条件性基因敲除与敲入
传统ES打靶基因敲除敲入小鼠技能
传统ES打靶基因敲除敲入小鼠技能传统ES 打靶基因敲除/敲入小鼠技术技术原理传统的基因打靶技术制备基因敲除(KO )/敲入(KI )基因打靶技术是建立在DNA同源重组与胚胎干细胞等技术基础上的分子生物学技术。
同源重组是指当外源DNA 片段与宿主基因组片段同源性高时,同源DNA 区部分可与宿主DNA 的相应片段发生交换(即同源重组)。
基因打靶就是通过同源重组技术将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点,以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。
基因打靶技术目前已被广泛认为是一种理想的特定修饰与改造生物体遗传物质的最佳方法。
尤其是条件性和诱导性基因打靶系统的建立,使得对基因在时间和空间上的靶位修饰更加明确、效果更加精确可靠,该技术的发展已经为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究和治疗手段,并已显示出巨大的应用前景及商业价值。
服务流程和周期、管路敷设技术通过管线不仅可以解决吊顶层配置不规范高中资料试卷问题,而且可保障各类管路习题到位。
在管路敷设过程中,要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层防腐跨接地线弯曲半径标高等,要求技术交底。
管线敷设技术中包含线槽、管架等多项方式,为解决高中语文电气课件中管壁薄、接口不严等问题,合理利用管线敷设技术。
线缆敷设原则:在分线盒处,当不同电压回路交叉时,应采用金属隔板进行隔开处理;同一线槽内,强电回路须同时切断习题电源,线缆敷设完毕,要进行检查和检测处理。
、电气课件中调试对全部高中资料试卷电气设备,在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验;通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系,根据生产工艺高中资料试卷要求,对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验;对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作;对于继电保护进行整核对定值,审核与校对图纸,编写复杂设备与装置高中资料试卷调试方案,编写重要设备高中资料试卷试验方案以及系统启动方案;对整套启动过程中高中资料试卷电气设备进行调试工作并且进行过关运行高中资料试卷技术指导。
条件性基因敲除与敲入ppt课件
实现基因敲除的方法有多种,但基本上都是采用同 源重组或随机整合的方法,让一段没有生理功能的 DNA片段在细胞内取代正常基因,从而破坏正常基 因的功能。基因敲除主要是在胚胎干细胞 (embryonic stem cells,ESC)水平进行操作。胚胎干 细胞是早期胚胎细胞经体外培养建立的全能细胞系, 在体外培养时保持了未分化状态,可以传代增殖, 在发育上类似于早期胚胎细胞团的细胞,具有与早 期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大 特点,是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性 状遗传机制的理想模型。首先在这种细胞内进行分 子水平的基因操作,之后再使这种已经发生了基因 改变的细胞发育成为一个完整的生物体。这样就可 以在整个生物体内实现预期的基因改变。
体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用; ④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控
之下,从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器 官,以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生,进而 发挥作用,这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一 点。
11
3.Cre/loxP系统的工作流程
利用Cre/loxP系统实现体内某特定基因在特定条件 下的敲除,需要两只转基因小鼠。
条件性基因敲除与敲入
1
在科学研究中,为了明确某一组织或器官的功能, 常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除,进 而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切 除部分的功能。生命科学发展到今天,人们对于生 命现象的认识已经逐步深入到了分子水平,而上述 的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想 仍然有效。具体地说,就是在分子水平破坏想要研 究的基因,然后观察生物体的生理指标、功能、整 体形态、组织结构、发育过程的变化等,进而推测 相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。此外,为了研究某种疾病与某个基因之 间的关系,常向生物体内人为引入某个基因,然后 观察实验动物出现的各种变化,从而推测疾病与基 因的关系,这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。
基因敲除
1(CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。
CRISPR/Cas9利用一段小 RNA 来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。
刚刚发表在《科学》(Science)(2013年,1,3)的两篇文章,证明Cas9系统 能在293T, K562, iPS等多种细胞中,进行有效的靶向酶切,非同源重组(NHEJ)、同源重组 (HR)效率在3-25%之间,与TALEN酶切效果相当。
文章还证明,多个靶点可以同时进行靶向酶切。
这些工作将进一步靶向基因操纵推向高潮,使得多个基因敲除、敲入变得更为简单、高效。
虽然目前,大家对该技术的特异性,免疫原性还了解甚少,但是随着研究的不断深入,一定会有很大的改善。
在未来的2-3年,动植物育种、干细胞定向分化、遗传疾定点修复等等都将得到迅猛的发展。
图1. RNA指导的CRISPR/Cas9基因剪切系统唯尚立德已经利用CRISPR/Cas9在斑马鱼,哺乳动物细胞上成功实现基因敲除和基因敲入,现推出如下技术服务:1. 应用CRISPR /Cas9提供稳定细胞系靶向基因敲除、敲入技术服务;2. 应用CRISPR /Cas9提供模式生物靶向基因技术服务,包括小鼠,大鼠,斑马鱼等;近几十年来,随着全基因组测序技术的不断成熟,我们在各种细菌和古细菌(archaea)中也陆续发现了很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences,即CRISPR序列,这就是二十多年前日本科学家发现的那个序列)和CRISPR相关基因(CRISPR-associated genes, Cas gene)。
研究发现,这些CRISPR序列与很多病毒或者质粒的DNA序列是互补的,说明这套CRISPR–Cas系统很有可能是生物体抵御病毒等外来入侵者的一套特异性防御机制,就好像是另外一套适应性免疫反应系统(adaptive immune system)。
基因打靶 cre-loxp重组酶系统
基因打靶基因打靶包括:胚胎干细胞的获得和培养、打靶载体的构建、重组ES细胞的筛选、嵌合体小鼠的制备、基因敲除小鼠的建立、Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除、基因敲入和大规模ES细胞突变库的建立。
基本概念:1.基因打靶:是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构,从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。
2.基因敲除:是使用基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷,从而在突变体内。
3.丧生正常的功能,来推测这些基因或元件原来在体内的功能。
基因敲入:在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件,使之表达或发挥作用,从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。
4.基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。
它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上,并促进了相关技术的进一步发展。
自1987年早期胚胎干细胞技术建立及第一例基因剔除小鼠诞生以来,基因打靶的研究进展迅速,给现代生物学和医学研究带来了革命性的变化,并直接引发了现代生物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展,成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。
一、胚胎干细胞的获得和培养基因打靶中用的小鼠ES细胞系有:D3、E14、R1、J1、CCE,均来源于129小鼠品系和其杂交品系(因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向,是基因敲除的理想实验动物)。
ES 623和B6-IIIES细胞系,来源于C57BL/6小鼠品系。
BALB/c-I,来源于BALB/c小鼠品系。
常用的饲养层细胞为PMEF(小鼠原代胚成纤维细胞。
PMEF需6 Gy的X 射线照射或丝裂霉素C处理细胞抑制生长后才能用作饲养细胞)。
建立ES细胞的过程中,最好采用只传了2-3代的原代小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞,所取得的ICM(内细胞团)只有10%-30%的几率建立ES细胞系。
一旦ES 克隆被确定,接下来应该考虑检查ES细胞的核型。
四环素诱导基因敲除敲入技术服务详解
四环素诱导基因敲除敲入技术服务详解Cre重组酶是一种位点特异性重组酶,能介导两个LoxP位点(序列)之间的特异性重组,使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。
LoxP序列是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成,8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。
Cre在催化DNA 链交换过程中与DNA共价结合,13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。
Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程,可以分成三种情况:1.如果两个LoxP位点位于一条DNA链上,且方向相同,Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列;2.如果两个LoxP位点位于一条DNA链上,但方向相反,Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位;3.如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上,Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。
另外,Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域,而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。
利用这一特点,人们在构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列,以用于特定的基因突变或修复,增加了该系统的应用范围。
诱导性基因敲除以Cre/loxp系统为基础,但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点,通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性,从而在loxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。
常见的几种诱导性类型如下:四环素诱导型;干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。
Cre-LoxP图:该系统包含两个互补系统,分别为tTA依赖和rtTA依赖的基因敲除系统,现在又被称为Tet―Off (tTA依赖)系统和T et―On (rtTA依赖)系统。
基因敲除小鼠技术
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术,该技术从上世纪七八十年代诞生以来,已有近四十年的历史,经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰,并逐渐从基础研究实验室转向商业模式,成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术,该技术从上世纪七八十年代诞生以来,至今已有近四十年的历史,经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰,在小鼠模型构建方面日趋完善,并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样,逐渐从基础研究实验室转向商业模式,成为一项高度标准化的新兴产业,催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此,传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷,如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等,而ZFN和TALEN等新技术的出现,或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的,Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组(homologous recombination)的原理,首次实现了ES的外源基因的定点整合(targeted integration),这一技术称为"基因打靶"(gene targeting)或"基因敲除"(gene knockout),利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠(KO Mice: knockout mice);由于这一工作,Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组(homologous recombination)定义:是指发生在姐妹染色单体(sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
条件性基因敲除的基本原理Cre/loxP重组系统
条件性基因敲除的基本原理Cre/loxP重组系统条件性基因敲除的基本原理 Cre / loxP 重组系统条件性基因敲除主要是通过Cre/10xP或者Ftp/FRT重组系统来实现的。
这两个系统都是位点特异性重组酶系统,已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。
这两个系统的应用,可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。
此外,若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合,还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。
1.Cre/loxP系统的原理Cre/loxP系统来源于F1噬菌体,可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两种成分:①一段长34bp的DNA序列,含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
这段34bp序列是重组酶识别的位点,被称为loxP位点(10cus of X―over in P1)。
②Cre重组酶(cyclizationrecombination),它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白,可以引发loxP位点的DNA重组。
任何序列的DNA,当其位于两个loxP位点之间的时候,在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同),要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反),如图所示。
Cre/loxP系统的作用机制2.Cre/loxP系统优点Cre/10xP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用,是由该系统的诸多优点决定的:①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后,可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程,因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子;②loxP位点是一段较短的DNA序列,因此非常容易合成;③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质,因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用;④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下,从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官,以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生,进而发挥作用,这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。
基因敲除技术
.概述:基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展,除了同源重组外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和iRNA,它们同样可以达到基因敲除的目的。
2.实现基因敲除的多种原理和方法:2.1.利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。
80年代初,胚胎干细胞<ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年,首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年,Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在,运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1>:a.基因载体的构建:把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因,TK 基因等>的载体上,成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能,所以一般设计为替换型载体。
b.ES 细胞的获得:现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞,最常用的是鼠,而兔,猪,鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是129及其杂合体,因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向,是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2,3] c.同源重组:将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射>导入同源的胚胎干细胞(ES cell>中,使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中,从而得以表达。
一般地,显微注射命中率较高,但技术难度较大,电穿孔命中率比显微注射低,但便于使用。
基因敲除
基因敲除技术(组图)一.概述:基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展,除了同源重组外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和iRNA ,它们同样可以达到基因敲除的目的。
二.实现基因敲除的多种原理和方法:1.利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。
80年代初,胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年,首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年,Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在,运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):①.基因载体的构建:把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因,TK 基因等)的载体上,成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能,所以一般设计为替换型载体。
②.ES 细胞的获得:现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞,最常用的是鼠,而兔,猪,鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是129及其杂合体,因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向,是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2,3]③.同源重组:将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中,使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中,从而得以表达。
一般地,显微注射命中率较高,但技术难度较大,电穿孔命中率比显微注射低,但便于使用。
如何正确选择基因敲除敲入质粒?
如何正确选择基因敲除敲⼊质粒?研究基因功能最有效的⽅法之⼀是⽤实验室设计的DNA⽚段取代或破坏基因,使其失活或“敲除”。
构建特殊的质粒可以通过同源重组替代酵母、⼩⿏或果蝇中的基因。
其原理很简单:将⼀个带有⽬标序列修复模板的质粒递送到细胞,该细胞将模板与内源性基因重组。
在这⾥,我们将主要探讨⽤于灭活哺乳动物细胞中特定基因的技术和质粒。
尽管CRISPR的敲除/敲⼊系统⾮常流⾏,但这个系统仍然很有价值,特别是在CRISPR不能使⽤的情况下(例如,附近没有合适的PAM序列,或者你感兴趣的基因很难⽤gRNA特异性靶向)。
在选择敲除策略时,⼀定要记住这些技巧!敲除质粒1.同源重组是⼀种准确修复破坏性的双链断裂的机制,核苷酸序列在两个相似或相同的DNA分⼦之间进⾏交换。
基因靶向则是利⽤这⼀⾃然过程,运⽤⼀种特殊设计的含有同源序列的载体,将⽬标基因位点替换为同源序列。
为了更了解这个过程,我们将介绍⼀个旨在敲除给定基因的第2外显⼦的实验。
设计你的⽬标结构。
为了在细胞中重组,⾄少需要2 kb的同源序列,但6到14 kb的同源序列是靶向结构的典型特征。
在图1所⽰的例⼦中,与⽬标基因外显⼦1和外显⼦3相对应的序列已克隆到载体抗⽣素抗性基因的任意⼀侧。
为了避免选择那些结构随机整合到基因组中的细胞,像HSV 胸苷激酶(HSV-tk)这样的阴性选择标记被包含在⼀个同源臂之外。
当我们稍后选择细胞时,我们将⾸先对抗⽣素抗性基因进⾏阳性选择,然后对阴性选择标记进⾏反选择——这后⼀步将杀死许多随机整合了全部或⼤部分质粒的细胞。
2.呈递质粒给宿主细胞。
重组后,⽬标基因的第2外显⼦将从染⾊体上移除,并被抗性基因取代。
这样基因就被破坏或敲除了。
3.利⽤正负选择确定正确的重组细胞。
重组是⼀个偶然事件,所以你必须选择⽽不是筛选已经发⽣重组的细胞。
新霉素、嘌呤霉素和潮霉素耐药基因通常⽤于阳性选择。
正选择标记对重组进⾏选择,⽽负选择标记对不适当的、随机的到不同位点的重组进⾏选择。
基因敲除-简介
用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的目
的(gene knock-out)。
同源重组(Homologus Recombination) 是指发生在姐妹染色单体(sister
chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重
新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化,如原核生物细胞内的RecA、 RecBCD、RecF、RecO、RecR等;以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11Rad50等等。
glrA
Ta
actin
Ta
hph
glrA
ble
3.9 kb
RT-PCR验证∆glrA及cglrA菌株
影响因素
细菌的限制性修饰系统。
合适的选择性标记。 高效的转化技术(CaCl2法、电转化、原生质体、结合转 移、农杆菌介导的转化)。
Thanks!
1、建立高效的遗传转化系统。
2、构建基因敲除载体(最好带有双标记)。
3、转化实验。
4、筛选基因敲除的转化子。
5、验证转化子。
构建glrA 基因缺失株、遗传互补株和高表达菌株
PCR 2 (2.67 Βιβλιοθήκη b)∆glrA ∆glrA
WT
WT
NC
PCR 1 (1.52 kb)
NC
Ladder
3 kb 2 1.6 1
除了同源重组外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成 功的有基因的插入突变(insertional mutagenesis) 和RNAi
(gene knock-down) 。
a.基因载体的构建
把目的基因和与细胞 内靶基因特异片段同源 的DNA 分子都重组到带 有标记基因的载体上, 成为重组载体。
基因敲除小鼠饲养繁殖技巧
基因敲除⼩⿏饲养繁殖技巧科研狗但凡要做动物实验的,哪个不需要伺候⼩⿏?每天好吃的好喝地伺候着,定期更换垫料,还要操⼼它们的⼈⽣⼤事,给它分配对象,⽣了娃还要给帮它们做“亲⼦鉴定”,看见⼩⿏脱发了,要想办法,母⿏不⽣了,要想办法。
回头再看看⾃⼰,没头发,还没对象,天天愁⽂章,担⼼毕不了业,全指望⼩⿏们加油,让⾃⼰早⽇出成果,所以可不得好吃好喝的伺候它们嘛!尤其是基因敲除⼩⿏,⾝价昂贵,从接到它的那⼀刻起,整个⼈都⼜兴奋⼜紧张,⽣怕怠慢了这些⼩家伙,那么收到基因敲除⼩⿏后要如何制定计划进⾏扩群繁殖以满⾜实验需要呢?除了了解所选品系的⽣活习性外,我们还要考虑⾃⼰需要的基因编辑⿏可能出现哪些问题,有没有解决或者是改善的⽅法,这些我们可以通过查阅⽂献看有没有关于该基因敲除⼩⿏的相关信息并作出⼀个初步判断。
1.背景品系的特点这个不⽤多说,需要做动物实验的同学,谁还没养过⼏只⼩⿏呀,养之前肯定已经把它的⽣活习性、繁殖特点、饲养要求等了解的很清楚了,举个栗⼦,⽐如说C57BL/6J,该品系的雄⿏好⽃,尤其是刚断奶后不同窝的雄⿏不宜放⼀笼饲养。
2.饲养环境的要求应尽可能地给⼩⿏提供适宜的⽣活环境和营养,这⽅⾯可以参照国家标准来进⾏饲养管理。
⽐如,⼩⿏对于噪⾳、光照⽐较敏感,所以我们应给⼩⿏提供安静的环境,尽量选在⼈员⾛动少的地⽅,也不要频繁查看⼩⿏情况,这样⼩⿏会有压⼒的。
母⿏有筑巢的天性,可以向笼中放柔软的棉垫,⿎励其筑巢,有助于提⾼产量。
3.基因敲除⼩⿏饲养管理应注意哪些问题⼤多数基因敲除⼩⿏相对野⽣型⼩⿏⽽⾔,在某些⽅⾯会存在或⼤或⼩的问题,所以我们需要查阅相关的⽂献,看看有没有该基因敲除⼩⿏的⽂献报道,该基因被修饰后会出现哪些问题?这些问题有没有解决或者是改善的⽅法。
如果是某种基因被修饰后会导致⼩⿏不能合成某种物质,那么可以给⼩⿏额外补充该物质;若是基因敲除⼩⿏的成活率低,问题有可能出现在着床期⾄成年期的任意时间段,通过代乳和改善饲养条件也许能得以解决;如果基因敲除⼩⿏的⽣殖⼒低。
基因敲除
基因敲除基因敲除(knockout)是指一种遗传工程技术,针对某个序列已知但功能未知的序列,改变生物的遗传基因,令特定的基因功能丧失作用,从而使部分功能被屏蔽,并可进一步对生物体造成影响,进而推测出该基因的生物学功能。
指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组,从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列,整合入受体细胞的基因组中。
此法可产生精确的基因突变,也可正确纠正机体的基因突变。
基因嵌入又称基因置换,它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点,用同源序列的目的基因整个置换内源基因。
用于基因敲除和基因嵌入的技术有Cre/Lox P系统、FLPI系统等。
步骤:获得干细胞基因敲除一般应用于鼠,而最常用的鼠的种系是129及其杂合体,因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向,是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用,最来自于C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。
由于这些远交系遗传背景复杂,所得到的模式小鼠往往不能得到重复性好的实验结果,所以也需要在C57BL/6等近交系小鼠上做回交。
另一方面,因为回交次数不一样,也会造成实验结果重复性差。
这对生物科研,尤其是医药企业,安评中心,药检部门等,是一个很大的缺点。
这对开发制作标准模式动物也是一个很大的缺陷。
所以,如果能够直接用C57BL/6 ES细胞进行基因打靶,就将直接获得C57BL/6品系的模式小鼠。
c57BL/6小鼠种系等已经广泛的应用于免疫学,神经学,癌症,等几乎所有研究领域。
已经有一些公司或科研机构已经开始用C57BL/6遗传背景的胚胎干细胞进行基因打靶。
载体构建把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因,TK基因等)的载体上,此重组载体即为打靶载体。
因基因打靶的目的不同,此载体有不同的设计方法,可分为替换性载体和插入型载体。
敲除小鼠常见问题与回答
敲除小鼠常见问题与回答一、什么是ES细胞显微注射?答:胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。
主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。
所得嵌合体小鼠的组织,将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。
嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递,这样可能获得转基因或打靶基因(来源于胚胎干细胞)稳定的生殖系传递的小鼠。
一般情况下,大约能获得50%继承了目的基因的后代。
二、嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。
免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。
在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞,使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞,产生的个体也叫嵌合体,即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞(一种是基因型被改变了的细胞,另一种是原来的基因型的细胞)。
三、条件性敲除的原理?答:Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列,这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。
Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞,通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除,又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交,筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。
四、如何鉴定和挑选嵌合体?答:动物只有部分组织细胞整合有外源基因,则称为嵌合体动物。
它的鉴定主要根据毛色去鉴定。
注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。
基因敲除和敲入技术的发展和应用
基因敲除和敲入技术的发展和应用随着科技的不断进步,人类对于基因的探究也日渐深入。
基因敲除和敲入技术作为其中的重要探究手段,则受到越来越多的关注和应用。
本文将从技术原理、研究进展、应用前景等方面阐述基因敲除和敲入技术。
一、技术原理基因敲除和敲入技术是利用DNA重组技术将人造的基因片段有选择地插入到细胞或某个生物体的特定位置,从而改变这个生物体的某种性状或者产生新的性状。
所谓基因敲除,就是将某个基因的序列刻意人为删除;而基因敲入,则是将人造基因片段有选择地插入到细胞或生物体中。
这两种技术都属于基因工程领域内的基础技术,也为其他生命科学领域提供了良好的研究工具。
二、研究进展基因敲除和敲入技术的研究始于20世纪80年代,最早是借助于整合子(Transposon)等修饰体来达到基因敲入的目的。
然而其限制因素太多,因此研究人员开始寻找其他方法。
1996年,Nobuyoshi Shimizu和John Witthuhn在细菌中利用锂盐法将基因敲除策略应用到实践中,为基因敲除技术的研发打下了基础。
此后的20多年里,随着不断的技术进步和生物技术产业的蓬勃发展,基因敲除和敲入技术也得到了飞速发展。
最近几年,基因敲除和敲入技术的进步尤其引人注目。
CRISPR-Cas9技术以其高效易用和精确性受到广泛关注,成为现在最主流的基因敲除和敲入技术之一。
除此之外,ZFN(zinc finger nuclease)和TALEN(TAL effector nuclease)等技术也在持续发展中,不断完善。
随着技术的不断创新和完善,基因敲除和敲入技术的应用范围也越来越广泛。
三、应用前景基因敲除和敲入技术得到广泛应用的趋势也日益明显,涵盖了从基础科学到临床医学的多个应用领域。
在基础科学领域,基因敲除和敲入技术可以被广泛应用于基础遗传学、生理学、细胞生物学、分子生物学等各个领域的研究。
以生物缺陷基因的研究为例,利用这两种技术可以实现对缺陷基因的破坏或修复,有助于进一步认识缺陷基因对生命活动的影响机制等。
条件性基因敲除与敲入
2.Cre/loxP系统优点
Cre/loxP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用, 是由该系统的诸多优点决定的:
①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后, 可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程,因此该系 统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子;
②loxP位点是一段较短的DNA序列,因此非常容易合成; ③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质,因此可以在生物
受精卵雄性原核显微注射法构建Cre 转基因动物
Cre转基因动物即时空特异性表达重组酶Cre的转基 因动物。构建此动物的目的在于为loxP转基因动物 提供重组酶Cre。由于在该转基因动物中Cre的表达 被置于特异性启动子的调控之下,因此它会以组织 细胞特异性和发育阶段特异性的方式向loxP转基因 动物提供Cre重组酶,以便在特定的发育阶段、特定 的组织细胞中使两个loxP之间的区域缺失。当然, 实现此目标的最后方法就是让这两种转基因动物进 行杂交。
迄今为止,研究者们已经成功地利用多个不同
的启动子实现了在不同条件下的基因敲除,这
些启动子可以是细胞类型特异的,如lck启动子 (胸腺细胞)、alphaA晶状体球蛋白启动子(眼晶 状体)、钙调素依赖性激酶Ⅱ启动子(海马和大 脑新皮质)、乳清酸性蛋白启动子(乳腺)、aP2 启动子(脂肪组织)、AQP2启动子(肾脏集合管) 和肌浆蛋白启动子(骨骼肌)等。启动子也可以 受某些外源性化学物质的调控,外源性调控的
实现基因敲除的方法有多种,但基本上都是采用同 源重组或随机整合的方法,让一段没有生理功能的 DNA片段在细胞内取代正常基因,从而破坏正常基 因的功能。基因敲除主要是在胚胎干细胞 (embryonic stem cells,ESC)水平进行操作。胚胎干 细胞是早期胚胎细胞经体外培养建立的全能细胞系, 在体外培养时保持了未分化状态,可以传代增殖, 在发育上类似于早期胚胎细胞团的细胞,具有与早 期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大 特点,是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性 状遗传机制的理想模型。首先在这种细胞内进行分 子水平的基因操作,之后再使这种已经发生了基因 改变的细胞发育成为一个完整的生物体。这样就可 以在整个生物体内实现预期的基因改变。
生物节律基因检测方法
生物节律基因检测方法生物节律是生物体内部生理和行为上的周期性变化,这些变化由基因控制,并与地球的昼夜节律密切相关。
随着科学技术的发展,生物节律基因检测方法已逐渐成为研究的热点。
本文将为您详细介绍生物节律基因检测的相关方法。
一、概述生物节律基因检测旨在揭示生物体内部节律性变化的遗传机制,为生物节律调控、疾病预防与治疗提供科学依据。
目前,研究人员已开发出多种生物节律基因检测方法,主要包括以下几种:1.基因敲除与基因敲入技术2.基因表达谱分析3.基因突变检测4.蛋白质组学分析5.生物信息学方法二、具体检测方法1.基因敲除与基因敲入技术基因敲除技术通过破坏目标基因,观察生物体节律性变化,从而揭示基因在生物节律调控中的作用。
基因敲入技术则是在生物体内引入外源基因,研究其功能。
这两种技术均可用于生物节律基因的研究。
2.基因表达谱分析基因表达谱分析是通过检测生物体在不同时间点的基因表达水平,分析基因表达与生物节律的关系。
这种方法的优点是能同时研究多个基因的表达变化,有助于揭示生物节律调控网络的复杂性。
3.基因突变检测基因突变检测是针对已知生物节律基因的突变进行检测,分析突变对生物节律的影响。
这种方法有助于发现新的生物节律基因及突变类型。
4.蛋白质组学分析蛋白质组学分析是通过研究生物体在不同时间点的蛋白质表达变化,揭示生物节律调控的分子机制。
这种方法的优点是能直接反映蛋白质水平的变化,有助于发现新的生物节律调控因子。
5.生物信息学方法生物信息学方法是通过构建生物节律基因调控网络,预测生物节律基因的功能和相互作用。
这种方法可以在大规模基因组数据中挖掘生物节律基因,为实验研究提供线索。
三、总结生物节律基因检测方法的研究为揭示生物节律的遗传机制提供了有力手段。
随着科学技术的不断发展,更多高效、准确的检测方法将被开发出来,为生物节律调控及相关疾病的研究提供有力支持。
条件性基因敲除(conditional
条件性基因敲除(conditional knock out)与CreloxP、FlpFRT重组系统要做这⽅⾯的实验,查了些条件性基因敲除与Cre/loxP、Flp/FRT重组系统的资料,⼤概总结⼀下。
经典基因敲除有时因某些基因对胚胎发育的影响⽽⽆法正常分娩,或实验动物因出⽣后严重的⽣理缺陷⽽过早死亡,或不能产⽣后代⽽不能获得纯合⼦动物模型。
这些,可以通过条件性基因敲出或敲⼊(conditional gene knock out or knock in)⽽避免,即在特定的组织细胞或细胞发育的特定阶段敲除或引⼊某⼀特定基因,对研究特定基因在特定组织内(及特定的时间)的功能有着重要意义。
⽬前常⽤Cre/loxP、Flp/FRT重组系统。
利⽤Cre/LoxP 和来⾃酵母的Flp—FRT系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型。
通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP,并以此两侧装接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 细胞产⽣“loxPfloxed”⼩⿏,然后,通过将“loxP floxed”⼩⿏与Cre转基因⿏杂交(也可以其他⽅式向⼩⿏中引⼊Cre 重组酶),产⽣靶基因发⽣特定⽅式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变⼩⿏。
在“loxP floxed”⼩⿏,虽然靶基因的两侧已各装上了⼀个loxP,但靶基因并没有发⽣其他的变化,故“1oxP floxed”⼩⿏表型仍同野⽣型的⼀样。
但当它与Cre 转基因⼩⿏杂交时,产⽣的⼦代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。
Cre 基因表达产⽣的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发⽣切除反应,结果将⼀个loxP 和靶基因切除。
这样,靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表达为前提的。
Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性:即Cre 在哪⼀种组织细胞中表达,靶基因的修饰(切除)就发⽣在哪种组织细胞;⽽Cre 的表达⽔平将影响靶基因在此种组织细胞中进⾏修饰的效率。
基因敲除小鼠的制作方法
一、常规基因敲除鼠(Conventional Knockout)常规基因敲除是通过基因打靶,把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。
这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。
此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响,而且这个基因没有胚胎致死性。
二、条件性基因敲除小鼠(Conditional Knockout)条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶,把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。
该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前,其目的基因表达完全正常。
当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后,可以在特定的组织或细胞中敲除该基因,而该基因在其他组织或细胞表达正常。
条件性基因敲除鼠适用范围为:(1)该基因有胚胎致死性;(2)用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。
三、基因敲入小鼠(Knockin)基因敲入小鼠是通过基因打靶,把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点,使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。
此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选,信号通路的研究等。
获得嵌合体及之后品系纯化详细流程:基因敲除其他方法:一、ZFN技术制作基因敲除鼠ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点,并高效精确地切断。
随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改,这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。
这在过去是无法想象的,传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组,其效率只有百万分之一,而ZFN的基因敲除效率能达到10%。
利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入,可以把时间从一年缩短到几个月。
这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节,目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN,但ZFN的脱靶(off target),也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。
也正因为这个原因,利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
loxP转基因动物的构建
loxP转基因动物是在基因组中待修饰基因区域的两侧各插入了1个loxP 位点的转基因动物。该转基因动物的构建首先需要一种特殊的载体, 这种载体主要由3个部分组成: ①分别存在于打靶载体5 ’和3’臂端,是与靶基因一定区域相同的同源序 列,其作用是介导打靶载体与靶基因之间的同源重组。 ②位于5’和3’臂端之间有待敲除的靶基因区段序列或有待敲入的外源序 列和选择标志基因。选择标志基因一般为neo—tk基因,含有两个选择 标志:一个为G418抗性基因(neo),为细胞提供针对G418的抗性,为 正筛选标记;另一个为胸腺嘧啶激酶基因(tk),可以把培养基中的更昔 洛韦(ganciclovir)磷酸化为对细胞有毒的化合物,为细胞提供负筛选标 记。 ③3个loxP位点,分别位于待敲除靶基因同源序列的两侧和选择标志基 因的两侧。 一般采用线性化的打靶载体来转染胚胎干细胞,常选用位于同源序列 边缘或之外的限制性内切酶作用位点作为打靶载体线性化的切点。取 代型打靶载体整合进基因组的结果是靶载体中的序列臵换掉基因组中 的同源序列。
经典的基因敲除的具体实施方法可以简述如下: 选择需要研究的目的基因的部分或全部DNA片 段,通过分子生物学方法使其产生突变,然后 与相应的载体进行重组,成为靶载体。分离试 验动物的胚胎干细胞,在体外将上述靶载体导 入到胚胎干细胞内,使其与细胞内相似或相同 的序列进行同源重组,替代细胞内原来的基因。 通过一定的筛选方法筛选出发生同源重组的细 胞,再将其注入囊胚腔内;把经过上述处理的 囊胚重新植入到假孕小鼠的子宫内,使其发育 成为一个完整的个体。含有相应突变基因的嵌 合体雄性小鼠与正常雌性小鼠进行交配后,通 过筛选可获得携带该突变基因的纯合子小鼠。
通过上述方法所获得的基因敲除小鼠模型,其身体的各种 组织、器官以及小鼠生存的各个时期都携带有突变基因, 相应基因的功能也发生了变化。这是一种非常经典的基因 敲除方法,该方法对阐明某些基因的功能做出了十分重要 的贡献。但是,对于某些特殊的基因,该方法往往显得无 能为力,这些基因在胚胎发育过程中或者在成熟生物体内 具有至关重要的功能。当这些基因突变后,胚胎往往不能 发育至正常分娩,或者即使能够出生也会因为过于严重的 生理缺陷而过早夭亡,无法开展后续研究,或者这些基因 突变后影响到实验动物的繁殖功能而不能产生后代,进而 不能获得携带突变基因的纯合子动物模型。针对上述问题, 近年来出现了一种特殊的基因敲除或敲入方法,被称为条 件性基因敲除或敲入(conditional gene knock out or knock in)。这种方法是指在特定的组织细胞或者细胞发育的特 定阶段敲除某一特定基因的实验技术。其优势在于克服了 经典基因敲除手段所遇到的上述问题,对于在特定的组织 细胞和(或)特定的时间研究特定基因的功能,以及更好地 建立人类疾病的动物模型都具有十分重要的意义。
2.Cre/loxP系统优点
Cre/loxP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用, 是由该系统的诸多优点决定的: ①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后, 可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程,因此该系 统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子; ②loxP位点是一段较短的DNA序列,因此非常容易合成; ③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质,因此可以在生物 体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用; ④Cre重组酶的编码基因可以臵于任何一种启动子的调控 之下,从而使这种重组进而 发挥作用,这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一 点。
第二只转基因小鼠一般采用卵母细胞注射或者胚胎 干细胞技术获得,在这只小鼠中,Cre重组酶被臵于 某特定基因启动子的调控之下,可以使其在某特定 的条件下表达。 最后,让这两只小鼠进行交配,产生的同时含有上 述两种基因型的子代小鼠就会在某一特定类型的细 胞中缺失某一特定的基因。 很明显,在何种组织细胞或器官中敲除某一特定的 基因取决于所选择的启动子。只要选择合适的启动 子调控Cre重组酶的表达,使其在生物体特定的部位、 特定的条件下产生,就可以实现相应条件下某一特 定基因的敲除。
loxP转基因动物的构建一般采用胚胎干细胞基因转 移法。在这个过程中,首先要构建具有3个loxP位点 的打靶载体。该载体中loxP位点的分布情况如下: 选择标志基因(如neo—tk)的两侧各一个,从而能够 使选择标志基因在Cre的介导下消失,以避免它们在 基因组中的存在可能给转基因动物造成危害;预期 要进行敲除的基因两侧各一个,在Cre的作用下可以 介导目标基因的敲除。在载体构建成功后,用电穿 孔等方法将其导入到胚胎干细胞中,使其以同源重 组的方式整合进干细胞的基因组,之后经G418筛选, 用PCR和DNA印迹(Southern blotting)等方法来确定 靶基因是否发生了同源重组。最后,为了去除筛选 标志基因,要向上述的胚胎干细胞中导人Cre的瞬时 表达质粒。这时,在Cre的作用下,具有3个loxP位 点的靶基因区域会产生3种后果:
受精卵雄性原核显微注射法构建Cre 转基因动物
Cre转基因动物即时空特异性表达重组酶Cre的转基 因动物。构建此动物的目的在于为loxP转基因动物 提供重组酶Cre。由于在该转基因动物中Cre的表达 被臵于特异性启动子的调控之下,因此它会以组织 细胞特异性和发育阶段特异性的方式向loxP转基因 动物提供Cre重组酶,以便在特定的发育阶段、特定 的组织细胞中使两个loxP之间的区域缺失。当然, 实现此目标的最后方法就是让这两种转基因动物进 行杂交。 构建Cre转基因动物与构建普通转基因动物的方法相 似,最为常用的基因转移方法仍为受精卵雄性原核 显微注射法和胚胎干细胞的囊胚注射法。
3.Cre/loxP系统的工作流程
利用Cre/loxP系统实现体内某特定基因在特定条件 下的敲除,需要两只转基因小鼠。 第一只小鼠一般采用胚胎干细胞技术获得,首先在 体外构建一个在目的基因两端分别含有一个loxP位 点的基因序列,之后将体外构建好的这段基因序列 转入胚胎干细胞内,使其通过同源重组替代细胞基 因组内原来的基因序列。经过这样处理的胚胎干细 胞被重新植入到假孕小鼠的子宫内,使其重新发育 成为一个完整的胚胎,最终成为一只转基因小鼠。 在这只转基因小鼠中,loxP位点被引入到相应基因 的内含子内,理论上不会对相应基因的功能产生影 响,因此一般情况下,该小鼠的表型是正常的。
loxP(locus of X-over P1)序列:来源于P1噬菌 体,是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的 8bp序列共同组成,8bp的间隔序列同时也确定 了loxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与 DNA共价结合,13bp的反向重复序列是Cre酶的 结合域。其序列如下:
Cre重组酶介导两个loxP位点间的重组是一个动 态、可逆的过程,可以分成三种情况: 1、如果两个loxP位点位于一条DNA链上,且方 向相同,Cre重组酶能有效切除两个loxP位点间 的序列; 2、如果两个loxP位点位于一条DNA链上,但方 向相反,Cre重组酶能导致两个loxP位点间的序 列倒位; 3、如果两个loxP位点分别位于两条不同的DNA 链或染色体上,Cre酶能介导两条DNA链的交换 或染色体易位。
迄今为止,研究者们已经成功地利用多个不同 的启动子实现了在不同条件下的基因敲除,这 些启动子可以是细胞类型特异的,如lck启动子 (胸腺细胞)、alphaA晶状体球蛋白启动子(眼晶 状体)、钙调素依赖性激酶Ⅱ启动子(海马和大 脑新皮质)、乳清酸性蛋白启动子(乳腺)、aP2 启动子(脂肪组织)、AQP2启动子(肾脏集合管) 和肌浆蛋白启动子(骨骼肌)等。启动子也可以 受某些外源性化学物质的调控,外源性调控的 基因敲除可以避免在胚胎发育早期由于基因功 能的异常所产生的副作用,如干扰素反应Mxl 启动子、他莫西酚依赖的雌激素突变体启动子 和四环素调节系统等。
①发生Ⅰ型缺失,3个loxP之间的所有基因(靶基因 和选择标志基因)全部被切除,只保留1个loxP位点。 ②发生Ⅱ型缺失,只有选择标志基因被切除,两个 loxP位点及其之间的靶基因被保留。发生了Ⅰ或Ⅱ 型缺失的胚胎干细胞在更昔洛韦选择培养下均能生 长,再用PCR和DNA印迹等方法来对缺失突变的结 果进行鉴定。 ③Ⅲ型缺失,靶基因被切除而选择标志基因被保留, 发生此型突变的细胞在更昔洛韦存在时无法生存。 经过更昔洛韦培养基筛选后,可以筛选出发生Ⅱ型 缺失的胚胎干细胞。再用囊胚注射法将经过这种遗 传改造的胚胎干细胞注入囊胚,最后移植入代孕母 鼠的子宫内,获得具有Ⅱ型缺失突变的转基因动物, 在其基因组中特定的基因位臵具有两个loxP位点。
先将Cre时空特异表达载体线性化后注入雄性原核,使其以随机插入的 方式整合进基因组,然后将该受精卵或早期胚胎植人到假孕母鼠的输 卵管或子宫内。受精卵雄性原核显微注射法的具体步骤简述如下: 1.准备假孕母鼠 将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配,刺激 雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母。 2.受精卵的准备 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素(HCG), 以促使其超排卵。处理后与可育雄鼠交配,次日从输卵管内收集受精 卵备用。 3.基因导入 用显微注射装臵将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内。 4.胚胎移植 将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管内, 使胚胎在养母体内发育成熟。 5.对幼鼠的鉴定 (1)幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA,与目的基因探针作分子杂交,鉴 定外源基因是否整合。 (2)建立鼠系,将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代 后,后代有50%概率带有整合的基因供实验用。也可将合适的组织进 行细胞培养,建立细胞系。 (3)自小鼠内脏提取RNA,与目的基因探针做分子杂交,以鉴定外源基 因的表达和表达的组织特异性。表达产物可以测定活性的,也可直接 自血液或组织测定活性蛋白质,常用的方法如酶联免疫吸附试验 (ELISA)或放射免疫测定(RIA)等。亦可取胚胎进行分析。