2＋结合后，形成具有荧光的fluo-3-Ca，是细胞 荧光强度增加40至80倍，而且其荧光强度与细胞内 [Ca2＋]呈正相关，因此可以得到Ca2＋浓度。
目的蛋白细胞器定位观察
含有荧光蛋白的载体pA7-GFP
CaMV 35S Promoter
XhoI,NcoI,SalI,SpeI GFP
XbaI,SmaI,BamHI
目的基因
目的蛋白细胞器定位观察
对提取的质粒，用目的基因的引物进行PCR鉴定，出现了目的 片段。 根据pA7-GFP Vector上提供的酶切位点，对重组质粒进行双酶 切，酶切后进行电泳分析，也出现了目的片段，表明目的片段 已经和质粒DNA重组。
激光共聚焦技术优秀课件
激光共聚焦显微镜的基本结构
Zeiss LSM 510 META
激光光源 冷却系统 扫描器 光学装置 荧光显微镜系统 图象存储与处理及控制系统
针孔光栏 分光镜 发射荧光单色器 检测器
激光扫描共聚焦显微镜（LSM）是当 今世界上最先进的分子生物学分析仪 器之一。
它是在荧光显微镜成像的基础上加装 了激光扫描装置，利用计算机进行图 像处理，使用紫外光或激光激发荧光 探针，从而得到细胞或组织内部微细 结构的荧光图像，观察细胞的形态变 化或生理功能的改变。