cDNA差示分析法

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基因差异表达分析方法及其在作物遗传育种中的应用

基因差异表达分析方法及其在作物遗传育种中的应用

基因差异表达分析方法及其在作物遗传育种中的应用苏在兴高闰飞李强【摘要】植物基因的差异表达是细胞形态和功能多样性的根本原因,也是各种生理及病变过程的物质基础.分析基因差异表达是近30年来分子生物学研究的重点,研究方法也从最早的差减杂交、差异显示PCR和cDNA代表性差异分析等,不断地发展到基于测序的表达系列标签和转录组测序技术,其中高通量测序技术的应用,使得分子生物学进入后基因组时代,特别是转录组测序可高效率、大批量地获取差异表达基因.通过基因差异表达分析,可挖掘农作物的优异农艺性状、高品质、抗性以及杂种优势等相关基因,辅助常规育种,提高农作物的品质、产量、抗性等综合性状,并为探究其机理、机制奠定基础.【期刊名称】《江苏师范大学学报:自然科学版》【年(卷),期】2017(035)001【总页数】8页(P38-45)【关键词】基因差异表达;转录组测序;农艺性状;品质性状;抗性;杂种优势【作者】苏在兴高闰飞李强【作者单位】[1]江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/农业部甘薯生物学与遗传育种重点实验室,江苏徐州221131;[2]中国农业科学院甘薯研究所,江苏徐州221131;[3]江苏师范大学生命科学学院,江苏徐州221116【正文语种】中文【中图分类】Q786植物基因差异表达是在转录水平上对基因的表达情况进行研究,包括2个及2个以上材料之间存在差异基因或者差异基因在相同环境条件下具有不同的表达模式,以及同一材料在不同处理下,同一基因呈现不同的表达模式2种情况.在真核生物基因组中,仅约10%~15%的基因在细胞中表达,而且在不同发育阶段、不同生理状态和不同类型的细胞中基因表达也不同[1].基因的差异性表达是细胞形态及功能多样性的根本原因,也是植物生长发育和各种生理及病变的物质基础[2].通过基因差异表达,分离新的功能基因、挖掘和鉴定差异表达基因的新功能等,对作物遗传改良具有十分重要的意义.目前,分子生物学技术逐步应用到作物遗传育种中,分子标记辅助育种、转基因育种以及分子设计育种正在成为作物遗传改良的重要手段[3].1990年代开始,基因差异表达分析方法逐渐得到发展[4-12],并在挖掘新的功能基因以及揭示基因的新功能方面表现出优势.随着研究的深入,对差异性表达基因的富集程度要求更高,从而促使基因差异表达的筛选方法不断得以丰富和改进,尤其是测序技术的发展,使得差异表达基因的获得更加便捷,数量更多,效率更高[13].本实验室也采用基因差异表达分析技术,解析徐薯18和徐781 2个甘薯品种在新陈代谢、抗逆性和碳水化合物积累等方面的机理机制,已获得一批与新陈代谢、抗逆性、物质积累等相关的功能基因.本文简要综述不同基因差异表达分析方法的特点、原理及优缺点,进一步阐述基因差异表达分析技术在作物农艺性状分析、品质性状分析、抗性分析以及杂种优势分析等方面的应用,以期对后续的研究工作有所裨益.1.1 基因差异表达分析方法1.1.1 差减杂交(subtractive hybridization,SH) 最初由Lamar等[4]于1984年报道,用于分离老鼠Y染色体的特异性探针.该方法也叫扣除杂交或减法杂交.差减杂交是对2种遗传背景大致相同而性状有差异的材料进行研究,基因组DNA或者mRNA(反转录成cDNA)经特定的核酸限制性内切酶消化后,在一定的条件下进行分子杂交,选择性地去除2部分共有基因杂交后形成的复合物,将含有目的基因的未杂交部分收集后装入载体,从而构建差减文库.佘卫炜等[14]用该方法成功地分离到6条与藏红花苷合成相关的特异性表达cDNA片段.该方法克服了示差筛选技术的局限性,灵敏度较高,也能有效检测转录丰度低的基因[15],但操作难度大,费时费力,重复性较差,并且在酶切不彻底等情况下很难得到满意的结果[16].1.1.2 mRNA差异显示逆转录PCR(differential display of reverse transcriptional PCR,DDRT-PCR) 1992年,Liang等[5]根据高等生物成熟的mRNA具有poly(A)尾巴的特性,建立了mRNA差异显示逆转录PCR.该方法利用含Oligo(dT)n的寡聚核苷酸作为锚定引物,通过逆转录酶的催化,将真核生物细胞中全部表达的mRNA逆转录为cDNA,通过PCR扩增,利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将有差异的片段分开,从而筛选出差异表达基因.张弛等[17]利用该方法研究水稻77-170(Oryza Sativa var. Japoinca)及其耐盐突变体M-20在盐胁迫下基因表达的差异,克隆到13个与盐诱导相关的cDNA片段,其长度范围在200~600 bp 之间.该方法具有技术应用成熟、效率高、灵敏度高的优点,实验每一步均可检测,无需实验结束,但假阳性率高,最高达70%,所得的cDNA片段较短,很难扩增到ORF(open reading frame)内部[18-19].1.1.3 cDNA代表性差异分析(cDNA-RDA) 在Lisitsyn等[20]建立的DNA代表性差异分析(representational difference analysis,RDA)方法的基础上,1994年,Hubank等[6]建立了cDNA代表性差异分析技术.该技术对2组材料的cDNA 进行酶切消化,并为酶切片段连接特异寡聚核苷酸接头,进行PCR扩增,分别获得实验组(T)和对照组(D)的扩增子.再次酶切2组扩增子并对T组扩增子添加新接头,然后将T组扩增子与富余的D组扩增子混合,形成杂交体,用与新接头互补的特异引物对杂交体进行PCR扩增,其中T/T杂交体进行指数扩增,T/D杂交体进行线性扩增,D/D杂交体不扩增.对差异产物进行多轮PCR后,可用普通琼脂糖凝胶检测差异表达条带[21-22].Ling等[23]将该技术运用于分离大豆不同萌发期子叶中的差异表达基因,并成功克隆到CysP1和CysP2 2个编码半胱氨酸蛋白酶的新基因.1.1.4 表达系列标签(serial analysis of gene expression,SAGE) 1995年,Velculescua等[7]首先提出基因表达系列分析技术,该方法通过限制性酶切含有生物素标记的cDNA,产生能够代表其相应转录物的cDNA短标签(9~14 bp),然后随机连接并进行测序分析.单一转录体由其特异性的短标签所代替,用SAGE软件定量分析标签的丰度,代表转录体的表达水平.Song等[24]采用SAGE法分析超级杂交稻LYP9及其亲本93-11、PA64s在不同时期、不同组织部位的差异表达基因,获得12种主要的基因表达模式,其中406个基因上调表达,469个基因下调表达,这些基因可能与水稻的杂种优势有关.该方法可以将多个短标签串联测序,能够寻找低丰度的转录物,但其依赖已测序的基因序列,过短的序列标签所涵盖的信息无法被准确注释到基因组上[25-26].1.1.5 抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH) 1996年,Diatchenko等[8]提出抑制差减杂交,也叫抑制性消减杂交,结合了抑制PCR和差减杂交技术,利用抑制性PCR,选择性地扩增目的cDNA片段,显著增加了低丰度差异表达cDNA获得的概率.Tirumalaraju等[27]应用SSH技术从抗花生根结线虫和感花生根结线虫2份材料中获得70个差异表达ESTs,并证实各种非生物、生物(含根结线虫)胁迫和植物应答此类胁迫时与水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)及乙烯信号传导之间的关系.这些差异表达候选基因为获得抗根结线虫种质资源并培育优良抗性花生新品种提供可能.该方法简单、成熟、易操作,且效率高,筛选周期短,通常3~4 d可获得基因差异表达片段.但是SSH技术得到的cDNA是限制酶消化的cDNA,不是全长cDNA;材料之间最好是存在细微差异,小片段缺失时也不能有效检测;实验中酶切后的cDNA与接头连接的效率是该方法的关键,若连接效率低,有些差异表达的基因就会漏检[18].1.1.6 cDNA限制性片段长度多态性分析(cDNA-AFLP) 在Botstein等[28]建立的限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法的基础上,1995年,Vos等[29]结合PCR扩增提出一种新的DNA指纹技术,即扩增片段长度多态性(amplification fragment length polymorphism,AFLP).1996年,Bachem等[9]结合RT-PCR和AFLP提出cDNA-AFLP技术,用于对转录组表达情况进行分析.该技术采用2种不同的内切酶切割cDNA片段,并添加含有与引物序列互补的人工接头,进行PCR预扩增后用聚丙烯酰胺凝胶区分差异条带.Nie等[30]运用cDNA-AFLP技术从玉米亲本和杂交种的叶、根和成熟胚中分别分离到180、170和108个差异表达基因,为揭示玉米杂种优势提供了线索.cDNA-AFLP 技术具有很好的重复性,假阳性比较低,不需要预先知道基因的序列信息,能够通过扩增条带显色强度判断基因表达量的差异[31].1.1.7 基因芯片(DNA Chips)技术是指把大量核酸片段固定在载体上,组成密集的按序排列的探针群,通过与标记样品的核酸杂交,判断靶核苷酸的有无或数量多少的一项技术,主要包括芯片的制备、杂交与检测等3个步骤.常见的芯片可分为2大类:一种是原位合成,适用于寡核苷酸;另一种是直接点样,多用于大片段DNA.姜兆远等[32]将Affymetrix表达谱芯片运用于水稻与稻瘟病不同小种的互作研究,水稻与稻瘟病菌非亲和互作的基因表达谱及其亲和互作的基因表达谱之间存在较大差异,将基因芯片筛选到的差异表达基因通过GO注释,明确了差异基因的分子功能及信号通路,有利于进一步了解植物抗病机制,并可能为稻瘟病防治提供新的途径.该方法同时将大量的探针固定于支持物上,可以同时对大量序列进行检测,克服了传统的核酸印迹杂交操作复杂、自动化程度低,且检测序列数量少等缺点.但该方法所用仪器及软件价格较昂贵,探针的合成和固定比较复杂,难以检测低丰度表达的基因[33].1.1.8 半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR 半定量逆转录多聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)是探究基因差异表达的有效手段之一[10].采用PCR技术同时对2组或多组材料的目的基因和内参基因(internal reference genes)进行扩增,运用琼脂糖凝胶电泳PCR扩增产物,并调节内参基因条带强度一致,便可直观地呈现出目的基因在不同组织或者不同材料中是否表达,且能对比其表达丰度[11,34].1993年,Higuchi等[35]根据PCR延伸阶段随着DNA双链的生成,含有荧光的EB(ethidium bromide)染料能嵌入DNA链内部而激发荧光,提出实时荧光定量PCR(real time quantitative RT-PCR,qRT-PCR)的概念.荧光定量PCR具有很好的特异性,重复性好,操作简单快捷,全反应过程在一个封闭的PCR管中进行,可以实时地进行监测,而且扩增结束后不需要进一步处理.Applied Biosystems、Bio-RAd等公司推出实时荧光定量PCR配套的仪器和试剂,使得该技术在研究基因表达方面逐渐成为主流手段[36]. Fu等[37]采用SSH法从3份水稻材料中获得一批抗旱相关的基因,并用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR对300多条特异条带进行确证,为完善水稻抗旱相关QTLs及获得候选功能基因奠定基础.1.1.9 转录组测序(RNA-Seq)技术转录组(transcriptome),广义上指特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的总和,主要包括信使RNA(message RNA,mRNA)、核糖体RNA(ribosome RNA,rRNA)、转运RNA(transport RNA,tRNA)和非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA).狭义上,一般指特定组织或细胞中转录的全部mRNA[25].转录组测序就是利用高通量技术对转录组进行测序分析,并对获得的读段进行过滤、组装以及生物信息学分析.RNA-Seq需要将mRNA反转录成cDNA,并对合成的cDNA作末端修复、加poly(A)尾巴及连接测序接头,片段化为测序平台所需的长度,PCR扩增,构建测序文库,利用相应的测序平台进行序列测定.对于有参考基因组序列的物种,可根据其参考序列(reference assembly)组装,没有参考基因组序列的物种,则进行从头组装(denovo assembly)[12,38].根据组装情况,以单位长度的转录物上覆盖的读段数来衡量基因的表达水平(reads per kilo bases per million reads,RPKM).RNA-Seq 主要用于研究2个及以上样本中基因的差异表达情况,如正常条件下的棉花幼苗和盐胁迫下的棉花幼苗等[39].转录组测序技术具有较高的灵敏度,可以同时获得组织内的全部转录本;能检测出SNP等单个核苷酸的差异,具有很高的精确度;通过组装分析能得出基因家族中的不同拷贝或可变剪接.随着测序仪器的升级,RNA-Seq 费用逐渐下降,除了从测序数据中挖掘差异表达基因外,还可以挖掘SSR、SNP信息以及组装出尽可能完整的Unigenes序列,为后续的基因克隆和功能验证奠定坚实基础[40-45].1.1.10 基因编辑技术近年来,锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)、类转录激活样效应核酸酶(artificial transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和CRISPR-Cas9等[46]基因编辑技术(gene editing)逐步发展并得到广泛应用.基因编辑技术能在基因组水平上对DNA序列进行剪辑或插入,从而导致目的基因的表达受到抑制或表达产物失去相应的功能.Piffanelli等[47]发现,在与小麦亲缘关系较近的大麦中,MLO基因功能的缺失突变使其对白粉病产生广谱和持久的抗性.Wang等[48]采用TALEN和CRISPR-Cas9技术对小麦MLO基因进行编辑,已经获得具有广谱抗白粉病的小麦材料.Qi等[49]结合qRT-PCR检测NgAgo酶与不同引导序列组合作用下目标基因fabp11a的差异表达情况,表明NgAgo技术在降低基因表达水平方面表现出优异的特性.1.2 基因差异表达方法的特点比较SH、DDRT-PCR、cDNA-RDA等方法都是研究基因差异表达的有效工具(表1),其中SAGE、cDNA-AFLP等5种技术能检测出差异表达基因的表达丰度,而其他4种方法则不能;除SH外,其他基因差异表达分析方法均基于PCR技术.应用DDRT-PCR时,结合PCR扩增,可检测出低丰度的mRNA样品,而cDNA-RDA、SSH和cDNA-AFLP等需要经过2~3次PCR扩增,高度富集差异表达基因,保证有较高的特异性,减少假阳性率;SH、cDNA-RDA和SSH技术需要在2个材料之间进行杂交,故仅能检测2组mRNA的差异表达,其他方法可以同时比较多组材料;SAGE 和RNA-seq需要结合测序以及相应软件分析,才能获取差异表达片段以及各自的表达量,其他技术则通过扩增或杂交即可;DNA Chips和RT-PCR/qRT-PCR分别在设计杂交探针和扩增引物时需要预先知道基因序列信息,其他方法均不需要[8,11,28].2.1 挖掘重要农艺性状相关基因农艺性状是指农作物的株高、生育期、育性及产量等可以代表作物特点的重要因子,是作物育种重要考察指标.Firon等[41]通过分析甘薯起始膨大根(initiating storage roots,ISRs)和纤维根(fibrous roots,FRs)的转录组信息,发现至少2.5倍的表达差异短片段8 353个,采用qRT-PCR法对其中Sporamin、AGPase和GBSS1等9个基因进行检测,表明这些差异表达基因参与碳水化合物的代谢和淀粉合成,促使储藏根的形成.Tao等[43]利用Illumina paired-end(PE)转录组测序技术,结合重头组装策略对甘薯7个不同组织的转录组进行分析,为甘薯组织特异表达基因和非生物逆境基因的研究奠定基础.程立宝等[50]对莲藕进行转录组测序分析,发现86个可能与莲藕根茎膨大相关基因,得到10 个贮藏蛋白合成和5 个淀粉合成相关基因,其中Lrplp8和Lrgbss对莲藕根状茎的膨大起到重要作用.育性是有性繁殖作物重要的农艺性状.雄性不育性的发现及三系配套育种、光温不育等概念的提出及成功运用,为新品种的培育和推广带来了极大的方便[51].黄鹂等[52]利用拟南芥ATH1基因芯片与3种不同类型的白菜不育系及其共同保持系的花蕾的mRNA进行杂交,发现各不育系与保持系的花蕾中基因表达存在巨大差异,不同类型不育系之间花蕾转录组的组成特征也有差异.由于3种不育系与保持系花蕾的差异仅表现在花粉的形成和绒毡层的发育上,而其他花器官均无差别,从而推断这些差异表达的基因可能与花粉花药的发育有关.刘冬梅等[53]用陆地棉洞A 的不育株和可育株小孢子单核早期花药进行转录组测序,获得51个激素相关差异表达基因,首次分析小孢子时期激素相关基因在转录组水平上的差异,并对其中2个关键基因进行验证,为深入研究陆地棉洞A的不育机理和挖掘关键基因奠定了基础.2.2 挖掘重要品质性状相关基因随着农作物新品种的更迭以及栽培技术的革新,我国的粮食产量已达到比较理想的水平,人均收入逐步提高的同时,人们的食物消费开始转向有营养、益健康且口感佳的方向,所以对农产品的外观品质和营养品质等要求更高.外观品质是农产品商品价值的重要指标,如水稻种子灌浆不充分、胚乳中的淀粉粒等营养物质排列疏松导致垩白,影响稻米的外观品质[54].Chen等[55]采用RNA-Seq法,在垩白率及胚乳垩白度均低的籼稻品种PYZX和垩白率及胚乳垩白度均高的粳稻品种P02428中发现5 552个差异表达基因,与PYZX相比,P02428中表达量较高的基因有3 603个,较低的基因1 949个;而与2亲本的高垩白重组自交系(recombinant inbred lines,RIL)混样相比,低垩白RIL混样中有88个基因表达量较高,623个基因表达量较低,从中分析确定33个可能与垩白相关的候选差异表达基因,为后续的基因功能验证和育种应用奠定了基础.营养品质包括淀粉及可溶糖等碳水化合物、蛋白质、脂肪酸等,不同加工用途对营养成分的要求不尽相同[56].小麦、甘薯等是重要的淀粉类作物,利用基因差异表达技术分析淀粉合成相关的基因,对育种研究至关重要.小麦材料CB037A具有A 型(直径>10 μm)、B型(直径5~10 μm)和C型(直径<5 μm)3种淀粉粒,而PI330483仅有A型淀粉粒,Cao等[57]采用qRT-PCR法对这2份小麦材料的淀粉粒大小与AGPase大亚基、AGPase小亚基、SSⅠ、SSⅡa和SBEⅠ等淀粉合成相关基因的表达模式进行研究,发现SBEⅡa、SBEⅡb、WaxyD1和AGPase大亚基基因在2份材料中呈截然不同的表达模式.2.3 挖掘耐逆相关基因全球气候逐渐恶化,极端天气逐渐增多,其中干旱是非常普遍的现象,正考验着农业生产.Li等[58]利用基因芯片对玉米抗旱相关小RNA的基因差异表达进行分析,得到miR156、miR159、miR319等3个与抗旱相关的家族基因.Deng等[59]用差异表达的方法从耐旱玉米品系中分离到4个差异表达cDNA片段,并用实时荧光定量PCR分析这4个基因在干旱胁迫下的6个玉米近交系中的表达模式,证实候选基因在耐旱品系中呈上调表达,而在干旱敏感品系则相反.现代农业的投入逐渐加大,而农药、除草剂、化肥以及工业废弃物等各种形式的土地污染严重影响我国的粮食和其他经济作物的产出,植物功能基因的差异表达使其能最大限度地耐受逆境胁迫.Gao等[60]通过转录组测序技术获得紫花地丁镉处理与非镉处理条件下892个差异表达基因,且随机选取15个DEGs进行qRT-PCR 结果验证,为进一步研究其耐镉胁迫机制提供遗传学基础.印莉萍等[61]比较正常供铁和缺铁胁迫下铁高效型小麦(京-411)和铁低效型小麦(三属麦-3)的基因表达差异模式,获得ATP结合转运体(ATP binding cassette,ABC)的cDNA片段并进行Northern杂交,证明它的基因表达受缺铁胁迫的抑制.Kato等[62]利用基因芯片分析硝酸铵诱导下拟南芥和水稻中eIF6(eukaryotic translation initiation factor 6)基因的差异表达,发现该基因在这2种植物中呈现出不同的表达模式,表明eIF6基因在不同的物种中具有表达特异性.除了非生物胁迫外,病虫害等生物胁迫也给农业生产造成巨大的损失,所以挖掘生物胁迫应答基因,辅助选育抗病虫新品种,能有效地缓减农药的使用,增加农民收入和提高生产效率.Evers等[63]以抗马铃薯晚疫病品系Solanum phureja和感晚疫病双单倍体S. tuberosum subsp. tuberosum为材料,用差异显示mRNA法,获得与抗病性、胁迫应答、初级新陈代谢和次级新陈代谢相关的基因.2.4 挖掘与作物杂种优势相关的基因作物杂种优势是杂种后代在表型上优于亲本的现象,涉及作物病虫抗性、高产、高油以及高蛋白等多个方面.杂种优势在自然界比较普遍,但对其具体机理却知之甚少.近年来研究者试图运用基因差异表达技术揭示杂种优势的成因,并取得一定的进展.Zhao等[64]用棉花杂交种及其亲本进行杂种优势研究,发现其中差异表达基因有定量和定性的区别,定性差异是在亲本中高表达或低表达的基因在杂交种中显著高表达;而定量差异有4种基本模式,即在双亲中表达,但后代不表达(BPnF1);其中一个亲本表达,后代不表达(UPnF1);亲本均不表达,后代表达(UF1nP);双亲之一有表达,同时后代也表达(UPF1).在亲本及其后代整个生长期叶片中观察到的基因差异表达可能是杂种优势现象的成因.Wang等[65]通过分析12个玉米近交系及其配组的33个杂交系的基因差异表达情况,发现基因在双亲及其杂种后代中均表达的模式占大多数,故杂种优势不仅与基因表达与否有关,还与基因的表达丰度有关;在玉米雌幼穗发育初期,杂交种的基因表达与双亲的基因表达差异最大;另外,某些基因在杂种中不表达,可以促进籽粒的发育并抑制幼穗中小花发育.利用基因差异表达分析技术,能挖掘新的功能基因,揭示基因的新功能等,为探究农作物的农艺性状、品质性状以及抗逆性等方面的机理机制奠定基础.随着生命科学进入后基因组时代,通过测序及功能注释将对DNA序列、基因表达通路、蛋白质结构及其互作关系等进行初步的鉴定.高通量测序技术和生物信息学的运用,结合qRT-PCR验证提高研究的准确性,也加快了该领域的研究进程.本课题组采用转录组测序技术,对比分析甘薯徐薯18和徐781的转录组信息,在一定程度上解释2种材料的淀粉含量差异和抗性差异(数据未发表),但其具体的调控机制有待进一步研究.未来,从基因差异表达分析入手获得相关功能的候选基因,采用基因编辑技术对目标基因进行敲除或降低其表达量,可逐步实现分子设计育种的目标[66-67].*通讯作者:李强,男,研究员,博士,主要从事甘薯遗传与分子育种研究,E-mail:****************.【相关文献】[1] 吴乃虎.基因工程原理[M].2版.北京:科学出版社,1998.[2] 刘凯,曾继吾,夏瑞,等.mRNA差异显示技术及其在园艺植物上的应用(综述)[J].亚热带植物科学,2009,38(1):78.[3] 黎裕,王建康,邱丽娟,等.中国作物分子育种现状与发展前景[J].作物学报,2010,36(9):1425.[4] Lamar E E,Palmer E.Y-encoded,species-specific DNA in mice:evidence that the Y chromosome exists in two polymorphic forms in inbred strains[J].Cell,1984,37(1):171. [5] Liang P,Pardee A B.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction[J].Sci,1992,257(5072):967.[6] Hubank M,Schatz D G.Identifying differences in mRNA expression by representational difference analysis of cDNA[J].Nucl Acids Res,1994,22(25):5640.[7] Velculescu V E,Zhang L,Vogelstein B,et al.Serial analysis of geneexpression[J].Sci,1995,270(5235):484.[8] Diatchenko L,Lau Y F,Campbell A P,et al.Suppression subtractive hybridization:a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(12):6025.[9] Bachem C W,van der Hoeven R S,de Bruijn S M,et al.Visualization of differential gene expression using a novel method of RNA fingerprinting based on AFLP:analysis of gene expression during potato tuber development[J].Plant J,1996,9(5):745.[10] Cottrez F,Auriault C,Capron A,et al.Quantitative PCR:validation of the use of a multispecific internal control[J].Nucl Acids Res,1994,22(13):2712.[11] 金凤媚,薛俊,郏艳红,等.半定量RT-PCR技术的研究及应用[J].天津农业科学,2008,14(1):10.[12] 张春兰,秦孜娟,王桂芝,等.转录组与RNA-Seq技术[J].生物技术通报,2012,28(12):51.[13] 白根本,沈昕,王沙生.差减杂交方法的原理和应用[J].生物工程进展,1998,18(6):54.[14] 佘卫炜,郭志刚,刘瑞芝.用扣除杂交法分离藏红花苷合成相关基因的克隆[J].清华大学学报(自然科学版),2004,44(12):1592.[15] 李捷,印莉萍,刘维仲.示差扣除杂交法及其在分子生物学中的应用[J].生物技术通报,1999,15(3):9.[16] 白根本,沈昕,王沙生.胡杨盐诱导基因与盐抑制基因的差减杂交显示研究[J].林业科学,2003,39(2):168.[17] 张弛,陈受宜.利用DDRT-PCR技术分析在盐胁迫下水稻耐盐突变体中特异表达的基因[J].中国科学(B辑),1995,25(8):840.。

PCR cDNA方法学

PCR cDNA方法学

◇实验方法学◇用PCR技术从cD NA文库中获取目的基因长片段3汪思应 郑 红 程 洁 余科科 许望翔1 李 俊23(安徽医科大学病理生理学教研室、2临床药理研究所,合肥 230032)摘要 目的 建立一种简便有效的获取cDNA大片段的实验技术。

方法 应用PCR原理,设计特异引物结合文库载体引物对大鼠胎肝cDNA文库进行PCR扩增;用随机引物标记法标记已知小片段“目的基因”(300bp±)作为探针,对PCR产物进行S orthern杂交以检验“目的基因”片段的正确性及长度;回收“目的基因”片段并连接入PGEM2T载体,转染J M109并扩增后,提取“目的基因”测序。

结果 琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增产物有多条不同长度的段,S orthern杂交发现一段长度为115kb的cDNA片段为“目的基因”;测序结果与G eneBank进行Blaste分析,该基因为一株新的序列,已在G eneBank中登录注册(Rat Liver Regeneration2related Pro2 tein1,RL RP21AF236054)。

结论 应用PCR结合S orthern 杂交等手段可迅速从cDNA文库中获取长片段目的基因。

关键词 基因;实验方法;PCR 随着分子生物学研究的发展,人们已建立了多种方法来获取“目的基因”。

但传统的菌落杂交筛库技术操作繁琐、耗时长且可靠性不高[1];多种获取cDNA的试剂盒价格昂贵且有时需特殊仪器,因此我室利用简单的PCR技术从cDNA文3国家自然科学基金(39670366)及安徽省自然科学基金(00044202)1军事医学科学院,北京 1008503通讯作者库中获取“目的基因”大片段。

并用已知小片段目的基因作为探针来鉴定PCR产物以确保实验结果的正确。

现报道如下。

1 材料与方法1.1 材料 Wistar大鼠购自军事医学科学院动物中心;大鼠胎肝cDNA文库购自Clonetech公司;探针标记试剂盒购自Promega公司;α232P(dCTP)购自北京亚辉放射生物公司;PCR 试剂购自宝生物(大连)公司。

分子生物学第五章分子生物学研究法(上)

分子生物学第五章分子生物学研究法(上)

分子生物学第五章分子生物学研究法(上)——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段,有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体:质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选,挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板,加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗:第一抗体,识别目标蛋白二抗:抗体的抗体,能增强信号,增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性,发生频率1%或更高例如:某些人的染色体上的某个位置为A,而另外一些人的同样位置是T,染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记:在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记:RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。

基因工程复习资料

基因工程复习资料

第一章一.名词解释1、基因工程:按工程学原理,将外源基因切割,与载体结合,导入受体细胞,使其稳定表达的过程.2、目的基因:开发人们特殊需要的基因产物或与优良性状相关的基因。

3、工具酶:体外进行DNA合成、切割、连接、修饰等过程需要的酶。

4、DNA药物:在受体细胞内表达产物有药理作用或通过定位整合直接抑制致病基因的DNA。

二.基因工程理论依据(1)基因具有相同的物质基础(2)基因可以切割(3)基因可以转移(4)基因与多肽有对应关系(5)基因的密码是通用的(6)基因可以通过复制遗传给下一代三.基因工程研究内容(1)克隆载体的研究(2)受体的研究(3)工具酶的研究(4)目的基因的研究(5)新技术的研究第二章一.名词解释1、DNA变性:DNA在较高温下,双链间氢键断开,形成单链DNA的过程。

2、DNA复性:变性的DNA,降温时恢复为双链DNA的过程。

3、解链温度:让DNA达到50%变性的温度.4、复制子:从复制起点开始复制出一个DNA分子或片段的核苷酸序列。

5、启动子:不转录RNA,是RNA聚合酶的识别结合位点.6、转录区:能转录相应RNA,包括编码区和终止子。

7、操纵子:原核生物中两个以上基共用一个启动子。

8、内含子:真核生物转录区中的非编码间隔序列.9、限制性核酸内切酶:使一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸酶。

10、稀切酶:有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限制性核酸内切酶。

11、同裂酶:不同的酶有相同的识别序列。

12、同尾酶:切割不同识别序列产生相同末端的不同酶。

13、黏性末端:两条链断开位置是交错的,叫黏性末端。

14、平末端:两条链断开位置是平齐的,叫平末端。

15、位点偏爱:某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割,即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。

16、酶活单位:限制酶最适条件下60分钟切割1ugDNA所需的酶活性.17、容积活性:1ul酶活单位所具有的酶活性。

程序性细胞死亡分子5(PDCD5)研究进展

程序性细胞死亡分子5(PDCD5)研究进展

·综 述·程序性细胞死亡分子5(PDCD5)研究进展杨丰赫1 叶菁菁2 郑 铭1,△(1北京大学医学部基础医学院生理学与病理生理学系,北京100191;2北京大学人民医院中心实验室和临床分子生物学研究所,北京100044)摘要 程序性细胞死亡分子5(programmedcelldeath5,PDCD5)在人体各种组织中广泛存在,可以通过多种凋亡通路促进细胞凋亡,其在大部分肿瘤中低表达,对肿瘤化疗具有增敏效应。

近年发现,除了在细胞凋亡过程中发挥作用外,PDCD5在多种疾病的病理进程中发挥重要作用,如:肿瘤、自身免疫性疾病、炎症性疾病、脑缺血再灌注损伤及动脉粥样硬化等。

PDCD5蛋白结构简单,无二硫键,其重组蛋白药物开发较便利,具较高的药物基因组学应用价值。

本文主要介绍近20年来PDCD5的研究进展及其在肿瘤、免疫系统疾病、心血管系统疾病中可能的应用、存在的不足、以及在其他方面的应用前景。

关键词 PDCD5;凋亡;肿瘤;心血管系统疾病中图分类号 R363ProgressinPDCD5ResearchandItsPathophysiologicalRelevance YANGFeng He1,YEJingJing2,ZHENGMing1,△(1DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,HealthScienceCenter,PekingUniversity,Beijing100191China;2DepartmentofCentralLaboratory&InstituteofClinicalMolecularBiology,PekingUniversityPeople'sHospital,Beijing100044China)Abstract ProgrammedCellDeath5(PDCD5)isubiquitouslyexpressedinvarioushumantissues,promotingcellapoptosisthroughmultipleapoptoticpathways;PDCD5haslowexpressionlevelinmostkindsoftumors,anditcanincreasethesensitizationoftumorsinresponsetochemotherapy.Increasingevidenceshowedthat,inadditiontoparticipatingincellapoptosis,PDCD5playsimportantrolesinavarietyofdiseases,suchascancers,immunesystemdiseases,inflammatorydiseases,ischemiareperfusioninjuries,andatherosclerosis.ThestructureofPDCD5proteinisquitesimplewithoutdisulfidebond,therefore,itisveryconvenienttodevelopandproducetherecombinantproteinfortherapeuticpurposeinthefuture.ThisreviewmainlyfocusesontheresearchadvanceofPDCD5intherecenttwodecades,thepotentialapplicationanddefectsofPDCD5astherapeuticstrategiesforcancers,immunesystemdiseasesandcardiovasculardiseases,aswellasperspectivesofthevalueofPDCD5inotherdirections.Keywords PDCD5;apoptosis;tumor;cardiovasculardiseases 1999年,北京大学人类疾病基因研究中心利用cDNA差示分析法(representativedifferencesanaly sis),从诱导凋亡的TF 1细胞用中成功克隆了在凋亡时表达上调的人类新基因,命名为TFAR19(TF 1cellapoptosisrelatedgene19)(Liu等.1999)。

分子生物学-二

分子生物学-二

分子生物学-二(总分:100.00,做题时间:90分钟)一、名词解释(总题数:10,分数:20.00)1.核小体(nucleosome)(分数:2.00)__________________________________________________________________________________________正确答案:(染色质结构的基本单位,由组蛋白八聚体(H3、H4、H2A和H2B各2个分子)左向外绕2圈DNA,再加上连接DNA(1inker DNA)及一分子H1组成。

)解析:2.RNA编辑(RNA editing)(分数:2.00)__________________________________________________________________________________________正确答案:(RNA分子上出现的一种修饰现象。

指mRNA在转录后因插入、缺失或核苷酸的替换,改变了DNA 模板来源的遗传信息,翻译出氨基酸序列不同的多种蛋白质。

结果是扩大了遗传信息。

)解析:3.SD序列(SD sequence)(分数:2.00)__________________________________________________________________________________________正确答案:(原核生物mRNA上位于起始密码子AUG上游10个碱基处有一保守序列,可与30S小亚基结合,为核糖体结合的位点。

)解析:4.可变剪接(alternative splicing)(分数:2.00)__________________________________________________________________________________________正确答案:(高等真核生物的mRNA前体分子一般不止一个内含子,剪接可按不同的方式进行,产生多种mRNA,称可变剪接。

目的基因的分离方法

目的基因的分离方法

目的基因的分离方法摘要:介绍了基因工程中分离所需目的基因的主要策略和最新进展。

总结了基因分离中的各种方法,主要有:直接酶切分离法,化学合成法,序列克隆法,功能克隆法,作图克隆法,表型差异克隆法,计算机辅助分离法等,并对其特点和适用范围进行了简单评述。

关键词:目的基因分离方法基因的分离方法都是根据基因的基本特性创建的,包括基因核苷酸顺序的特异性、基因在染色体上的位置特异性、基因编码的mRNA的特性和基因的差异表达等。

每种方法运用这些特性的一种或者多种,产生了各种各样的分离方法。

这些方法又相互之间组合,从而产生了可以在不同条件下有效分离目的基因的分离策略。

1 直接提取纯化此法只适用于分离多拷贝基因,而不适用于单拷贝基因。

并且所得到的目的基因纯度较低。

但是操作简单,对设备的依赖性很低,即使在很简陋的实验室里也能完成操作。

2 在体外用化学合成或酶促合成的方法取得目的基因通过对表达产物的分析和测序,可以预测目的基因的核苷酸序列,然后按照DNA碱基序列顺序,先合成DNA短片段,再通过DNA连接酶作用,将这些短片段依次连接成一个完整的基因。

人工合成基因的最大优点是能够根据需要合成突变基因,而且,所合成的是单基因,无其它有害基因,比较完整;缺点是只适用于较短的基因,操作比较难,费用也比较大。

目前这种方法主要用于PCR引物的合成,一些突变基因的合成等。

3 序列克隆——根据已知基因的序列克隆基因3.1 PCR扩增克隆当已知目的基因的序列时,通常采用PCR的方法来克隆基因。

基本原理和方法是:利用已知目的基因的序列,设计并合成一对寡核苷酸引物,提取所要从中分离基因的染色体DNA(RNA需要在逆转录酶的作用下合成cDNA的第1条链),然后通过PCR反应来扩增特定的DNA片段。

扩增的片段经过纯化后,连接到合适的载体上,用酶切分析和序列分析测定所得到的重组子,并与已知基因的序列进行比较,来进行鉴定。

鉴定之后的DNA可以用于基因的表达。

基因差异表达的研究方法

基因差异表达的研究方法

基因差异表达的研究方法摘要寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的手段。

寻找差异表达基因的方法有消减杂交法、mRNA 差异显示、代表性差异分析法、基因表达的序列分析、抑制消减杂交、表达序列标签、cDNA微阵列、半定量PCR、定量PCR。

特综述以上各种方法的原理、方法过程、优缺点及其应用,随着科学技术的发展对差异表达基因的研究会更加完善。

关键词基因;差异表达;消减杂交;差异显示;研究方法在真核生物的生命现象中,从个体的发育、生长、衰老、死亡,到组织、细胞的分化、凋亡或肿瘤的恶化以及细胞对各种生物、理化因子的应答,本质上都涉及基因在时间上或空间上的选择性表达,即基因的差异表达。

基因的差异表达与组织、细胞的生物学性状和功能密切相关,成为生命科学的重要研究课题(潘美辉等,1997)。

比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异,不仅是研究生命过程分子机制的基础,亦是分离克隆目的基因的前提(胡昌华,2001)。

寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的内容。

差异表达的基因通常用稳定状态下mRNA的丰度高低有无来比较。

差异表达基因有2个含义,即表达基因的种类改变和基因表达量的变化。

通过它能找到疾病不同阶段、不同状态下表达不同丰度的基因,从而为进一步研究打下基础。

分离和鉴定差异表达基因是了解各项生命活动和疾病分子调控机制的重要手段(梁自文,2001)。

笔者拟对目前现有的寻找差异基因的方法作一综述。

1消减杂交法(subtractive hybridization)消减杂交在1984年由Palmer和Lamer(Lamar EE et at.,1984)提出,其目的是分离出两类同源分子间差异表达的基因,关键是利用分子杂交原理去除共同序列,保留差异序列,通过PCR多次循环扩增而分离,从而能进一步研究其差异表达基因。

具体做法:首先以oligo-dT为引物,从tester中制备放射性标记的单链cDNA 文库。

分子生物学第五章课后思考题答案【修订版】

分子生物学第五章课后思考题答案【修订版】

分子生物学第五章作业1、哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生及发展?答:近半个世纪来,分子生物学主要取得了三大成就:第一,20世纪40年代确定了遗传信息的携带者,即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题;第二,50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题;第三,50年代末至60年代,相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码,充分认识了遗传信息的流动和表达。

但事实上,DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。

其中,限制性内切核酸酶和DNA连接酶等工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。

DNA重组技术的产生及发展过程中比较重要的科学发现和实验如下:1957年A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。

1965年S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定;科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。

1967年年世界上有五个实验室几乎同时宣布发现了DNA连接酶。

1970 年H.O.Smith,K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。

H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。

1972-1973 年H.Boyer,P.Berg等人发展了DNA重组技术,于72年获得第一个重组DNA分子,73年完成第一例细菌基因克隆。

1978 年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。

1981 年R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠;A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。

1982 年美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素;Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。

2013-2014分子生物学章节练习题第5-6章练习题

2013-2014分子生物学章节练习题第5-6章练习题

第五、六章分子生物学研究方法练习题1一、【单项选择题】1.一般的限制性核酸内切酶II作用的特点不包括A.在对称序列处切开DNAB.DNA两链的切点常不在同一位点C.酶切后产生的DNA片段多半具有粘性末端D. DNA两链的切点常在同一位点,E.酶辨认的碱基一般为4-6个4.下列关于建立cDNA文库的叙述哪项是错误的A.从特定组织或细胞中提取mRNAB.将特定细胞的DNA用限制性核酸内切酶切割后,克隆到噬菌体或质粒中,C.用逆转录酶合成mRNA的对应单股DNAD.用DNA聚合酶,以单股DNA为模板合成双链DNA5.限制性核酸内切酶的通常识别序列是A.粘性末端B.RNA聚合酶附着点C.回文对称序列,D.多聚腺苷酸E.甲基化的“帽”结构9.基因工程的操作程序可简单地概括为A.载体和目的基因的分离、提纯与鉴定B.分、切、连、转、筛,C.将重组体导入宿主细胞,筛选出含目的基因的菌株D.将载体和目的基因接合成重组体E.限制性核酸内切酶的应用11.常用质粒有以下特征A.是线性双链DNAB.插入片段的容量比λ噬菌体DNA大C.含有抗生素抗性基因,D.含有同一限制性核酸内切酶的多个切口E.不随细菌繁殖而进行自我复制14.表达人类蛋白质的最理想的细胞体系是A.大肠杆菌表达体系B.原核表达体系C.酵母表达体系D.昆虫E.哺乳类细胞表达体系,18.在分子生物学上“重组DNA技术”又称为A.酶工程B.蛋白质工程C.细胞工程D.发酵工程E.分子克隆技术22.基因组代表一个细胞或生物的A.部分遗传信息B.整套遗传信息,C.可转录基因D.非转录基因E.可表达基因25.在已知序列信息的情况下,获取目的基因的最方便方法是A.化学合成法B.基因组文库法C.cDNA文库法D.PCRE.差异显示法27.PCR主要的酶是A.DNA连接酶B.反转录酶C.末端转移酶D.碱性磷酸酶E. Taq DNA聚合酶28.重组DNA技术中实现目的基因与载体DNA拼接的酶A.DNA聚合酶B.RNA聚合酶C.DNA连接酶D.RNA连接酶E.限制性核酸内切酶30.最常用的筛选转化细菌是否含重组质粒的方法是A.营养互补筛选B.抗药性筛选,C.免疫化学筛选D.PCR筛选E.分子杂交筛选33.用于重组DNA的限制性核酸内切酶,识别核苷酸序列的A.正超螺旋结构B.负超螺旋结构C.α-螺旋结构D.回文结构,E.锌指结构58、基因治疗是指A.对有基因缺陷的细胞进行修复,从而使其恢复正常,达到治疗疾病的目的B.把健康的外源基因导入到有基因缺陷的细胞中,达到治疗疾病的目的C.运用人工诱变的方法,使有基因缺陷的细胞发生基因突变恢复正常D.运用基因工程技术,把有缺陷的基因切除,达到治疗疾病的目的93.PCR实验的特异性主要取决于A.DNA聚合酶的种类B.反应体系中模板DNA的量C.引物序列的结构和长度D.四种dNTP的浓度E.循环周期的次数94.基因剔除(knock out)的方法主要被用来研究A.基因的结构B.基因的功能C.基因的表达D.基因的调控E.基因的突变95.反义核酸作用主要是A.封闭DNA B.封闭RNAC.降解DNA D.降解DNA E.封闭核糖体的功能105. 酵母单杂交技术是分析【】的实验系统。

分子生物学研究技术

分子生物学研究技术

分子生物学研究技术Modul e 1:分子生物学研究技术cDNA文库cDNA文库,代表了生物体某一器官或组织mRNA中所有的或绝大部分的遗传信息。

其构建过程总共有5个步骤(5项技术):1、总RNA 的提取;2、mRNA的纯化;3、cDNA的合成;4、cDNA文库构建;5、基因文库筛选。

详细:1、总RNA的提取:目前常用的提取方法是异硫氰酸胍-苯酚提取法(Trizol提取法),提取步骤:(1)首先用液氮研磨材料成匀浆,加入Trizol试剂,进一步破碎并溶解细胞;(2)加入氯仿抽提,离心,收集含有RNA的水相;(3)用异丙醇沉淀,初步纯化RNA,获得样品用于下一步mRNA的纯化;(PS:实验中还常将含有RNA的细胞破碎物液通过硅胶膜纯化柱后,再通过低盐浓度下从硅胶膜上直接洗脱RNA,获得纯度较高的总RNA);总RNA的浓度、纯度测定:通过分光光度计测其OD260和OD280值,OD260为1时相当于RNA总量为40μg/ml;而OD260/OD280的比值如果在1.8~2.0之间,则表示所提取的RNA纯度较好。

2、mRNA的纯化:纯化原理,将真核细胞的mRNA分子具有5‘端帽子(m7G)和3’端poly (A)尾巴的特征结构,作为提取时的选择性标记。

纯化提取方法:常用寡-纤维素柱层析法获,该方法利用mRNA3‘末端的poly(A)尾巴的特点,当RNA流经寡-纤维柱时,在高盐缓冲液的作用下,mRNA或特异性结合到柱子上,之后再用低盐溶液洗脱mRNA,经过两次层析后可获得较高纯度的mRNA。

3、cDNA的合成:利用RT-PCR技术,常以oligo(dT)为引物,甲基化的dCTP(保证新合成的cDNA链被甲基化,防止构架克隆时被限制性内切酶切割)。

合成基本过程:以mRNA为模板链,在逆转录酶的催化下以甲基化dCTP为原料合成第一条cDNA链;之后再以第一条cDNA 链为模板,在DNA聚合酶催化下合成第二条cDNA(常用RNase H切割mRNA-cDNA杂链中的mRNA序列所产生的小片段为引物合成的第二条cDNA片段,再同过连接酶的作用连接成完整的DNA链。

鹿茸顶端组织IGFlR基因的部分cDNA克隆及差异表达

鹿茸顶端组织IGFlR基因的部分cDNA克隆及差异表达
p o i e t e rt a a i fr r g n rt n o n lr moe u a c a i r vd h oe i lb s o e e ea i fa t lc lr me h n s c s o e m. T t NA w s ioae r m d r s oa R a s ltd fo e mi .me e — l s n
3% .98. 5% ,9 8% a 4. 7. nd 9 5% r s e iey. F u r s e equ n i c t n s o d tatI e p ct l v l o e c nc a tf ai h we h GF1 cDNA . ditn ty up i o R wa sic l — s
c m e,pre ria e,c ria ei rwig a lrt e p ci ey,a d t e c hy eat g l a t g n g o n nt i r s e tv l l e ps n h DNA ss nhe ie sn wa y t sz d u i g AMV e e s rn。 r v r eta s rp a e A i fp me swa e ine c o d n o t moo y r go fI c its . paro r i r s d sg d a c r i g t heho lg e in o GF1 a n t e p ce .The c mo g o h rs e is R DNA e s— q e e f1 u n e o GF g n s co d by RT— R e e wa lne PCR e h l g . Th n. ra —i tc noo y e e lt me PCR s e o me o d tc h x r si wa p r r d t ee tte e p e son f l v lo GF1 i h nl rtp. Re u h we h ttec m pee c di e e c fI e e fI n te a te i R s hss o d t a h o lt o ngs qu n eo GF1 g n s co e R e e wa ln d.Biif r . on o ma tc a ay i a e n I i n lssb s d o GFj g n so ate,p .hu nan u e s we e e fc t R l l ma d mo s ho d CDS p ri e in o e sk erI ata r go ft i ade GFj g ne l h e R wa 0 s 12 3 bp,wh c n o e 01 ni o a i —o pi . Co i h e c d d a4 a ln — cd lngpe tde mpae t te urs e is,t e h mo o is o GF1 r d wi oh rf p ce h o h o lg e fI R

某理工大学生物工程学院《现代分子生物学》考试试卷(567)

某理工大学生物工程学院《现代分子生物学》考试试卷(567)

某理工大学生物工程学院《现代分子生物学》课程试卷(含答案)__________学年第___学期考试类型:(闭卷)考试考试时间:90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题(5分,每题5分)1. 写出原核表达实验步骤。

答案:原核表达实验步骤如下:(1)按上述方法提取该组织的RNA,反转录为cDNA。

(2)以cDNA为模板,用上述引物扩增出带酶切位点的A基因片段。

(3)用BamHI和EcoRI分别切割目的桥段和载体,连接酶将A 基因和载体连接起来构成重组质粒。

(4)将重组质粒转入感受态的菌株BL21中,涂布,根据载体所携带的稳定标记筛选出抗性遗传重组质粒的单克隆。

(5)摇菌、扩大培养,待菌液生长到对数生长期,收集菌体,裂解、收集蛋白质。

(6)将总蛋白制备成溶液通过镍柱,由于A蛋白携带有His标签,可以被吸附在镍柱上才,然后加缓冲液将吸附在镍柱上的A蛋白洗脱下来,即可得到A蛋白溶液。

解析:2、判断题(55分,每题5分)1. 脉冲凝胶电泳采用一个很强的电场来分离非常长的DNA分子,其原理在于迫使DNA分子根据长度的不同而具有不同的速度,并按大小顺序通过凝胶。

()答案:错误解析:在低频场凝胶电泳中,相对较小的分子在电场转换此后可以较快转变移动水分子方向,然而核酸较大的分子在凝胶中转向较为困难。

电场在两种方向(有一定夹角,而不是相反的两个方向)变动。

DNA分子带有负电荷,会朝正极移动。

基质因此小分子向前移动的速度比大分子快。

2. SPO1是枯草杆菌的噬菌体,它通过对RNA polσ因子的更换实现其早、中、晚基因表达的时序控制,这和T7噬菌体的表达方式非常类似。

()答案:错误解析:SPO1是枯草杆菌的噬菌体,它通过对RNA polσ因子的更换实现其早、中、晚基因表达的时序控制,这和T7噬菌体的表达方式不同。

3. 特殊代谢物调节的基因活性调控主要有可诱导和可阻遏两大类,大肠杆菌乳糖操纵子是可诱导调节类的典型例子。

使用实时定量PCR技术验证cDNA和差异显示PCR技术

使用实时定量PCR技术验证cDNA和差异显示PCR技术

实时荧光聚合酶链反应结合融解曲线分析在α-地中海贫血基因诊断中的价值刘敬忠闰梅王立荣王战勇周艳肖白【摘要】目的建立自动化、高通量、准确快速检测缺失型α-地中海贫血基因型的技术。

方法运用SYBR-Green1和ABI 7000热循环仪分别进行3个实时荧光定量聚合酶链反应(SYBR-Q-PCR),同时进行融解曲线(D.C)和Tm值分析,根据特定Tm值对应的D.C峰值判定基因型,即以该峰值≥Cut off值定为PCR结果阳发性,将PCR产物重组到T-载体,筛选到含正确扩增片段的克隆,以梯度稀释重组质粒DNA为模板,进行SYBR-Q-PCR得出标准曲线,从而定量未知标本.结果优化了3个SYBR-Q-PCR反应的引物及其浓度,热循环条件等.检测—SEA等位基因的PCR产物长800bp,Tm=82.5℃±1℃.重组质粒拷贝数在1至105范围内,其对数值与CT值均呈良好线性关系.该检测技术的灵敏度常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳法高出16倍以上,联合运用3个SYBR-Q-PCR反应可以为—SEA缺失携带者,缺失型HbH病,非缺失型Hb病、α-地贫2纯合子、Bart′s水肿胎儿综合征做出基因诊断,并可用于产前诊断。

结论该技术具有自动化程度高、不需荧光标记探针、成本低,易质控、防污染、高通量等优点,适于临床推广应用。

Mylab® qPCR SmartMix非常方便的荧光定量检测试剂。

『规格』1ml/管。

『特点』本产品是非常方便的荧光定量检测试剂,以2×qPCR Mix的形式提供,已混合了Taq DNA聚合酶、酶抗体、dNTP、PCR Buffer、SYBR Green I、稳定剂和增强剂等试剂,只需加入模板、引物即可进行定量PCR反应。

SYBR Green染料与双链DNA结合,在激发光的作用下发出荧光,通过荧光强度的测定,即可确定双链DNA的含量。

整个过程非常简单,最大限度的减少加样次数,有效避免加样误差及交叉污染。

cDNA差示分析法

cDNA差示分析法

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因此,用特定限制性核酸内切酶分离转录产物中具 有基因特异性的9-10个碱基的核苷酸序列并制成标 签。
将这些序列标签连接、克隆、测序后,根据其占总 标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。
45
原位杂交技术 in situ hybridization, ISH
13



















相反当分子信标和其完全 互补的目的片段杂交时, 其发卡结构被拉开而使荧 光分子和荧光猝灭基团在 空间上分开从而发射出荧 光,其信号可提高900倍。
14



















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焦磷酸测序法
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SNP应用
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人类基因单体型图的绘制
SNP与疾病易感基因的相关性分析 指导用药与药物设计
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生物学中经常使用英文缩写

生物学中经常使用英文缩写

SSB蛋白:单链结合蛋白ARS:真核生物DNA的复制子ORC:识别复合物Tn:转座子IS:插入序列AmpR:内酰胺酶UPE:上游启动子元件UAS:上游激活序列snRNPs:与RN相结合的核蛋白SRP:信号识别蛋白DP:停泊蛋白/SRP受体蛋白NLS:核定位序列RE:限制性核酸内切酶SNP:单核苷酸多态性RDA:cDNA差示分析法SAGE:基因表达系列分析技术AE:锚定酶ISH:原位杂交FISH:荧光原位杂交RNAi:RNA干扰RISC:沉默复合物MALDI-TOF:电离—飞行时刻质谱ESI-MS:电喷雾质谱EMSA:凝胶阻滞实验RBS:核糖体结合位点DAG:二酰基甘油PKC:蛋白激酶CPTK:酪氨酸激酶HRE:顺式作用元件/激素应答元件SHBS:表面抗原主蛋白Ig:免疫球蛋白MHC:组织相容性复合体HLA:白细胞抗原HGP:人类基因组打算TCA三羧酸循环DMSO:二甲亚砜Ara:阿拉伯糖Fru:果糖Gal:半乳糖Glc:葡糖糖Lyx:来苏糖Man:甘露糖Rha:鼠李糖Rib:核糖Xyl:木糖ECM:细胞外基质CAM:细胞黏着分子GAG:糖胺聚糖、粘多糖HA:透明质酸CS:硫酸软骨素KS:硫酸角质素Hp:肝素GPC:凝胶渗透层析HPLC:高效液相色谱HPAEC-PAD:高效阴离子互换色谱HPGPC:高效凝胶渗透层析GLC:气相色谱TLC:薄层层析IR:红外光谱NMR:核磁共振FA:脂肪酸PG:前列腺素TX:凝血噁烷TG:三酰甘油AS:动脉粥样硬化LDL:低密度脂蛋白VLDL:极低密度脂蛋白IDL:中间密度脂蛋白HDL:高密度脂蛋白SOD:超氧化物歧化酶PITC:苯异硫氰酸酯DTT:二硫苏糖醇TMS:四甲基硅DNFB/FDNB:二硝基氟苯DNS:丹磺酰氯PA:纤溶酶原激活剂t-PA:组织型PAORD:旋光色散CD:圆二色FMN:黄素腺嘌呤单核苷酸NAD:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸PDB:蛋白质晶体结构数据库SDS:十二烷基硫酸钠ATC:天冬氨酸转甲酰酶Hb:血红蛋白BPG:2,3-二磷酸甘油酸IgG:免疫球蛋白Mb:肌红蛋白FDA:美国食物药品治理局TN:转换数PCMB:对氯汞苯甲酸CTP:嘧啶核苷酸PKC:蛋白激酶CPKA:蛋白激酶APhK:磷酸化酶激酶PTK:蛋白酪氨酸激酶PDGE:血小板生长因子EGF:表皮生长因子CaM:钙调蛋白BRP:视黄醇结合蛋白AcNPV,Autographa califorinica nuclear polyhedrosis virus,苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒att,attachmet site,同意位点Apr,Ampicillin replication sequence,氨卞青霉素抗性基因ARS,Autonomors replication sequence,自主复制序列Adv,Adenovirus,腺病毒atRNA,Antisense RNA,反义RNABmNPV,Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,家蚕核型多角体病毒Bacmid,Baculovirus plasmid,杆状病毒质粒BAS,Bovine serum albumin,牛血清白蛋白BAP,Baceria alkaline phosphase,细菌碱性磷酸酶bp,Base pair ,碱基对BV,budded virus,出芽病毒Bt,Bacillus thuringiensis,苏芸金芽孢杆菌BsNPV,Buzura suppressaria NPV,大尺蠖核型多角体病毒cry,crystal protein gene,晶体蛋白基因cDNA,complementary DNA,互补DNAcccDNA,covalent close circle DNA,公价闭合环状DNA CAP,calf alkaline phosphase,小牛碱性磷酸酶CAP,Catabolic activative protein,分解代谢活化蛋白Cmr,Chloramphenicol resistant gene,氯霉素抗性基因ChDNA,chromosome DNA,染色体DNACEN,centromer,着丝粒、端粒CaMN ,Caullinrs mozic virus,花叶菜花叶病毒CAT,Chloramphnicol acetyltransferase,氯霉素乙酰转移酶基因CBP ,Cap binding protein,帽子结合蛋白DNA,Deoxy ribonucleic acid,脱氧核糖核酸ddH2O,doble distilled water,双蒸水dsDNA,Double strand DNA,双链DNADTT,Dithiothreitol,二硫苏糖醇DNase Ⅰ,DNA enzyme Ⅰ,DNA酶ⅠDNA pol,DNA polymerase,DNA聚合酶ddNTP,dideoxy NTP ,双脱氧NTPdsRNA,double strand RNA,双链RNAdNTP,deoxy NTP,脱氧核苷三磷酸ELISA,ensyme-linked immunosorbent assay,酶联免疫分析E.coli,Esherichia coli,大肠杆菌EDTA,ethylenediamine tetraacetic acid,二乙胺四乙酸EB,ethedium bromide,溴化乙锭EBV,Epstein barr virus,EB病毒FG,foregn gene,外源基因GV,Granulosis virus,颗粒体病毒egt,ecdysteroid UDP-glucosyl transferase gene,蜕皮激素UDP葡萄糖基转移酶基因eif,extension initiation factor,延伸起始因子env,envelope gene,囊膜糖蛋白基因exoⅢ,exonucleaseⅢ,外核酸酶ⅢGFP,Green fluorescent protein,绿色荧光蛋白(gfp)gag,nucleocapsid gene,核衣壳蛋白基因HBV,Hepetitis B virus,乙型肝炎病毒HBeAg,HBV e antigen,乙型肝炎病毒e抗原HBcAg,HBV c antigen,乙型肝炎病毒核心抗原HBsAg,HBV s antigen,乙型肝炎病毒表面抗原HIV,Human immunodeficiency virus,人免疫缺点型病毒HSV,Human simple virus,单纯疱疹病毒HCV,Hepatitis C virus,丙型肝炎病毒hr,homologors region,同源重复序列hnRNA,Heterologous nuclear RNA,核不均一RNAint,Integration enzyme gene,整合酶基因IS,initiation site,(转录)起始位点ITF,induction transcription factor,诱导转录因子IE,immediate early gene,极初期基因iap,inbibiting apoptose gene,凋亡抑制基因Kar,kanamycin resistant gene,卡那霉素抗性基因kb,kilobase pair,千碱基对IFN,interferon,干扰素IPTG,Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,异丙醇β-硫代半乳糖苷LsNPV ,Leucania separata NPV,粘虫核型多角体病毒LTR,Long terminal repeat,长结尾重复序列LacZ,β-galactosidase gene,β-半乳糖苷酶基因ZLuc,Luciferase gene,荧光素酶基因Lef,late expression factoc gene,晚期表达因子基因MW,molecular weight,分子量mRNA,messanger RNA,信息RNAmiDNA,mitochondral DNA,线粒体DNAmsDNA,multi copy ssDNA,多拷贝单链DNAMCS multip cloning site,多克隆位点MOI multipe of infection,感染复数micRNA,mRNA enterfering complementaty RNA,干扰mRNA的互补RNA Ner,Neomycin resistant gene,新霉素抗性基因NCS,non coding sequence,非编码序列NC nitrocellulose,硝酸纤维素膜NTP,Nucleotide triphosphate,核苷三磷酸ocu,polyhedrin gene多角体蛋白基因onc,cancer gene致癌基因omp,outermembrane protein gene,外膜孔蛋白ORF,open reading frame,开放阅读框ori,origin,复制起始点PCR,Polymerase chain reaction,多聚酶链反映PDH,pyruvate dehydrogenase,丙酮酸脱氢酶PEG,Polyethyleneglycol 聚乙二醇pfu,plaque forming units,空斑形成单位PAGE,polyacrymide gel eletrophoresis,聚丙烯酰胺凝胶电泳PE(pe),polyhedra envelope,多角体外膜蛋白(基因)PDV,polyhedra derived virus,多角体衍生病毒PRprometer right,右向启动子PLprometer left,左向启动子RNasin,RNA enzyme inhibitor,RNA酶抑制剂RNA,Ribonucleic acid,核糖核酸RNase,RNA enzyme ,RNA酶rRNA,Ribosomal RNA,核糖体RNART,reverse transcriptase,逆转录酶rNTP,ribo NTP,核糖核苷三磷酸RNA pol,RNA polymerase,RNA聚合酶SDS,Sodium dodecyl sulfate,十二烷基硫酸钠SV40,Simian virus 40,猴病毒40siRNA,small interfer RNA,短片断干扰RNAshRNA,short hairpin RNA,短片断发夹RNAssRNA,single strand RNA,单链RNAsnRNA,small nuclear RNA,小核RANsDNA,satellite DNA ,卫星DNASf9,sodoptera frugiperda 9,昆虫草地夜蛾(细胞)9Tcr,Tetracyclin resistant gene,四环素抗性基因Tn,Transposon,转座子TMV,tobacco mozic virus,烟草花叶病毒tRNA,tuansfer RNA,转移RNAtk,thymidine kinase gene,胸腺激酶基因TCID50,Tissue culture infective dose,半数组织培育感染剂量Ti,tumor inducing plasmid,Ti质粒UV,ultraviolet light,紫外光UTR,rn-translation region,非翻译区wt,wild type,野生型Xgal,5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside,5-溴-4-氯,3 -吲哚β-D半乳糖苷明矾沉淀破伤风类毒素破伤风血清. 旧结核菌素A/G ratio 白蛋白-球蛋白比率AA 氨基酸;变应性哮喘;AAA 美国变态反映学会AAbs 自身抗体AACR 美国癌症研究会AAE 急性变应性脑炎AAF α-干扰素激活的因子AAI 美国免疫学家协会AAS 抗炭疽血清AAV 腺相关病毒ab. 抗体Abn 异样的ABO ABO分型法(血型)ABO system 人ABO血型系统ABS E 绝对误差ABS 抗原结合部位. 无水酒精Abstr 摘要Ac 抗补体AC 吸收系数ACA 自动皮肤过敏反映ACC 事故的;含抗体的细胞ACH 肾上腺皮质激素ACIF 抗补体免疫荧光AcOH 乙酸ACP 替代补体途径ACR 急性细胞排斥反映,取得性细胞性抗击力ACTH 促肾上腺皮质激素ACTP 促肾上腺皮质激素多肽ACV 变应性皮肤血管炎AD virus 腺病毒AD 抗原决定簇(基)Ad 腺嘌呤AD50 50%激活剂量ADCC 抗体依托性补体介导的细胞毒作用ADH 抗利尿激素ADIF 增效直接免疫荧光(实验)ADNAA 抗脱氧核糖核酸抗体ADP 腺苷二磷酸ADR DNA复制的激活酶ADR 药物不良反映AdR 脱氧核糖腺苷ADRIS 抗犬红细胞免疫血清ADRV 成人腹泻性轮状病毒ADT 琼脂凝胶扩散实验AE 绝对误差;琼脂糖凝胶电泳AED 急救允许剂量AEF 同种效应因子a-ELISA 放大酶联免疫吸附实验AET-STBC 氨乙基异硫脲处置过的绵羊红细胞AEX 阴离子互换AF 激活功能AFB 抗酸杆菌AFC 抗体形成细胞aFGF 酸性成纤维细胞生长因子AFP 甲胎蛋白Ag 抗原AG 琼脂糖;分析级别AGA 抗免疫球蛋白G自身抗体AGAT 抗球蛋白抗体实验AGD 琼脂凝胶扩散AGD(AD)琼脂凝胶扩散Agg 凝集反映AGGS 抗气性坏疽血清AGMKC 非洲绿猴肾细胞AgR 抗原受体AH 抗组胺;急性肝炎AHC 急性出血性结膜炎AHDU 血吸附单位AHG 凝聚的人丙种球蛋白AI 自身抑制的AIC 自身免疫复合物AID 急性传染病AIDS 艾滋病. 绝对误差AIP 过继性免疫预防AK cell 异样杀伤细胞ak 明显亲和常数ALA 抗淋巴细胞抗体alb 白蛋白alloAb 同种抗体alloAb 同种抗原ALT 丙氨酸转移酶amp 安瓿Amp 氨苄青霉素AMR 平均最小需要量Anti-HAV 抗甲型肝炎病毒的抗体Anti-HBc 抗乙型肝炎核心抗原的抗体Anti-HBc 抗乙型肝炎核心抗原Anti-HBs 抗乙型肝炎表面抗原的抗体Anti-Id 抗独特型抗体AP 过敏性紫癜APB 成人外周血APC 补体替代途径App 阑尾炎Appx 附录AR 过敏性反映;急性排斥反映;抗原比率ARD 自身免疫性风湿病ARDS 急性呼吸窘迫综合征AS 抗血清ASC 抗体分泌细胞ASLE 急性全身性红斑狼疮ASP 阿司匹林ATC 活化T细胞;人工靶细胞ATG 抗破伤风球蛋白ATP 三磷酸腺苷ATS 抗破伤风血清AU 吸收单位;抗体单位;抗毒素单位AU-PAGE 酸性尿素聚丙烯酰氨凝胶电泳autop 尸检AVP 抗病毒蛋白生物化学英文缩写Gly 甘氨酸Ala 丙氨酸Val 缬氨酸Leu 亮氨酸Ile 异亮氨酸Pro 脯氨酸Ser 丝氨酸Cys 半胱氨酸Met 蛋氨酸Asn 天冬酰胺Gln 谷氨酰胺Thr 苏氨酸Phe 苯丙氨酸Trp 色氨酸Tyr 酪氨酸Asp 天冬氨酸Glu 谷氨酸Lys 赖氨酸Arg 精氨酸His 组氨酸Hb 血红蛋白Mb 肌红蛋白PrP 阮病毒蛋白PI 等电点CD 圆二色光谱NMR 核磁共振技术cAMP 环腺苷酸HGP 人类基因组打算hnRNA 不均一核RNAm7GpppN 7-甲基鸟嘌呤-三磷酸核苷CBP 帽结合蛋白PABP poly(A)结合蛋白ORF 开放阅读框DHU 双氢尿嘧啶ψ 假尿嘧啶核苷m G,m A 甲基化嘌呤snmRNA 非mRNA小RNAsnRNA 核内小RNAsnoRNA 核仁小RNAscRNA 胞质小RNAsiRNA 小片段干扰RNANAD+尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸,辅酶I NADP+尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,辅酶II FMN 黄素单核苷酸FAD 黄素腺嘌呤核苷酸LDH 乳酸脱氢酶CK 肌酸激酶PCR 聚合酶链反映BAL 二巯基丙醇PAM 解磷定SGLT Na 依托型葡萄糖转运体GLUT 依托一类葡萄糖转运体G-6-P 6-磷酸葡萄糖PEK-1 6-磷酸果糖激酶-1 PEP 磷酸烯醇式丙酮酸FBP-2 果糖二磷酸酶-2TAC 三羧酸循环(TCA循环)GSH 谷胱甘肽UDPG 尿苷二磷酸葡萄糖UDPGA尿苷二磷酸葡萄糖醛酸PKA 蛋白激酶AFA 脂肪酸PG 前列腺素TX 血栓烷LTs 白三烯CM 乳糜微粒FFA 游离脂肪酸HSL 激素灵敏性甘油三酯脂酶ACP 酰基载体蛋白VLDL 极低密度脂蛋白LDL 低密度脂蛋白IDL 中密度脂蛋白HDL 高密度脂蛋白SRS-A 过敏反映的慢反映物质5-HPETE 氢过氧化廿碳四烯酸PA 磷脂酸磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸PIP2IP三磷酸肌醇3RCDP 康-亨综合症MVA 甲羟戊酸SCP 固醇载体蛋白CE 胆固醇酯LRP LDL受体相关蛋白HL 肝脂酶FC 游离胆固醇CERP 胆固醇流出调剂蛋白LCAT 卵磷脂胆固醇脂肪酰转移酶Fe-S 铁硫中心CoQ 辅酶Q(泛醌)F P黄素蛋白-2(人复合体2)2Cyt 细胞色素OSCP 寡霉素灵敏蛋白DNP 二硝基苯酚mtDNA 线粒体DNACP 磷酸肌酸ROS 反映活性氧类(自由基)SOD 超氧物歧化酶GPT 谷丙转氨酶ALT 丙氨酸转氨酶GOT 谷草转氨酶AST 天冬氨酸转氨酶IMP 次黄嘌呤核苷酸CPS-I 氨基甲酰磷酸合成酶IAGA N-乙酰谷氨酸OCT 鸟氨酸氨基甲酰转移酶5-HT 5-羟色胺FH四氢叶酸4SAM S-腺苷甲硫氨酸NOS 一氧化氮合酶HGPRT 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶PRPP 磷酸核糖焦磷酸6MP 6-巯基嘌呤MTX 甲氨蝶呤5-FU 5-氟尿嘧啶FUTP 三磷酸氟尿嘧啶核苷MS 中心性肥胖CCK 胆囊收缩素大肠杆菌dNTP 脱氢三磷酸核苷(N代表任一碱基)DNA-pol DNA聚合酶SSB 单链DNA结合蛋白HDP 螺旋反稳固蛋白RF 复制因子/释放因子PCNA 增殖细胞核抗原CDK 细胞周期蛋白依托激酶hTR 人类端粒RNA人类端粒协同蛋白1hTP1hTRT 端粒酶逆转录酶TT 胸苷酸二聚体CTP 羧基结尾结合域Inr 转录起始子TF 转录因子PIC 转录起始前复合物TPB TATA-结合蛋白CDK-9 周期蛋白依托性激酶9 CPSF 断裂和聚腺苷酸化特异性因子CStF 断裂兴奋因子PAP 多聚腺苷酸聚合酶PAB II 腺苷酸结合蛋白IIrp 多种核糖体蛋白质EF 延长因子fMet N-甲酰甲硫氨酸THFA N10-甲酰四氢叶酸RBS 核糖体结合位点PAB/PABP poly A结合蛋白TF 触发因子HSP 热休克蛋白PDI 蛋白质二硫键异构酶PPI 肽-脯氨酰顺反异构酶POMC 鸦片促黑皮质素原ACTH 促肾上腺皮质激素β-LT β酯酸释放激素α-MSH α-促黑激素CLIP 促肾上腺皮质激素样中叶肽SRP 信号肽识别颗粒IFN 干扰素AFP 编码甲胎蛋白CAP 分解物基因激活蛋白IPTG 异丙基硫代半乳糖苷TAF TATA盒结合蛋白(TBP)相关因子UAS 上游激活序列EBP 增强子结合蛋白bZIP 碱性亮氨酸拉链bHLH 碱性螺旋-环-螺旋RNP 核糖体复合物TfR 运铁蛋白受体IRE 铁反映元件eIF 翻译起始因子RBP RNA结合蛋白RISC 沉默复合体dsRNA 双链RNAIS 插入序列bp 碱基对YAC 人工染色体载体cDNA 逆转录DNAPDE 磷酸二酯酶cGPK cGMP依托性蛋白激酶(PKG)PLC 磷脂酰肌醇特异性磷脂酶CDAG 二酯酰甘油PIKs 磷脂酰肌醇激酶CaM 钙调蛋白PP 蛋白磷酸酶HRE 激素反映元件GPCR G蛋白偶联型受体PTK 酪氨酸激酶EGF 表皮生长因子IκB NF-κB抑制蛋白β-AR β-肾上腺素能受体XLA 人类X染色体连锁低γ丢蛋白血症Gal 半乳糖APP 急性时相蛋白质GRP C-反映蛋白IL-1 白细胞介素-1APR 急性时相反映物MHb 高铁血红蛋白ALA δ-氨基-γ-酮戊酸UPG-I 尿卟啉原I同合酶CPG III 粪卟啉原IIIEPO 促红细胞生成素GK 葡糖激酶MEOS 肝微粒体乙醇氧化系统UGT 葡糖醛酸基转移酶COMT 可溶性儿茶酚-O-甲基转移酶GST 谷胱甘肽-S-转移酶Rb基因视网膜母细胞瘤基因。

酵母杂交技术原理及应用

酵母杂交技术原理及应用

序列。
目前研究中常用binding-domain基因有: GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。
常用的activating-domain基因有: GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16
的编码序列等。
酵母双杂交系统的建立
酵母双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、 含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。
构建在同一个表达载体上,在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。
同时将上述两种载体转化改造后的酵上。
(这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4,又不能合成ADE、 HIS 、
LEU、TRP,因此,酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。)
最常用的是酵母细胞, 酵母细胞作为报道株
〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。
具有许多优点:
〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。 〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。 一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA-结 合结构域(如 GAL4-bd, LexA-bd); 另一个基因融合到转录激活结构 域(如GAL4-ad, VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融 合基因的酵母细胞系中, 蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的 报道基因表达(如lacZ), 从而可分析蛋白间的结合作用。
目的cDNA克隆。


表达序列标签法分离目的基因ESTs 基因表达序列分析法
序列克隆法
根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因
自然界中有一些蛋白质的核苷酸编码序列,在其进化的过程中保持着
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