(仅供参考)实验4-肝微粒体制备

三、实验步骤
1. 处死小鼠；
2. 快速摘除肝脏，自门静脉注入预冷的冰生理盐水 20-50ml，冲洗肝脏至土黄色，再用生理盐水将 肝脏外周血水冲洗干净，用滤纸擦干净后称重、 记录。
3. 将称重后的肝组织置于烧杯中（置冰板上）剪碎 ，转入匀浆管中，并按每克肝组织加1～2ml预冷 的蔗糖-Tris-盐缓冲液，用电动匀浆机制备匀浆 （转速1000rpm）（冰浴中）,研杵上下移动8－ 10次，定容至5ml。
二、实验仪器及药品
1. 器材： 电动匀浆机、漩涡混合器、高速冷冻离心机、
天平、解剖器械、烧杯、注射器、离心管 （15ml）、加样枪、枪头、滤纸等。 2. 试剂：
0.9%氯化钠溶液（每人50ml）； pH7.4的 蔗糖-Tris-盐酸缓冲液（每人5ml） ； pH7.4的氯 化钾-Tris-盐酸缓冲液；88mmol/L氯化钙溶 液； pH7.4的磷酸缓冲盐溶液。 3. 实验动物：成年小鼠
实验五 肝微粒体制备及相关酶活性测定
肝脏损伤的检测与评价
评价化学毒物引起肝损害的方法有Hale Waihona Puke Baidu大类： 1. 体内实验（in vivo test） 即整体动物试验 2. 体外实验（in vitro test）
1. 体内试验 方法是将肝毒物给予受试动物，然后
处死动物或在动物存活的情况下进行各种 生物检测，如动物染毒后的血清酶学分析、 肝脏排泄与分泌功能测定、肝脏化学组成 分析以及肝脏损害的组织病理学检查等。
2.肝脏或其他组织磨碎 (均质化)之后，微 粒体能够在不同的离心速度之下，从其他 的细胞胞器区隔出来、浓缩并分离。
3.组织匀浆中未破碎的细胞、细胞核与线 粒体在9000g的离心速度下可以被沉淀并 分离，而细胞色素P450、内质网碎片及 其他可溶性酶素则保留在上清中。
4.取上清在更快速的100,000g离心旋转之 下，P450、内质网会沉淀成粒状或块状， 而可溶性酶素则保留在上清中，将沉淀重 悬即可得到微粒体。因此微粒体在细胞生 物学中定义为从内质网的碎片所得到的小 型囊泡。
8.离心25000g/min, 15min；
9.按1g肝组织加1ml磷酸缓冲盐溶液,充分混 匀后冻存管分装,置-80℃冰箱内保存待用.
注意事项：
上述过程应使用预冷的匀浆介质、缓冲液 和离心转头。匀浆器、容器等均应保持在冰 浴中，以维持组织及其制备物在0－4℃的 范围。
四、结果分析与讨论
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5.微粒体含有细胞色素P450，由于P450中的 辅助因子、血基质含有铁元素，微粒体常 呈现红褐色。
6.肝微粒体（hepatic microsome）富含多 种物质代谢酶类，在外来化学物的生物转 化中起着极其重要的作用。某些外来化合 物可通过诱导或抑制肝微粒体代谢酶的活 性，影响其他外来化学物在体内的代谢结 局。
4. 将匀浆液离心（4℃，1000g，10min）
5.取上清离心（12000g,10min）；
6.取上清计算体积，按10：1比例加入预冷氯 化钙，冰浴5min，摇匀，以25000g/min离 心15min,弃上清得粉红色微粒体沉淀 。
7.将微粒体沉淀混悬于氯化钾-Tris-盐酸缓 冲液中(2ml)，用漩涡混合器充分混匀；
2. 体外试验 是指采用某种实验技术从动物机体分
离出肝脏或肝细胞的亚细胞结构，让其在 体外与肝毒物接触一定时间，然后进行各 种检测，如动物的离体肝灌流试验、肝细 胞原代培养与肝细胞毒性试验、肝匀浆毒 物代谢试验等。
一、本次实验的目的和原理
1.微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程 中获得的由破碎的内质网自我融合形成的 近似球形的膜囊泡状结构，包含内质网膜 和核糖体两种基本成分，在体外实验中具 有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成 等内质网的基本功能。