检测两种蛋白质之间相互作用
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白相互作用的方法主要有酵母双杂交技术、免疫共沉淀和GST pull-down实验。
1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进行验证。
2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。
当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。
再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。
3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。
其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表达及纯化。
将得到的靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当一种“诱饵蛋白”，然后将目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的蛋白，将目的蛋白洗脱下来，通过SDS-PAGE电泳及Western blot分析证实两种蛋白间的相互作用。
以上内容仅供参考，建议查阅相关文献获取更专业的信息。
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上寒风凛冽，又到了一年一度写标书的季节，你开始准备了么？在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，研究蛋白互作的方法有很多，今天我们来介绍九种。
1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）CoIP其实就是两个蛋白相互的IP（免疫沉淀反应）实验，在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下，这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。
IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。
如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体，可以结合并拉下蛋白B，那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达，反之亦然，通过这种相互间免疫共沉淀的实验，就可以明确地验证出，B与C之间的相互作用了。
比如这份标书：PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin？（百度检索题目可查到全文）2、Pull-down实验这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的，在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这还不能证明是直接的结合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B，这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。
要证明直接的结合就是Pull-down实验。
提纯所要研究的两个蛋白（一般是在BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另一个蛋白的存在。
比如这份标书：恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。
（同样可以百度检索到全文）3、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）——共定位将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。
体外蛋白结合实验报告
一、实验背景蛋白质与蛋白质之间的相互作用在生物体内发挥着至关重要的作用，包括信号传导、基因表达调控、细胞骨架组织等。
体外蛋白结合实验是研究蛋白质相互作用的重要手段之一。
本实验旨在研究两种蛋白质A和B之间的相互作用，并通过一系列实验验证其结合能力。
二、实验目的1. 验证蛋白质A和B在体外是否具有结合能力。
2. 确定蛋白质A和B结合的最适条件。
3. 分析影响蛋白质A和B结合的因素。
三、实验材料1. 蛋白质A和B：分别从细胞培养液中纯化获得。
2. 蛋白质标记物：荧光素标记的蛋白质A和B。
3. 试剂：缓冲液、透析袋、SDS-PAGE凝胶、电泳缓冲液、Western blot试剂等。
4. 仪器：蛋白纯化系统、紫外分光光度计、电泳仪、Western blot系统等。
四、实验方法1. 蛋白质纯化：分别从细胞培养液中纯化蛋白质A和B，并鉴定其纯度。
2. 标记蛋白质：将蛋白质A和B分别用荧光素进行标记，获得荧光标记的蛋白质A（F-A）和荧光标记的蛋白质B（F-B）。
3. 蛋白质结合实验：a. 将F-A和F-B按照一定比例混合，在不同温度和pH条件下进行反应。
b. 反应结束后，通过SDS-PAGE和Western blot检测F-A和F-B的结合情况。
4. 影响结合因素分析：a. 研究温度、pH、离子强度等因素对蛋白质A和B结合的影响。
b. 通过改变反应体系中蛋白质A和B的浓度，研究其结合能力的变化。
五、实验结果1. 蛋白质纯化：蛋白质A和B的纯度均达到95%以上。
2. 蛋白质标记：荧光标记的蛋白质A和B的标记效率分别为85%和90%。
3. 蛋白质结合实验：a. 在一定范围内，蛋白质A和B在体外可以发生结合。
b. 在不同温度和pH条件下，蛋白质A和B的结合能力有所差异。
4. 影响结合因素分析：a. 温度对蛋白质A和B的结合有一定影响，最适温度为37℃。
b. pH对蛋白质A和B的结合也有一定影响，最适pH为7.4。
c. 离子强度对蛋白质A和B的结合有显著影响，高离子强度有利于蛋白质A和B的结合。
检测蛋白互作的方法
检测蛋白互作的方法有多种，其中包括酵母双杂交技术、免疫共沉淀、GST-pull down实验等。
这些方法都可以用来研究蛋白之间的相互作用，并有助于进一步了解蛋白质的功能和机制。
1. 酵母双杂交技术：这是一种在酵母细胞中检测蛋白互作的方法，主要通过将两个蛋白的基因分别与报告基因的转录激活域融合，在两个蛋白相互作用时，报告基因就会被激活，从而得到蛋白互作的结果。
2. 免疫共沉淀：这是一种通过抗体和抗原之间的专一性作用来研究蛋白互作的方法。
将其中一个蛋白进行免疫沉淀后，与其互作的蛋白也会被沉淀下来，然后通过Western blot等技术检测到被沉淀的蛋白，从而确定两者之间的相互作用。
3. GST-pull down实验：这是一种体外检测蛋白互作的方法，通过将目标蛋白与谷胱甘肽亲和树脂结合，再与待检测的蛋白混合，如果两者之间有相互作用，目标蛋白就会与待检测蛋白结合并被吸附在树脂上，最后通过Western blot等技术检测到结合的蛋白，从而证明两者之间的相互作用。
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较蛋白质相互作用是生物学研究中的重要课题，对于理解细胞生物过程以及疾病的发病机制具有重要意义。
目前已经开发出多种实验方法用于检测蛋白质相互作用，其中最常用的方法包括：免疫共沉淀、双杂交、表面等离子共振、斑点免疫印迹、荧光共振能量转移（FRET）和生物传感等。
下面将对这些方法进行比较。
免疫共沉淀是一种利用抗体特异性识别蛋白质相互作用的方法。
通过特异性抗体与检测蛋白质结合，将目标蛋白质及其相互作用的蛋白质一起通过沉淀进行分离和检测。
这种方法常用于检测蛋白质复合物，缺点是需要高质量的抗体，抗体的选择和结合效率对结果的可靠性有较大的影响。
双杂交是一种检测蛋白质相互作用的基因工程方法。
该方法利用两个蛋白质的相互作用引起的转录活性调控来筛选蛋白质相互作用。
该方法的优点在于操作简单，筛选速度较快，但是可能存在假阳性结果以及对蛋白质的折叠状态和后转录修改对结果的影响。
表面等离子共振是一种通过测量光敏感表面上的变化来检测蛋白质相互作用的方法。
该方法通过共振的光波与蛋白质结合引起的表面层折射率变化来测量蛋白质的结合动力学参数。
该方法的优点在于实时、直接、无标记以及高灵敏度。
斑点免疫印迹是一种检测蛋白质相互作用的方法，该方法通过将蛋白质分离电泳然后向膜转移，并使用特异性抗体来探测蛋白质的相互作用。
该方法的优点包括操作简单，对蛋白质的结构没有要求，但是这种方法不能提供定量信息。
荧光共振能量转移（FRET）是一种检测蛋白质相互作用的方法，该方法通过基于荧光分子之间的非辐射能量转移来测量蛋白质的相互作用。
该方法对于分子间距离和颗粒之间的角度较敏感。
FRET要求有适当的选择标记的蛋白质，并能够量化蛋白质的相互作用。
生物传感是一种检测蛋白质相互作用的方法，该方法通过表面增强拉曼散射（SERS）或增强荧光技术来获得蛋白质的信号。
该方法对于小样本和灵敏度要求较高的蛋白质相互作用研究具有优势，但需要专门的实验条件和设备。
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术蛋白质之间的相互作用对于生物体的正常功能和生理进程至关重要。
因此，了解和研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用对于疾病研究和新药发现具有重要意义。
本文将介绍常见的用于检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术。
1. 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）免疫沉淀是一种常用的方法，用于鉴定和分离与特定抗原相互作用的蛋白质。
该方法利用特异性抗体结合特定蛋白质并沉淀出来，然后通过电泳、质谱或免疫印迹等分析方法进行检测。
这种方法不仅可以用于识别特定的蛋白质-蛋白质相互作用，还可以捕获整个蛋白质复合物。
2. 酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）酵母双杂交是一种广泛应用于蛋白质-蛋白质相互作用的实验技术。
该方法利用了转录因子的两个功能域的相互作用来检测蛋白质-蛋白质相互作用。
这种方法包括构建两个融合蛋白质：一个与DNA结合域融合的结构域和一个与激活域融合的结构域。
当两个融合蛋白质相互结合时，它们能够重新组装转录因子并激活报告基因的表达。
3. 质谱（Mass Spectrometry，MS）质谱是一种常用于分析蛋白质-蛋白质相互作用的技术。
图谱可以通过分析蛋白质混合物的质量和荷质比来确定蛋白质相互作用的可能性。
质谱技术包括多肽和蛋白质质量指纹图谱（Peptide and protein mass fingerprinting），包括基于基质辅助激光脱附电离（Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）和电喷雾（Electrospray Ionization，ESI）的方法。
4. X射线晶体学（X-ray crystallography）X射线晶体学是一种用于解析蛋白质-蛋白质相互作用的高分辨率结构的技术。
该方法涉及到将蛋白质复合物结晶成晶体，然后通过测量和分析这些晶体所产生的X射线散射模式来确定蛋白质的结构及相互作用。
检测蛋白之间相互作用的方法
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1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与
DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。
2、将待筛选蛋白的cD母细胞中
4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域 不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋 白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；
白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相 复合物混合时就可被吸附而分离.
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1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育 （a, 单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白 混合液；c, 体外翻译cDNA表达得到的未知蛋
白） 2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4ºC 2h
3）离心弃上清 4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，离 心
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5）取上清进行SDS-PAGE电泳，
6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带， 进一步做质谱分析确 定沉降的蛋白；电泳后 的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋白 中是否有目的蛋白 该实验设立GST对照，反应均在4ºC进行
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原理
：酵母双杂交系统的建立得力于对
真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发 现，许多真核生物的转录激活因子都是由两 个可以分开的、功能上相互独立的结构域 (domain)组成的。
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例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有 一个由147个氨基酸组成的DNA结合域 (DNA binding domain BD)，C端有一个由 113个氨基酸组成的转录激活域 (transcription activation domain
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结实验步骤
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结实验步骤蛋白质与蛋白质相互作用是生物学领域中的一个重要研究方向，可以揭示生命活动的基本机理以及药物设计和治疗疾病的潜在靶点。
本文将总结蛋白质与蛋白质相互作用的研究方法以及实验步骤。
一、蛋白质与蛋白质相互作用研究方法总结：1.蛋白质-蛋白质亲和层析法：该方法通过利用蛋白质与目标蛋白质之间的亲和力，将目标蛋白质与其他非特异结合的蛋白质分离，可用于筛选靶向蛋白质的抑制剂或开发特定结合位点。
2.酵母双杂交方法：该方法是通过融合目标蛋白质与一组已知蛋白质相互作用的底物，通过检测底物报告基因（比如启动子）的表达来确定两个蛋白质相互作用的情况。
3.免疫共沉淀法：该方法通过利用抗体的特异性，将目标蛋白质和与其相互作用的蛋白质一同从细胞裂解液中沉淀下来，以证明它们之间存在相互作用关系。
4.光学双光子显微镜或荧光共振能量转移法：这些方法可以利用荧光染料标记的蛋白质，通过观察它们之间的相互作用情况来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。
5.表面等离子体共振（SPR）：该方法通过在金属表面固定一个蛋白质，然后观察黄金膜表面等离子体共振信号的变化来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用过程。
6.核磁共振（NMR）：该方法利用蛋白质中的^1H、^13C和^15N原子的自旋，通过一系列的波形解析来确定蛋白质与蛋白质之间的相互作用，可以提供高分辨率的结构和动力学信息。
7.体外重组蛋白质表达和结合实验：利用大肠杆菌或霞赤红热单核细胞感染表达载体后表达目标蛋白质，以及通过重组技术制备的其他蛋白质，通过混合这些重组蛋白质来研究它们之间的相互作用。
二、蛋白质与蛋白质相互作用实验步骤：1.实验前准备：根据研究目的选择适当的实验方法和方法，准备相应的试剂和材料。
2.原料处理：获得目标蛋白质样品后，进行必要的纯化或浓缩处理，以去除其他污染物，并保持蛋白质的活性。
3.实验设计：根据研究目的设计实验方案，比如确定实验条件、控制实验和重复实验。
检测蛋白质相互作用的方法
检测蛋白质相互作用的方法蛋白质相互作用对于理解细胞内的生物过程以及研究疾病机制具有重要意义。
随着基因组学和蛋白质组学技术的发展，越来越多的蛋白质相互作用被鉴定出来，为进一步研究提供了基础。
本文将介绍几种常用的蛋白质相互作用检测方法，包括传统的生化方法以及近年来发展的高通量技术。
1. 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）：免疫沉淀是一种常用的生化方法，用于检测蛋白质与其他蛋白质的相互作用。
该方法利用特异性抗体与目标蛋白质结合，将其与结合蛋白质一起从混合溶液中沉淀下来。
通过检测共沉淀的蛋白质可以确定其相互作用伙伴。
这种方法可以应用于细胞培养液、组织样品以及原核和真核生物体内。
2. 酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）：酵母双杂交是一种用于检测蛋白质与其他蛋白质的直接相互作用的方法。
该方法利用酵母细胞内的转录激活子和靶蛋白质的交互作用来驱动报告基因的表达。
通过将靶蛋白质与转录激活子的两个域分别与两个不同的蛋白质结合区域相连，可以检测他们之间的相互作用。
该方法可用于鉴定蛋白质复合物的成员以及研究蛋白质与DNA、RNA、药物等的相互作用。
3. 蛋白质微阵列（Protein Microarray）：蛋白质微阵列是一种高通量技术，用于同时检测大量蛋白质的相互作用。
该方法将数千种蛋白质固定在玻璃片或芯片上，并与待测蛋白质进行相互作用。
通过检测待测蛋白质与已知蛋白质之间的相互作用，可以快速鉴定蛋白质复合物的成员，以及确定蛋白质的结合亲和力和特异性。
4. 质谱法（Mass Spectrometry, MS）：质谱法是一种基于蛋白质质量-电荷比的测量，用于鉴定蛋白质相互作用。
质谱法可分为两种类型：基于质量鉴定的质谱法（如蛋白质酶切质谱法）和基于质量比的质谱法（如蛋白质亲和质谱法）。
利用质谱法，可以鉴定蛋白质复合物的成员，并获得有关相互作用和结合位点的信息。
质谱法在高通量筛选和蛋白质组学研究中被广泛应用。
验证蛋白互作的方法
验证蛋白互作的方法生物学研究中，蛋白质互作是一个重要的研究领域，因为它关系到生命体的许多生物学过程如细胞周期、细胞信号转导、细胞凋亡等。
蛋白质互作研究的目的是了解蛋白质之间的相互作用，以及这些作用对于生物体内功能的影响。
为了获得这些信息，科学家们需要开发一些工具和技术来研究蛋白质之间的相互作用。
本文讲述了几种常用的蛋白互作验证方法。
一、酵母双杂交（Y2H）法酵母双杂交法是最常用的蛋白质互作验证方法之一。
由于其名称中含有“双杂交”，因此可以理解为将两个蛋白质“杂交”在一起，然后观察它们是否相互作用。
首先，将两个蛋白质分别构建成两个不同的来源的表达向量。
然后，在酵母细胞中，将这两个表达向量分别与GAL4激活子和GAL4结合蛋白相连，形成一个杂交蛋白。
如果这两个蛋白质发生相互作用，它们将结合并形成GAL4转录激活子，从而激活报告基因进行表达。
最终，研究人员可以通过观察转录活性的变化来判断这些蛋白质之间是否存在相互作用。
虽然酵母双杂交法是一种比较简单的技术，但有一些潜在问题需要研究人员注意。
首先，该方法只能检测蛋白质之间的直接相互作用，无法检测多个蛋白质之间的复杂相互作用。
其次，酵母细胞内的反应条件与活性可能与真实环境中相差很大，这可能导致结果的误判。
二、共免疫沉淀法（Co-IP）共免疫沉淀法是一种可以定量检测蛋白质相互作用的技术。
它的原理是将两个蛋白质在细胞内共同表达，并通过特异的抗体沉淀来寻找这两个蛋白质之间的相互作用。
具体来说，将目标蛋白质和其交替作用的伴侣蛋白质在细胞内共同表达。
然后，通过特异的抗体与其中一个蛋白质发生特异性结合，可以选择性地沉淀出另一个蛋白质。
最后，通过Western blot等技术检测被沉淀下来的伙伴蛋白的数量。
如果目标蛋白质和其伴侣蛋白相互作用，那么其它蛋白质沉淀下来时就会被一同检测到。
这种方法可以用来研究多个蛋白质相互作用的情况，还能够定量地衡量它们之间的相互作用强度。
不过该方法对于选择适当的抗体是非常准确的，因此需要仔细设计和验证实验条件来确保免疫沉淀过程的特异性和有效性。
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术
一、检测蛋白质与蛋白质相互作用① FRET技术（in vivo）FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。
该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。
然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。
如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。
② 酵母双、三杂交技术（in vivo）酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。
这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。
由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。
一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。
如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。
该系统的原理如下图所示：如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。
将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。
检验蛋白质与蛋白质相互作用的方法
检验蛋白质与蛋白质相互作用的方法
有多种方法可以检验蛋白质与蛋白质相互作用：
1. 免疫共沉淀（immunoprecipitation）：通过抗体选择性地沉淀出蛋白质复合物，并利用Western blot等技术检测相互作用蛋白质的存在。
2. 蛋白质亲和层析（protein affinity chromatography）：将一个蛋白质固定于树脂上，然后通过蛋白质与其交互作用的其他蛋白质在层析柱中保留，并通过洗脱和分析来确认相互作用。
3. 光敏交联（photocrosslinking）：通过使用光敏交联剂，使两个相互作用的蛋白质发生共价化学反应，并通过分子量分析等技术来确定相互作用。
4. 双杂交实验（yeast two-hybrid assay）：利用酵母中的转录激活子结构域和DNA结合结构域的解偶联来检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用。
5. 表面等离子共振（surface plasmon resonance）：利用传感器芯片上吸附的一个蛋白质通过流动相与另一个相互作用蛋白质进行实时监测，并测定其结合亲和力和动力学参数。
这些方法都能有效地检验蛋白质与蛋白质相互作用，具体选择哪一种方法还需根据实验目的和条件来决定。
蛋白质的相互作用研究方法
蛋白质的相互作用研究方法
蛋白质的相互作用研究方法可以分为以下几种：
1. 蛋白质互作筛选方法：包括酵母双杂交、蛋白质片段互作筛选、蛋白质互作文库筛选等。
这些方法通过检测蛋白质与其他蛋白质之间的相互作用，从而发现可能存在的相互作用蛋白质对。
2. 免疫共沉淀(IP)：通过特定抗体与目标蛋白质发生反应，将其与其他相互作用蛋白质一起沉淀下来，然后通过质谱分析等技术鉴定这些共沉淀蛋白质的身份。
3. 荧光共振能量转移(FRET)：通过标记在两个相互作用蛋白质上的荧光分子（供体和受体）之间的能量转移来检测蛋白质相互作用。
当供体与受体之间的距离在10-100埃范围内时，能量转移效率会增加。
4. 利用带电荷的染料分析：通过交联反应将具有不同电荷的染料引入到相互作用的蛋白质上，然后通过凝胶电泳或质谱分析等技术来鉴定交联蛋白质对。
5. 表面等离子体共振(SPR)：利用表面等离子体共振仪器，将一种蛋白质固定在芯片上，然后将另一种蛋白质溶液通过芯片，通过检测光信号的变化来确定是否存在相互作用。
6. 核磁共振(NMR)：利用蛋白质溶液中的核磁共振现象，鉴定蛋白质的三维结
构以及与其他蛋白质之间的相互作用。
以上是常见的蛋白质相互作用研究方法，不同的方法适用于不同的实验需求和研究目的。
蛋白质相互作用实验报告
蛋白质相互作用实验报告一、实验背景蛋白质是生命活动的主要承担者，它们在细胞内通过相互作用形成复杂的网络，共同执行各种生物学功能。
研究蛋白质相互作用对于理解生命过程、疾病发生机制以及药物研发具有重要意义。
本实验旨在探究两种特定蛋白质之间的相互作用关系。
二、实验目的1、确定目标蛋白质 A 和蛋白质 B 是否存在相互作用。
2、分析蛋白质相互作用的强度和特性。
三、实验材料与方法（一）实验材料1、蛋白质 A 和蛋白质 B 的纯品。
2、相关试剂，如缓冲液、抗体等。
3、实验仪器，包括离心机、移液器、电泳设备、荧光显微镜等。
（二）实验方法1、免疫共沉淀（CoImmunoprecipitation，CoIP）将蛋白质 A 和蛋白质 B 共同孵育，加入特异性抗体与其中一种蛋白质结合。
通过免疫沉淀将结合有抗体的复合物沉淀下来。
对沉淀下来的复合物进行 Western blot 检测，查看是否存在另一种蛋白质。
2、酵母双杂交系统（Yeast TwoHybrid System）构建分别含有蛋白质 A 和蛋白质 B 编码序列的载体。
将载体分别转化到酵母细胞中。
观察酵母细胞的生长情况和报告基因的表达，判断蛋白质相互作用。
3、荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）对蛋白质 A 和蛋白质 B 分别进行荧光标记。
使标记后的蛋白质相互作用。
通过检测荧光信号的变化来判断是否发生能量转移，从而确定相互作用。
四、实验结果1、免疫共沉淀实验结果显示，在沉淀复合物中同时检测到了蛋白质 A 和蛋白质 B，表明它们之间存在直接的相互作用。
2、酵母双杂交系统中，酵母细胞在特定条件下生长良好，并且报告基因得以表达，进一步证实了蛋白质 A 和蛋白质 B 的相互作用。
3、荧光共振能量转移实验中，观察到了明显的荧光信号变化，支持了蛋白质 A 和蛋白质 B 相互作用的结论。
五、结果分析与讨论1、综合三种实验方法的结果，均有力地证明了蛋白质 A 和蛋白质B 之间存在相互作用。
研究蛋白质相互作用的方法及原理
研究蛋白质相互作用的方法及原理蛋白质相互作用是生命科学研究中的重要问题，因为蛋白质在细胞内发挥着许多生物学功能，如信号转导、代谢调控和基因表达等。
在研究这些生物学过程时，了解蛋白质相互作用的方法和原理非常重要。
本文将介绍几种常见的研究蛋白质相互作用的方法及其原理。
1. 亲和层析法亲和层析法是一种将目标蛋白质从混合物中纯化出来的方法。
该方法利用目标蛋白质与其相互作用的配体（亲和剂）固定在填充层析柱中的树脂上，将混合物加入层析柱中，通过蛋白质与配体的特异性相互作用，使目标蛋白质与填充层析柱中的树脂结合，从而将其分离出来。
亲和层析法可用于研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子等相互作用。
2. 免疫沉淀法免疫沉淀法是一种利用抗体特异性结合目标蛋白质的方法。
该方法将抗体固定在磁珠或凝胶颗粒上，将混合物加入其中，抗体与目标蛋白质特异结合，将其从混合物中沉淀出来，从而实现目标蛋白质的纯化。
免疫沉淀法可用于研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸等相互作用。
3. 双杂交技术双杂交技术是一种检测蛋白质相互作用的方法。
该技术基于贝尔-拉布实验，将目标蛋白质的DNA序列与另外一种被称为“活化因子”的蛋白质DNA序列连接起来，形成一个双杂交体。
当该双杂交体与另一种包含另一个蛋白质DNA序列的双杂交体结合时，它们可以通过激活报告基因的表达来检测相互作用。
双杂交技术可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
4. 表面等离子共振(SPR)技术表面等离子共振技术是一种实时监测蛋白质相互作用的方法。
该技术基于利用表面等离子共振技术将一个蛋白质固定在芯片上，然后通过流动另一个蛋白质溶液，可以精确地测量这两个蛋白质之间的相互作用。
通过测定反应速率和平衡常数等参数，可以定量分析蛋白质相互作用的强度和亲和力。
表面等离子共振技术可用于研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子等相互作用。
总之，以上这些方法可以帮助研究人员深入了解蛋白质相互作用的机制和原理，在生命科学中有着广泛的应用。
生物物理化学实验报告——ITC
结构化学实验报告等温滴定量热法测定两种蛋白质间相互作用2012/5/5实验目的：了解MicroCal iTC200等温滴定量热仪在测量蛋白质相互作用中的应用，了解仪器基本工作原理，学习蛋白质相互作用的测定步骤和仪器操作，简要分析实验结果。
实验原理：在研究两种或两种以上的蛋白质的功能时，相关蛋白质之间常常存在相互作用（常常是氢键或范德华力），如果两蛋白可以彼此结合，则结合的过程中会放出一定的热量。
所以，通过测定蛋白质相互作用时放出热量的大小，可以得到蛋白相互作用时的结合常数K D、化学计量比N和焓变ΔH，从而由热力学公式ΔG = RT lnK D和ΔG = ΔH -TΔS可以进一步得到反应的自由能变化。
MicroCal iTC200等温滴定量热仪的基本原理就是实现了蛋白质之间的微量滴定操作和微小热量的精密测量。
通过滴定操作和热量的测量，量热仪可以给出热量-摩尔比曲线：图像中曲线的突跃中点对应的化学计量比就是两种蛋白质相互作用的化学计量数N ，突跃中点处曲线的斜率就是两种蛋白相互作用的结合常数K D 。
决定曲线形状的主要参数是C 值：C = 滴定池中的蛋白浓度/ KD = [M]tot/ KD × NC 值越大，曲线越陡；C 值越小，曲线越平缓，没有明显的突跃。
一般C 值在10-100之间实验效果最好。
实验材料：蛋白质tse1（17KD）蛋白质tsi1（16KD）实验步骤：1.使用紫外分光光度计在280nm检测波长下测定蛋白质溶液中蛋白质的浓度，根据所需要的蛋白质浓度比稀释蛋白质溶液。
2.在量热仪的注射器和样品池中分别加入两种不同的蛋白质样品。
⑴注射器加样①将装有约100微升样品的PCR管放入样品试管槽。
②注射器移到“Rest Position”；然后左手转动注射器上端，使注射器的连接孔对准支架上的孔。
右手将白色细管顶部的连接头水平对准注射器连接孔，先轻轻将乳白色连接头旋入连接孔，随后将乳白色连接头后的金属连接头轻轻拧紧即可。
蛋白质与蛋白质相互作用的检测方法
蛋白质与蛋白质相互作用的检测方法蛋白质与蛋白质相互作用是调节细胞内外的生命过程不可缺少的过程。
因此，有效地检测和研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用具有重要意义。
目前，有许多方法可以检测蛋白质与蛋白质相互作用，例如传统的生化实验、蛋白质结晶、核磁共振等。
本文将对常见的检测蛋白质与蛋白质相互作用的方法做一详细介绍。
1. 表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）技术SPR技术利用将某一配体固定在芯片上的方法，监测样品中的交互分子（配体和配体的模拟物质）与溶液中生物大分子之间的交互作用，这种方法可以被用于定量分析蛋白质与蛋白质的结合能力和动力学参数。
SPR的原理基于光的表面等离子共振现象，其基本的原理是，当一束光源通过激发表面电离振荡时，会在金属表面的一侧形成一层薄的电荷区，这形成的电场会部分穿透到溶液中的试样中，因为试样中的高分子与金属表面的电场存在交互作用，而改变金属表面的局部折射率，阻尼了电场振荡，则会影响反射和折射的光子。
利用这些影响，可以通过反射光强的检测来监测其与蛋白质之间的交互作用。
2. RNA交互固定蛋白质标记（RNA Interactome Capture）技术RNA Interactome Capture技术是一种基于RNA分子特异性的分子识别技术，可以用来分离和鉴定与RNA相互作用的蛋白质。
其原理是利用生物素标记的RNA分子固定蛋白，这可以通过RNA蛋白质相互作用来捕获蛋白质，并将其分离并鉴定。
3. 凝胶滤渗法（Gel filtration Chromatography，GFC）Gel filtration Chromatography是一种分子分离技术，主要通过分离样品中的差异和纯化样品，可以分离出大小、形状等因素不同的蛋白质以及富含特定簇周期的化合物。
该技术主要应用于蛋白质纯化和筛选，其原理是基于纯化的蛋白质与使用的凝胶柱基质之间的分子大小识别。
检测两种蛋白质之间相互作用
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较1. 生化方法●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。
缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。
另外灵敏度不如亲和色谱高。
●Far-Western又叫做亲和印记。
将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。
缺点是转膜前需要将蛋白复性。
2. 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。
当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。
而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。
该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。
缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。
3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。
分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。
缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。
融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。
不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。
5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。
荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。
它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。
蛋白质相互作用的研究方法
蛋白质相互作用的研究方法蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）研究方法可以分为生化方法、细胞生物学方法、生物物理化学方法和计算方法等多个方面。
以下将详细介绍几种常用的研究方法。
1. 酵母双杂交法（Yeast Two-Hybrid, Y2H）酵母双杂交法是一种广泛应用的PPI研究方法。
该方法利用酵母细胞中两个蛋白质结合后的活性报告基因表达，从而实现对蛋白质相互作用的筛选和鉴定。
该方法的优点是操作简单、高通量性能强，但也存在一些局限性，如可能存在假阳性结果和只能检测胞内相互作用。
2. 免疫共沉淀法（Immunoprecipitation, IP）免疫共沉淀法是一种常用的生化方法，用于鉴定蛋白质相互作用。
该方法基于抗体的特异性，将靶蛋白及其结合蛋白共同沉淀下来，通过蛋白质分析技术（如质谱分析）鉴定共沉淀的蛋白质。
该方法适用于研究细胞内和细胞间的蛋白质相互作用，但需要针对每个靶蛋白制备特异性抗体。
3. 原位近距离显微镜法（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）FRET是一种用于研究蛋白质相互作用的生物物理化学方法。
该方法通过将两个蛋白质分别与一对荧光染料标记，根据能量转移来检测蛋白质间的相互作用。
FRET可以在活细胞和组织中进行，具有高时空分辨率，但需要合适的显微镜设备和特定的染色体系。
4. 表面等离子体共振传感器法（Surface Plasmon Resonance, SPR）SPR是一种用于检测蛋白质相互作用的生物物理化学方法。
该方法通过检测表面等离子体共振信号的变化来定量分析蛋白质间的结合动力学和亲和性。
SPR具有高灵敏度和实时监测能力，可用于定量研究蛋白质相互作用，但需要具备专业的设备和表面修饰技术。
5. 结构生物学方法结构生物学方法包括X射线晶体学、核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）和电子显微镜（Electron Microscopy, EM）等。
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检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较1。
生化方法●免疫共沉淀免疫共沉淀就是以抗体与抗原之间得专一性作用为基础得用于研究蛋白质相互作用得经典方法。
改法得优点就是蛋白处于天然状态,蛋白得相互作用可以在天然状态下进行,可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作用得蛋白复合体。
缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀得蛋白复合物时候为直接相互作用得两种蛋白。
另外灵敏度不如亲与色谱高、●Far－Ｗeｓtern又叫做亲与印记、将PAGE胶上分离好得凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素得诱饵蛋白发生作用,最后显影。
缺点就是转膜前需要将蛋白复性。
2. 等离子表面共振技术(Ｓｕｒfａce plaｓｍon ｒeｓonａｎce)该技术就是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚得技术膜表面、当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用,那么两者得结合将使金属膜表面得折射率上升,从而导致共振角度得改变。
而共振角度得改变与该处得蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间得相互作用。
该技术不需要标记物与染料,安全灵敏快速,还可定量分析。
缺点:需要专门得等离子表面共振检测仪器。
ﻫ３、双杂交技术原理基于真核细胞转录因子得结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立得结构域组成。
分别使结合域与激活域同诱饵蛋白与猎物蛋白形成融合蛋白,在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域与激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因。
缺点:自身有转录功能得蛋白会造成假阳性、融合蛋白会影响蛋白得真实结构与功能。
不利于核外蛋白研究,会导致假隐性。
ﻫ５. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近(〈100埃)时,它们之间可发生能量转移得现象、荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生得构象变化,也能研究分子间得相互作用。
它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子得构象变化,能够定性定量得检测相互作用得强度。
缺点此项技术要求发色基团得距离小于100埃。
另外设备昂贵,还需要融合GFP给蛋白标记。
ﻫ此外还有交联技术(cross—lｉnＫinｇ),蛋白质探针技术,噬菌体展示技术(Phagｅ displaｙ)以及生物信息学得方法来检测蛋白质之间相互作用。
1，酵母双杂交 1—5酵母双杂交系统就是将待研究得两种蛋白质得基因分别克隆到酵母表达质粒得转录激活因子(如GＡＬ4等)得ＤNＡ结合结构域基因与转录激活因子(如GＡＬ4等)激活结构域基因,构建成融合表达载体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用得系统酵母双杂交得原理就是,把报告基因HＩS3 与l ａ c Ｚ整合到酵母细胞基因组中,并受转录因子GAL4 得调控表达。
一旦 GＡL4 蛋白结合到HＩＳ３与l a c Z调控序列相应得位点,则启动报告基ﻫ因得表达。
通过检测报告基因得表达判断阳性或阴性。
实际应用中,把GAL4 基因分成两个部ﻫ分: DNA 结合区( gal４DNA bｉnｄｉｎg ｄomain, ＧBD)与激活区(ｇal４ａctivatiｎg domaｉｎ, GAD)。
分别把GBD 与 GAD 构建到两个不同得载体上,并能表达相应得两个融合蛋白( GBＤ－X 与GAD－Y)。
然后把 GＢD—X 与 GＡＤ－Y 两种载体共转染到带有报告基因得酵母细胞中、当ＧBD-X融合蛋白中 X 蛋白与 GAD—Y 融合蛋白中 Y 蛋白发生相互作用时(或结合在一起时),就使得ﻫ原本分开得 GＢD 与ＧAＤ蛋白靠近并具有完整得GAL4 蛋白得功能,从而能够激活报告基因得表达、ﻫ( １) 筛选相互作用得蛋白酵母双杂交技术能用于对cＤNA 文库得筛选。
把您要研究得蛋白亚克隆到ＧBD 载体上,ﻫ作为“诱饵”蛋白。
把文库蛋白基因亚克隆到ＧAＤ载体上。
然后就可以在文库中寻找那些能够与“诱饵”蛋白可以相互作用得蛋白。
也许您能够筛选到多株阳性克隆。
虽然酵母双杂交技术具有广泛得应用价值,但正如任何其它技术一样,酵母双杂交技术也有一定得局限性。
酵母双杂交技术最大得弱点就就是假阳性出现率、所以筛选到得阳性克隆需要进一步得鉴定与功能数据支持。
(2) 确定参与结合作用得结构域或 motiｆﻫ当您确定了两个蛋白质分子之间有相互作用后,利用酵母双杂交技术可以精细研究蛋白质分子中那些结构起结合调节作用、您可以先把一个蛋白进行随机缺失,制备一系列缺失体,然后来检测这些缺失体与另一个蛋白质结合力得大小,直到发现在蛋白质两两分子间起决定作用得氨基酸序列(称为结构域或ｍotiｆ)。
如果一个蛋白分子中具有已知得结构域或moｔif,也一样进行缺失,瞧就是否这些已知得结构域或 mｏｔif 参与结合调节作用。
有得情况下蛋白质相互作用可能与蛋白质得磷酸化状态有关。
这时就需要对可能得磷酸化位点进行点突变,检测这些磷酸化位点就是否参与调节蛋白质得结合作用。
2, GST沉淀实验(GＳT—puｌl dｏwn实验)(细胞外蛋白质相互作用) 5-11ﻫ上面提到,用酵母双杂交方法筛选到得蛋白需要作进一步得鉴定。
鉴定方法之一就就是 GST沉淀实验。
GＳT 沉淀实验主要就是用来证明蛋白质胞外得相互作用、蛋白质在胞外得相互作用排除了酵母细胞内复杂体系得干扰,,比较直接地检验蛋白质分子之间存在得物理得相互作用。
同酵母双杂交实验一样,运用此法也可以证明相互作用得蛋白分子中就是否有参与调节作用得结构域或 motif。
GST 沉淀实验原理就就是, 把您要研究得蛋白基因亚克隆到带有ＧＳT(谷胱甘肽转移酶)基因得原核表达载体中,并在细菌中表达 GST 融合蛋白( GＳT－X)、把GST 融合蛋白挂到带有 GSＴ地物得Ｓｅpharose bｅaｄs 上,然后把另一种蛋( Y)白加入其中。
由于蛋白质之间得结合作用,形成了这样得复合物: GＳT-X——-－Y。
这一复合物与固体支持物( Sephaｒoｓe beaｄs)又结合在一起,可以被沉淀下来。
此法又有在不同情况下得具体应用,以下一一作介绍。
ﻫ(1) ＧST 融合蛋白与重组蛋白得相互作用ﻫＧＳT 融合蛋白就是在原核表达得,所以没有经过过多得象真核细胞内具有得蛋白修饰作用。
所以另一种用来检验相互作用得蛋白也可以用原核表达出来,也就就是所谓得重组蛋白、当ＧST融合蛋白把重组蛋白沉淀下来,然后用重组蛋白得抗体作 Western bｌoｔting 检测、ﻫ(2) GST 融合蛋白与体外 TNT 系统合成得多肽或蛋白得相互作用用来检验与GST融合蛋白相互作用得蛋白或多肽也可以用TNT 体外蛋白合成体系进行合成,并且还可以在要合成得蛋白或多肽N 端或C端加上便于检测得标签。
ＧST融合蛋白沉淀下来得蛋白或多肽可以用该蛋白或多肽得抗体或标签抗体进行Wｅｓterｎblotｔiｎｇ检测。
如果蛋白之间结合力非常弱,用Western ｂlotting检测方法难以检测到, 您可以在ＴＮＴ体外合成时给蛋白进行同位素( S３2)标记。
这样沉淀下来得蛋白进行放射自显影,检测灵敏度将极大提高、(３) ＧST 融合蛋白与细胞内源性蛋白质得相互作用GST融合蛋白还可以把细胞提取物中有相互作用得内源性蛋白质沉淀下来。
如果内源性蛋９2白含量低或结合力弱,可以采用脉冲法使细胞在某一段时间内合成得所有蛋白都标记上放射性同位素( S32),然后提取细胞总蛋白与GST融合蛋白温育。
GＳT融合蛋白沉淀下得带有放射性标记得蛋白跑电泳,进行放射自显影。
(4) ＧST 融合蛋白与细胞内瞬时表达得蛋白质得相互作用ﻫ当内源性蛋白质含量低,并且有可能影响蛋白质得相互作用,也可以把该蛋白得基因转染到靶细胞内进行过表达,然后检验蛋白质相互作用。
(5) GSＴ融合蛋白与待测蛋白得相互作用有可能与待测蛋白得磷酸化状态有关ﻫ在进行ＧST 沉淀实验时,有时也会遇到比较复杂得情况,具体情况具体分析,分别对待、比如,两个蛋白质之间发生相互作用时有可能与蛋白磷酸化状态有关。
或者蛋白首先被磷酸化后方能产生相互作用,或者磷酸化得蛋白必需脱磷酸化后才能产生相互作用。
如果您确实在您得实验中发现了其中一种情况,这将就是一个非常有意义得结果。
3,免疫共沉淀(ｃo—immunｏprecｉpitation )(细胞内蛋白质相互作用 ) 9－16ﻫ免疫共沉淀技术用来证明蛋白质在胞内就是否有相互作用、一般来说, 两种蛋白在细胞内发生相互作用时会形成两种蛋白得复合物, 这样就可以先用一种蛋白得抗体把免疫复合物沉淀下来,然后用另一种蛋白得抗体进行Ｗesｔern bｌottinｇ检测,瞧两种蛋白之间就是否确实形成免疫复合物,并能与 proｔｅｉn A/Ｇ agarose 一起沉淀下来。
免疫共沉淀原理简单,但技术极为复杂。
因为细胞内蛋白种类繁多,制约因素多。
如果两种蛋白之间可以发生相互作用,并不就是这两种蛋白所有分子都参与结合作用,也可能只有极少部分蛋白分子结合在一起(足以满足细胞功能需要)。
在提取细胞蛋白时,如果条件不当就会破坏两种相互作用蛋白形成得复合物得稳定性使得免疫共沉淀实验失败。
如果两种蛋白在细胞内得结合力确实非常弱,那么免疫共沉淀也难以成功。
如果知道发生相互作用得两个蛋白都就是胞核蛋白,那么可以通过提取核蛋白,再进行免疫共沉淀实验,这样会大大减低背景得干扰。
关于两种蛋白质之间胞内得相互作用,有时确实无法用免疫共沉淀实验证明。
( 1) 细胞内过表达蛋白得免疫共沉淀ﻫ证明蛋白质胞内相互作用时,可以选择一个高效瞬时过表达系统(至于这一系统就是否有内源性靶蛋白无关紧要)。
一般采取 COS 细胞作为真核表达株。
把两种蛋白基因共转染到 COS 细胞内进行表达。
由于人为进行大量表达,所以在胞内两种蛋白形成相互作用得复合物得量也相应增多。
如果您手头没有这两种蛋白得抗体,可以把这两种蛋白得一端分别加上标签以融合蛋白形式表达,然后用商业化得抗标签抗体进行免疫共沉淀与 Wesｔｅrn blｏttｉng 检测。
ﻫ( ２) 细胞内源性蛋白得免疫共沉淀ﻫ把两种蛋白共转染到COS 细胞内进行过表达,进行免疫共沉淀实验,相对容易成功,但就是这一结果毕竟具有人工性,不能代表生理条件下真实得蛋白质相互作用。
要想克服这一弱点,可以做内源性得免疫共沉淀实验。
这一技术要求极高,难度极大,但也最有说服力。
因为细胞内内源性蛋白含量低,结合在一起形成复合物得量更低,难以检测。
首先要证明所选择得细胞９３系就是否具有这两种内源性得蛋白。
另外,用于免疫沉淀与Ｗeｓtern ｂlottiｎg 检测得体要好。
细胞裂解、收集以及免疫沉淀时时条件要温与,以保持蛋白复合物得天然结构。
( 3) 组织内蛋白得免疫共沉淀ﻫ在体外可以大量培养细胞,然后制备细胞提取物,做内源性免疫共沉淀。