细胞因子检测

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利用抗体对抗原表位的 识别，测定的是可溶性 细胞因子的抗原性。 ELISA RIA FIA ELISPOT 。。。
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利用基因探针，检测特 定细胞因子基因表达， 即mRNA水平。
斑点杂交 Northern印迹 细胞和组织原位杂交 RT-PCR 。。。
优点：方便、迅速 缺点：价格昂贵，结 果仅代表CK的量而非 活性，敏感性较低。
Th0/Th1/Th2细胞转换分析
自体免疫研究--免疫调节及免疫治疗研究 癌症研究--肿瘤反应T细胞作用 过敏机制探讨 --IL-4 诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参 与过敏机制之细胞因子的研究 传 染 疾 病 研 究 --Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, 等
ELISPOT技术应用领域：自身免疫诊断和预后分析、器官 移植后排斥反应的预测、过敏性疾病脱敏治疗的监测、疫 苗和药品的研发与检测等。
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胞内细胞因子的检测
LPS活化单核细胞内TNF-α的测定
R1：淋巴细胞；R2：单核细胞
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局限性：仅能检测基因表 达情况，不能直接提供有 关细胞因子的浓度和活性， 只用于机制探讨。
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细胞增殖实验
待检样品(细胞上清) 按不同稀 释度加入 指示细胞（CTLL-2） IL-2依赖细胞系
37º C，16-20小时 加入3HTdR（1-5Ci） 37º C，4-6小时 收集细胞 测定
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细胞病变抑制实验
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细胞因子的检测方法
生物学检测法 免疫学检测法 分子生物学检测法
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不 同的 CK 具 有不同的 生 物学活性 ，选 择 CK 独特的生物学活性，即 可检测。 细胞增殖/抑制实验 细胞病变抑制实验 细胞毒实验 细胞趋化实验 。。。 优点：敏感、可靠； 缺点：需长期饲养细 胞、检测耗时长、步 骤繁杂。
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Cytokine network
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CBA原理示意图
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cytokine bead arrays(CBA)
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Cell Proliferation ELISA Kit, BrdU (colorimetric)
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Chromium-51 (51Cr) release assays
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细胞 微孔 滤膜 趋化因子 计数受趋化细胞
趋化实验示意图
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免疫标记技术
用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的 抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为
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TNF-的诱生和检测
吸出上清，加入 DMSO，测OD570
37º C, 5%CO2, 4-6h 37º C, 5%CO2, LPS, 18-24h
加入四甲基偶 氮唑盐(MTT)
37º C, 5%CO2, 18-24h
离心收集 培养上清 加入 放线菌 素D处理
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Calculation of Proliferative Index (P.I.)
4 3 2 1 0
CFSE --->
The Proliferative Index is the sum of the cells in all generations divided by the calculated number of original parent cells. It is useful for comparing quantity of cell division between cultures of the same cells undergoing different treatments.
细胞因子的检测方法
左大明 zdaming@smu.edu.cn
细胞因子
一类由细胞分泌，具有多种功能的高活性小分 子蛋白，参与免疫调节和多种生理病理过程等。 白细胞介素(interleukin, IL) 干扰素(interferon, IFN) 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF) 集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF) 生长因子(growth factor, GF) 趋化因子(chemokine)
Lab Invest 2003, 83:1131–1146
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ELISPOT(酶联免疫斑点实验) ELISPOT 技术利用结合在固相载体上的抗细胞因子 的特异性抗体，在分泌细胞周围直接扑获待检细胞 因子。实验中每个斑点（spot）是激活的淋巴细胞 分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。它 可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应 能力。
6.加入酶标链霉亲和素； 7.加入显色底物，在酶的催化分解下， 产生不可溶的色素，就近沉淀在局 部的膜上形成斑点； 8.斑点计数（可人工计数，也可用自 动读板仪计数），数据处理，结果 分析。
ELISPOT
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Байду номын сангаас
应 用
移植研究--allograft rejection 疫苗开发--亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响
优点：灵敏度高，是目前为止最灵敏的检测技术。 可检测到百万分之一阳性细胞率; 单细胞水平、活 细胞功能检测; 操作简便，可进行高通量筛选。
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1.特异性单抗包被在培养板孔底部； 2.封闭能结合单抗的其他部位；
3.加入细胞及刺激物培养，阳性细胞 分泌的细胞因子被单抗捕获； 4.移出细胞，洗涤；
5.加入生物素标记的二抗；
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HIV-peptide specific recall response shows dissociated production of IFN- and GzB
HIV- peptide recall patient B
Medium Peptide 1 Peptide 21
Peptide 47 PHA
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TNF-的诱生和检测
主要由单核/巨噬细胞及其他多种细胞产生，能 使杀伤肿瘤细胞;
THP-1( 人单核细胞系 ) 在 LPS( 脂多糖 ) 刺激下可 分泌TNF-;
L929( 小鼠成纤维细胞 ) 可被 THP-1 分泌的 TNF- 杀伤，且细胞的死亡率与TNF-活性成正比; 四甲基偶氮唑盐(MTT)在活细胞线粒体的琥珀酸 脱氢酶的作用下，被还原呈蓝黑色的 MTT- 甲瓒。
可见的或可测定的。
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高通量细胞因子检测
CBA (Cytometric Bead Array)是一种微珠多 用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合 来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养 液、EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。 其采用夹心法分析策略，与传统的 ELISA 分 析技术相比，此方法可以同时检测多项指标。 用已知的标准品和对照标准曲线就可以得出 被测样本的浓度。此分析方法不受样本量的 限制，而且可以得到一个样本的多个数据。
待检样品（细胞上清） IFN-指示细胞（wish）
按不同稀 释度加入 37º C，4小时 弃取上清，加入VSV(水泡性口炎病毒) 37º C，24-48小时 观察细胞病变（镜检或比色）
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Using CFSE to track CML progenitor proliferation
SDM
SDM + Glivec
GzB
IFN-
Kleen T. et al, AIDS 2003, 18: 383-392
ELISPOT 和 ELISA的区别
ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破传统 ELISA 法，是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展，它们最大的不同:
1.ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可 溶性蛋白总量(整体水平);ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可 溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数 斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从 而计算出分泌该蛋白的细胞的频率（单细胞水平）； 2.ELISPOT比ELISA更敏感。