血清总蛋白测定(双缩脲试剂法)教学文案
血清总蛋白测定(双缩
脲试剂法)
生物化学实验报告
姓名：
学号：
专业年级：
组别：
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称血清总蛋白测定（双缩脲试剂法）
实验日期2014-11-21 实验地点第五实验室
合作者指导老师
评分教师签名批改日期
一、实验目的
1、掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作；
2、熟悉血清总蛋白的临床意义；
3、了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。
二、实验原理
（一）：双缩脲反应
在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物；蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。
三、材料与方法：
实验材料
样品：大牛血清
试剂：双缩脲试剂、蛋白质标准液（70g/L）、生理盐水（0.9%）
器材：试管、加样枪、刻度吸管、洗耳球
设备：1100分光光度计、水浴锅
实验步骤
取3支试管，做好标记(B空白对照，S标准液，U为待测大牛血清)，按下表操作：加入物（ml） B (空白）S （标准）U（待测）
大牛血清（1：10）- - 0.5
- 0.5 -
蛋白标准液（1：
10）
0.9%氯化钠溶液0.5 - -
双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0
a.各管混匀，观察各试管颜色
b.将各试管置于37℃水浴锅中加热20min，观察颜色
c.将试管中的液体倒入比色杯中，置于1100分光光度计的样品槽内，在波长540nm，以空白管调零，测S和U管吸的光度。
d.测定结束后，将比色杯中的样品回收进试管
依据公式算出结果
四、结果与讨论：
（一）：实验结果
1、实验现象：
a、在实验中首先加入双缩脲试剂，再依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的大牛血清后溶液没有明显的颜色变化，呈淡蓝色透明状；
b、水浴20分钟之后，B试管试管显淡蓝色；S试管和U试管显浅紫色且S试管的颜色比U试管的颜色稍深。
2、实验数据：
管号测定次数平均吸光度 1 2 3
S 0.187 0.188 0.187 0.1873
U 0.120 0.119 0.119 0.1193 3、结果计算：
将大牛血清和蛋白标准液的平均吸光度带入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L),得出结果：血清总蛋白=44.586g/L
（二）：结果讨论
查阅资料得知，大牛血清总蛋白含量一般为60-80g/L,可是，实验结果却是
44.586g/L,即使按照实验要求及步骤操作,结果还是出现了比较大的误差，实验结果经过讨论，分析如下：
1、成功的方面：
a.在本次试验出现了预期的结果：S和U试管溶液显淡紫色，B试管显淡蓝色。S和U 试管显淡紫色是因为蛋白质发生了双缩脲反应，但是由于蛋白质的含量偏少显色较浅，B试管显浅蓝色的原因是B试管中没有发生任何反应，显双缩脲试剂的淡蓝色。
b.水浴，吸光度测试等环节都能够按照预定的步骤进行，操作比较严谨。
2、误差分析：
a.所测得的蛋白质含量偏低，可能是由于样品存储不当，造成待测的大牛蛋白水解，待测样品中的蛋白质总量本身就很低
b.待测的大牛蛋白溶液正常，但是，标准蛋白溶液的浓度比标示的高，造成测量结果偏低
c.操作过程有偏差，由于量取蛋白质溶液的量比较少，在每个加样步骤的少量偏差，都会造成结果误差较大
五：结论
样品的蛋白质含量偏低
复习思考题
1.什么叫双缩脲试剂？为什么要在双缩脲试剂中加入酒石酸钾钠和碘化钾？
双缩脲试剂
2.试剂配制过程中，为何NaOH要单独配制，最后加入？
3.简述血清总蛋白测定的临床意义。
(整理)6种方法测定蛋白质含量.
6种方法测定蛋白质含量 一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4――2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1) 2NH3+H2SO4――(NH4)2 SO4(2) (NH4)2 SO4+2NaOH――2H2O+Na2SO4+2NH3(3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分
蛋白质的测定方法
蛋白质的测定方法 测定食物中的蛋白质含量有二种方法，一是凯氏微量法，二是自动定氮分析法。 一．凯氏微量法 有手工滴定定氮和自动定氮仪定氮，实验者可根据经济条件设备而定。 1.原理 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用过量硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。 2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O （NH4）2SO4+2NaOH 2NH3+2H2O+Na2SO4 2.方法 本法参照GB 5009.5 -85 适用于各类食品及饲料中蛋白质的测定 3.试剂 所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。试剂均为分析纯。 3.1硫酸铜 3.2硫酸钾 3.3浓硫酸 3.4 2%硼酸溶液（或1%的硼酸） 3.5 混合指示剂：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 3.6饱和氢氧化钠：500g氢氧化钠加入500ml水中，搅拌溶解，冷却后放置数日，澄清后使用。 3.7 0.01mol/L或0.05mol/L盐酸标准溶液：需标定后使用(配制及标定方法见附录) 4.仪器 消化炉凯氏定氮蒸馏装置万分之一电子天平 凯氏定氮蒸馏装置：如图所示 5. 操作步骤 5.1样品处理：精密称取0.1~2.0g固体样品或2~5g半固体样品或吸取液体样品5~20ml，放入100ml或500ml凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜，0.3g硫酸钾及3~20ml浓硫酸，放置过夜后小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，取下放冷后用约2～10ml蒸馏水冲洗瓶壁，混匀后继续加热至液体呈蓝绿透明，取下放冷，小心加10~20ml水混匀，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白实验。 5.2按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 5.3向接收瓶内加入10ml ,1~2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10ml样品消化稀释液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使之流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将3~10ml饱和氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯中，提起玻璃塞使其缓缓流入反应室，立即将玻璃塞盖紧，并加水于小玻璃杯中以防漏气。加紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏2min，移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，然后用少量中性水冲洗冷凝管下端外部，再蒸馏1min取下接收瓶，以0.01或0.05mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。 同时吸取10ml试剂空白消化液按5.3操作。 6. 计算
双缩脲法测定蛋白质含量
双缩脲法测定蛋白质含量 实验二十蛋白质含量测定-—双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的 学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。 二、实验原理 在碱性溶液中，双缩脲(H2N—CO－NＨ-CO—NH２）与二价铜离子作用形成紫红色的络合物,这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基（-CＯ—ＮH2），或与此相似的基团［如—CＨ2—ＮH２，—CＳ—ＮH2,—Ｃ（ＮH）NＨ2］的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(-ＣO—NＨ—）,可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为１～10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Trｉｓ缓冲液和某些氨基酸等。...文档交流仅供参考... 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。...文档交流仅供参考... 三、实验试剂和器材 ［试剂］ 1．双缩脲试剂: 取CuSO４·5H20（c。P。)1.5g和酒石酸钾钠(c．P.）６．0g以少量蒸馏水溶解,再加２.5m ｏl/Ｌ NaOH溶液300ml,KI １。0ｇ，然后加水至10００mｌ.棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀
出现,即不能使用。...文档交流仅供参考... 2。标准蛋白质溶液: 用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA）或标准酪蛋白,配制成１0g/L的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1ｇ/Ｌ的A280为０。66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H２O 或0.９%NaCl配制，酪蛋白用0。05mol/L NａOH配制. ...文档交流仅供参考... ［器材］ 1．试管:15×15０ｍｍ试管7只; 2．１ml，5ml移液管; 3.坐标纸； ４．７2１分光光度计。 四、实验操作 取试管７支,编号，按下表操作： 试剂(m ｌ）\管号空白 管 １２34５测定 管 蛋白 标准 液(1 ０g/ Ｌ) —0。10．２0．30.40.5–
几种测蛋白含量方法的比较
蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定 （一）蛋白质测定方法的比较（原理、优缺点）蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫 外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。 1 微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010） 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高，适用于0.2~ I.Omg氮，误差为土2%;操作复杂费时，整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。，测得结果为总氮含量，包括蛋白氮和非蛋白氮含 量;适用范围广，几乎所有样品均可用此方法。 2双缩脲比色法
双缩脲总蛋白试剂
双缩脲总蛋白试剂 简介： 双缩脲是一种用于分析蛋白质的方法，双缩脲反应的原理是在呈蓝色的碱性硫酸铜溶液存在的情况下，铜离子与肽键形成有色螯合的铜复合物，呈紫色。所产生的颜色密度与参与反应肽键数成比例。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长。双缩脲法测定蛋白浓度兼容性亦很好，不受大部分样本中其他成分的影响，但易受铜离子螯合剂影响，另外，对于血清总蛋白的双缩脲分析，胆红素、脂类、血红蛋白、葡聚糖具有一定干扰作用。Leagene 双缩脲总蛋白试剂由硫酸铜、酒石酸钾钠、氢氧化钠等组成，在浓度范围内有较好的线性关系，是对蛋白质的精确定量分析试剂。 组成： 自备材料： 1、 酶标仪或分光光度计 2、 96孔板或离心管 操作步骤(仅供参考)： 1、 取蛋白标准配制液或稀释液加入到蛋白标准(BSA)中，充分溶解后配制成160mg/ml 的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，溶解后的蛋白标准溶液应-20℃保存。特别提示：待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中。 例如待测蛋白溶解于蔗糖中，亦取蛋白标准溶解于蔗糖中。一般也可以用0.9%NaCl 或PBS 作为溶解BSA 稀释液。 2、 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl 加到96孔板的标准品孔，加稀释液补足。 3、 加适当体积待测蛋白样本到96孔板的样品孔中。如果标准品稀释液与溶解待测蛋白样本的溶液不同，应在待测蛋白样本孔中加入20μl 稀释液；如果标准品稀释液与溶解待测蛋白样本的溶液相同，无需在待测蛋白样本孔中加入l 稀释液。 4、 各孔加入双缩脲总蛋白试剂。 5、 测定吸光值。 6、 根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。 注意事项： 编号 名称 PT0003 PT0003 Storage 双缩脲总蛋白试剂 100ml 500ml 4℃ 使用说明书 1份
双缩脲法测定蛋白质含量
实验二十蛋白质含量测定——双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的 学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。 二、实验原理 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2) 与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2) ，或与此相似的基团［如—CH2-NH2 ，—CS-NH2，—C(NH)NH2］的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH —),可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1?10mg蛋白质。干扰这一测定 的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 三、实验试剂和器材 ［试剂］ 1 ?双缩脲试剂：取CuSO4 ?5H20.)和酒石酸钾钠.)以少量蒸馏水溶解，再加/ L NaOH 溶液300ml, KI ,然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。 2. 标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白，配制成 10g/L 的标准蛋白溶液，可用BSA 浓度1g/L 的A280 为来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或%NaCl配制，酪蛋白用L NaOH配 制。 ［器材］ 1. 试管：15X 150mm试管7只； 2. 1ml，5ml 移液管； 3. 坐标纸；
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法-实验报告
生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.1.掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 1.2.掌握双缩脲试剂的配制； 1.3.熟悉血清总蛋白的临床意义； 1.4.了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。 二、实验原理 2.1.两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。 2.2.蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。 三、材料与方法： 3.1.实验材料： 3.1.1.实验试剂：①小牛血清；②6.0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0.9%NaCl；⑥蒸馏水。 3.1.2.实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平；⑧水浴锅。
3.2.实验步骤 四、结果与讨论： 4.1.实验现象： ①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0.5ml，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。
测定次数 1 2 3 平均吸光度 ②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min，取出后，B试管呈淡蓝色，S试管和U 试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。（如图一） 图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数 S 0.185 0.184 0.185 0.1847 U 0.152 0.151 0.152 0.1517 结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L)，得出结果：血清总蛋白=57.493g/L。 4.3.结果讨论 经查阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为60～80g/L，而小牛血清总蛋白含量比正常成人血清总蛋白含量略低一点，本次结果得出小牛血清总蛋白含量为57.493g/L，符合情况。 4.3.1.成功原因： ①本次试验的试剂混合水浴后出现了预期效果：B试管呈淡蓝色，S试管和U试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。B试管呈淡蓝色是因为B试管中没有发生任何反应，所以呈现双缩脲试剂本来的淡蓝色，而S试管和U试管呈浅紫色是因为试剂中的蛋白质和双缩脲发生了双缩脲反应而呈浅紫色。 管号
食品中蛋白质的测定方法
食品中蛋白质的测定方法 蛋白质的测定方法分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量，肽链和折射率测定蛋白质含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。但是食品种类很多，食品中蛋白质含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此蛋白质的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出蛋白质的含量。由于食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。 一凯氏定氮法 我们在检验食品中蛋白质时，往往只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质核算系数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗蛋白质。 (一)、常量凯氏定氮法 衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。 一般食品蛋白质含氮量为l6％，即1份氮素相当于6.25分蛋白质,以此为换算系数6.25，不同类的食物其蛋白质的换算系数不同.如玉米、高梁、荞麦,肉与肉制品取6.25，大米取5.95、小麦粉取5.7,乳制品取6.38、大豆及其制品取5.17，动物胶5.55。 测定原理： 食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素以氨的形式与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收形成硼酸铵，再用盐酸标准溶液或硫酸标准溶液滴定，根据盐酸消耗量计算出总氮量，再乘以一定的数值即为蛋白质含量，其化学反应式如下。 (1) 消化反应：有机物(含C、N、H、O、P、S等元素)+H2S04 -→(NH4)2S04+C02↑+S02↑+S03+H3PO4+CO2↑ (2) 蒸馏反应：(NH4)2SO4+2NAOH-→2NH3↑+2H2O+NA2SO4 2NH3+4H3BO3-→(NH4)2B4O7+5H2O (3) 滴定反应：(NH4)2B4O7+2HCH+5H2O-→2NH4CH+4H3BO3 或 (NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2 试剂与仪器： 1、硫酸钾；
6种方法测定蛋白质含量
6种方法测定蛋白质含量 [ 文章来源： | 文章作者： | 发布时间：2006-12-25| 字体： [大 中 小] 一、微量凯氏（kjeldahl ）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： nh 2ch 2cooh+3h 2so 4——2co 2+3so 2+4h 2o+nh 3 (1) 2nh 3+h 2so 4——(nh 4)2so 4 (2) (nh 4)2so 4+2naoh ——2h 2o+na 2so 4+2nh 3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（biuret 法） （一）实验原理 双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
蛋白质测定实验报告
蛋白质测定方法——化学报告
蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合，形成 蛋白质一铜复合 物，此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原，产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、 甘氨酸、糖 类、甘油等均 有干扰作用 由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述：
1 材料与方法 1.1 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 1.2 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如, 生化制备中常用的(NH4)2SO4 等和大多数缓冲液不干扰测定,特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。 此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。取待测样品制成蛋白浓度大约在0. 1～1. 0mgPmL的蛋白质溶液,用紫外分光光度计进行比色,对照标准曲线得出样品含氮量。每个样品做3次重复测定,取平均值。 (3)双缩脲法测定蛋白质含量
总蛋白检测试剂盒(双缩脲比色法)
总蛋白检测试剂盒(双缩脲比色法) 简介： 总蛋白(Total Protein ，TP)由白蛋白和球蛋白组成。对于生物体液(血清、尿液、脑脊液)中总蛋白质含量的测定，一般要基于如下两个假设：1、所有蛋白质分子由纯多肽组成，含氮量的质量百分比为16%；2、体液中含有数百个蛋白质分子，每个分子对测定反应都具有非常相似的特性。目前常用的方法有：双缩脲法、紫外分光光度法、染料结合法、凯氏定氮法、沉淀法等。 Leagene 总蛋白检测试剂盒(双缩脲比色法)多用于人或动物血清、血浆、组织等样本中的总蛋白含量测定。双缩脲反应的原理是在呈蓝色的碱性硫酸铜溶液存在的情况下，铜离子与肽键形成有色螯合的铜复合物，呈紫色，所产生的颜色密度与参与反应肽键数成比例。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长。双缩脲法测定蛋白浓度兼容性亦很好，不受大部分样本中其他成分的影响，但易受铜离子螯合剂影响。本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 离心管或小试管 2、 水浴锅或恒温箱 3、 比色杯 4、 分光光度计 操作步骤(仅供参考)： 1、 取蛋白标准配制液或稀释液加入到蛋白标准中，充分溶解后配制成的蛋白标准溶液，配 制后可立即使用，溶解后的蛋白标准溶液应-20℃保存。亦可按自己试验要求继续进行稀释，如稀释至1mg/ml 。特别提示：待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中。例如待测蛋白溶解于蔗糖中，亦取蛋白标准溶解于蔗糖中。一般也可以用NaCl 或PBS 作为溶解总蛋白标准品的稀释液。 编号 名称 TC0547 120T Storage 试剂(A): 双缩脲试剂 250ml 4℃ 试剂(B): 蛋白标准 20mg RT 试剂(C): 蛋白标准配制液 5ml RT 试剂(D): 双缩脲空白试剂(备选) 100ml 4℃ 使用说明书 1份
蛋白质测定方法之双缩脲法(Biuret法)
一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。 三、Folin—酚试剂法（Lowry法） （一）实验原理
紫外吸收法测蛋白质含量的方法(精)
紫外吸收法测蛋白质含量的方法 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于 柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。 此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。1.280nm的光吸收法 因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。 测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。 许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1%1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与 （A1%1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1%1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。 蛋白质浓度= (A280′10 )/ A1%1cm,280nm (mg/ml) (Q 1%浓度?10mg/ml)
总蛋白测定试剂盒(双缩脲法)产品技术要求ruizhengshanda
总蛋白测定试剂盒（双缩脲法） 适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人血清中总蛋白的含量。 1.1产品型号/规格及其划分说明 1.2主要组成成分
2.1外观
2.1.1 外观（液体单试剂） .R应为蓝色透明溶液，无混浊，无未溶解物； .校准液应为浅黄色透明溶液，无混浊，无未溶解物； .试剂盒标签标识清晰，外包装完整无损。 2.1.2 外观（液体双试剂） a）R1应为无色溶液，无混浊，无未溶解物； b）R2应为蓝色溶液，无混浊，无未溶解物； c）校准液应为浅黄色透明溶液，无混浊，无未溶解物； d）试剂盒标签标识清晰，外包装完整无损。 2.2 净含量 R和校准液的净含量不少于标示值。 R1、R2和校准液的净含量不少于标示值。 2.3 试剂空白吸光度 在主波长540nm, 副波长700nm处（光径1cm），试剂空白吸光度A≤0.20。 2.4分析灵敏度 测量1g/L的被测物时，吸光度变化△A≥0.0010。 2.5 线性区间 在[10，110]g/L线性范围内，线性相关系数r≥0.990。 在[10,20]g/L范围内，绝对偏差不超过±2g/L；在(20,110]g/L范围内，相对偏差不超过±10%。 2.6 精密度 2.6.1 重复性
重复测定(45±5)g/L、(70±10)g/L和 (100±10)g/L的样品，变异系数CV%≤5%。 2.6.2 批间差 相对极差≤5%。 2.7 准确度 测定标准物质BW3627-2，测定值与靶值的相对偏差不超过±10%。 2.8 稳定性 原包装的试剂盒在（2～8）℃避光保存，有效期为18个月。 试剂盒在规定的储存条件下保存至有效期满后，检测2.3、2.4、2.5、2.6.1、2.7项，结果应符合各项目的要求。
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验报告
生物化学实验报告 姓名: 学号: 专业年级: 组别: 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目得 1、１、掌握双缩脲测定血清总蛋白得基本原理、操作; 1.２。掌握双缩脲试剂得配制; 1。3。熟悉血清总蛋白得临床意义; 1。4。了解双缩脲法测定血清总蛋白得特点与注意事项。 二、实验原理 2、１.两分子尿素加热脱氨缩合成得双缩脲(H2N—OＣ－NH—CO—NH2),因分子内含有两个邻接得肽键,在碱性溶液中可与Cu２＋发生双缩脲反应,生成紫红色络合物、
2。2。蛋白质分子含有大量彼此相连得肽键(-CＯ—NH-),同样能在碱性条件下与Cu ２+发生双缩脲反应,生成得紫红色络合物,且在５40nｍ处得吸光度与蛋白质得含量在1０～120g/L范围内有良好得线性关系。 三、材料与方法: 3、１、实验材料: 3。１．1.实验试剂:①小牛血清;②6、0ｍｏl/LNａOH溶液;③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾;④蛋白质标准液(70ｇ/Ｌ);⑤0.9％ＮａCl;⑥蒸馏水。 3．1．2.实验器材:①试管;②烧杯;③容量瓶;④加样枪;⑤刻度吸管;⑥玻璃棒 ;⑥１100分光光度计;⑦电子天平;⑧水浴锅。 3。2、实验步骤 — 双缩脲试剂4。0 4。０4。0
测定次数 1 2 3 平均吸光度 m,以空白管调零,测S与U管吸得光度; d。测定结束后,将比色杯中得样品回收进试管。 依据公式算出结果: 四、结果与讨论: 4.1。实验现象: ①选取三支洁净无损得试管,从左往右依次加入0。9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应得小牛血清各０、5mｌ,分别命名为B试管、S试管与U试管,再分别向三支试管内加入4mｌ得双缩脲试剂,溶液均成蓝色透明状、 ②将三支试管放入3７℃水浴锅中加热2０mｉn,取出后,Ｂ试管呈淡蓝色,S试管与U试管均成浅紫色,且S试管得颜色比Ｕ试管得颜色深。(如图一) 图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数 S0、18５0。１8４0。1８5 0。1847 U 0、１5２0.１51 0.15２ 0。1517 管号
蛋白质含量测定方法比较
蛋白质含量测定主要有五种方法，分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点，优缺点明确。 凯氏定氮法 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 优点：重现性好，是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法, ,测试结果准确。 缺点：操作比较繁复，费时,试剂消耗量大。且此法测定的蛋白质含量实际上包括了核酸，生物碱，含氮类脂，卟啉，含氮色素等非蛋白质含氮化合物。双缩脲定氮法 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋
白质测定。 缺点：不太灵敏；不同蛋白质显色相似。 紫外吸收定氮法 双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。 优点：对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便。快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。 缺点：准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外
总蛋白双缩脲法单试剂盒与双试剂盒检测结果的一致性评估
总蛋白双缩脲法单试剂盒与双试剂盒检测结果的一致性评估 目的探讨总蛋白双缩脲法单试剂盒与双试剂盒检测结果的一致性。方法参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）EP9-A2文件的要求，以双试剂盒为参比方法、单试剂盒为待评方法，使用患者新鲜血浆标本进行方法比对及偏倚评估。结果回归方程Y=1.0064X+0.2168，相關系数r=0.9984，不同医学决定水平处的偏倚均小于我国卫生行业标准《WS/T 403-2012 临床生物化学检验常规项目分析质量指标》所规定的总允许误差的1/2。结论总蛋白双缩脲法单试剂盒与双试剂盒的检测结果具有良好的一致性，差异临床可接受，其检测报告可使用相同的参考区间，但仍建议临床实验室使用双试剂盒检测患者样本。 Abstract：Objective To investigate the consistency of the results of the total protein biuret method single kit and double kit.Methods According to the requirements of the American Society for Clinical and Laboratory Standards（CLSI）EP9-A2 document，the double kit were used as the reference method，the single kit was used as the method to be evaluated，and the patient’s fresh plasma samples were used for method comparison and bias evaluation.Results The regression equation Y=1.0064X+0.2168，the correlation coefficient r=0.9984，the bias at different medical decision levels is less than the total specified in China’s health industry standard “WS/T 403-2012 Clinical Biochemical Inspection Conventional Project Analysis Quality Index”.Allow 1/2 of the error.Conclusion The results of single kit and double kit of total protein biuret method were in good agreement with each other，the difference was acceptable in clinic.The same reference range could be used for the test report，but it was still recommended that the clinical laboratory should use double kit to detect the patient sample. Key words：Total protein；Biuret method；Bias assessment；Consistency 总蛋白（total protein，TP）是血清或血浆所含各种蛋白质的总称，临床上常通过双缩脲法（biuret method）检测血清或血浆TP含量及其组分，用以评价患者的营养状态、消化功能及肝脏合成功能等。相关文献表明，该方法对肝脏疾病、肾脏疾病、出血性疾病和免疫性疾病等的诊疗和愈后判断具有重要价值[1-3]。随着技术的不断发展，试剂盒的性能水平不断提高，部分厂家在TP测定单试剂盒的方法基础上开发了双试剂盒，以减小标本质量对检测结果的干扰，保障检测结果的准确性。本文参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）颁布的EP9-A2文件[4]要求，使用患者新鲜血浆标本对单试剂盒和双试剂盒进行方法比对和偏倚，探讨了两试剂盒检测结果的一致性，现报道如下。 1 材料与方法 1.1仪器与试剂日立7600全自动分析仪；总蛋白双缩脲法测定单试剂盒与双试剂盒均由四川迈克提供，批号为1117041，仪器检测参数均严格按照试剂说明书设置；配套生化复合校准品由四川迈克提供，批号为0518061，量值严格溯
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验报告
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法实验报告 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称蛋白质含量测定双缩脲试剂法实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期 1、实验目的 1、1、掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 1、2、掌握双缩脲试剂的配制； 1、3、熟悉血清总蛋白的临床意义； 1、4、了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。 二、实验原理 2、1、两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。 2、2、蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。 三、材料与方法：
3、1、实验材料： 3、1、1、实验试剂：①小牛血清；② 6、0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0、9%NaCl；⑥蒸馏水。 3、1、2、实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平； ⑧水浴锅。 3、2、实验步骤取3支试管，做好标记，按下表操作： 加入物（ml） B（空白） S（标准） U（待测）小牛血清（1:10） 0、5蛋白质标准液（1:10）0、9%Nacl 0、5双缩脲试剂 4、0 4、0 4、0a、各管混匀，观察各试管颜色；b、将各试管置于37℃水浴锅中加热20min，观察颜色；c、将试管中的液体倒入比色杯中，置于1100分光光度计的样品槽内，在波长540nm，以空白管调零，测S和U管吸的光度；d、测定结束后，将比色杯中的样品回收进试管。 依据公式算出结果： 四、结果与讨论： 4、1、实验现象：①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0、9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0、