第二章 生物工程下游技术的理论基础
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弱，氢键也受到同样影响。
• 试剂：尿素、盐酸胍、十二烷基磺酸钠等会对蛋白质构象造成
影响。
生物学过程在下游技术中的应用
来自百度文库
亲和色谱
亲和色谱是利用了生物物质间的持异性相互作用， 或者说是利用了某些生物物质之间特异的亲和力进行 选择性分离的一种色谱分离技术。其基本组成如下：
目标物
生物学过程在下游技术中的应用
生物学过程的机理
特异性相互作用的含义
生物学分离过程的主要特征是生物高分子的特异性相互作用。主要 以蛋白质为代表的生物高分子（另外含有肝素、明胶、核苷酸等）（亲 和介质），能分辨特定的物质（目标物），再与其可逆性结合。这种现 象是非常排他性的、特异性的结合，故称为特异性相互作用（或生物亲 和力）。注意：亲和介质和目标物是相对的。
•
•
生物学过程在下游技术中的应用
亲和色谱的操作过程
生物学过程在下游技术中的应用
亲和色谱的操作过程
吸附操作
• 保证介质对目标物有较高的吸附作用和吸附容量 • 杂质的非特异吸附要控制在最低水平 • 影响因素有：目标物和杂质的浓度、缓冲液离子强度和pH值等；
提高介质本身的质量；在料液中加入表面活性剂（尤其适用于目 标物为疏水性强的蛋白质）
• 料液流速是影响层析柱效和分离速度的重要因素 • 料液流速与操作压力成正比，需根据吸附柱的不同载
体来选择
生物学过程在下游技术中的应用
亲和色谱的操作过程
洗涤操作
• 目的是洗去吸附介质内部及柱空隙中存在的杂质，一
般使用与吸附操作相同的缓冲液，必要时可加入表面 活性剂，保证目标物的吸附和杂质的除去。
(Cu2+/Ni2+/Zn2+) 配位，二者可间接结合） [例] 固定化亲和离子层析： 接合部位—亚胺二乙酸（IDA）/三羧甲基乙二胺（TED） 目标物中含有组氨酸（His）(咪唑基)/半胱氨酸（Cys）(巯基)/色氨酸 （Trp）(吲哚基) 弱共价键结合（醛基和羟基间形成半缩醛形式的弱共价键的结合） 可逆性（主要受PH影响）
第二章 下游技术的理论基础
主要内容
• 下游技术的物理学过程 • 下游技术的化学过程
• 下游技术的生物学过程
下游技术的物理学过程
• 平衡分离过程 • 拟平衡分离操作
• 非平衡分离操作
平衡分离过程
根据被分离混合物的物性参数（蒸气压、溶解 度、表面张力、离子强度等）使不同物质在一定条 件下达到其固有的相平衡，从而达到分离不同物质 的目的。其理论基础为平衡论（详 见“物理化 学”）。
亲和色谱
载体（担体）的选择
• • • •
具有亲水性 便于载体固定化 非特异吸附很少 有一定的机械强度
Sephadex—葡聚糖通过-1,6结合与交联制备的葡聚糖凝胶 Sepharose—含有半乳糖的琼脂糖凝胶 (Pharmacia 公司) TSK gel—硅胶基质（Tayo 公司）
• 常用的载体：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、硅胶等。
生物学过程的机理
特异性相互作用的类型 • 离子间的相互作用（亲和介质和目标物均为蛋白/多肽） • 氢键结合（目标物含有O/N原子）
与配体的立体结构有关
天冬氨酸/谷氨酸（-）；精氨酸/赖氨酸（+）
• 疏水性相互作用（目标物和结合部位均含有烃链/芳香环类疏水基团） • 金属原子配位结合 （结合部位和目标物均可以与同一金属离子
下游技术的化学过程
• 化学性分子识别 • 化学反应
化学性分子识别
某些化学物质对被分离混合物中的目标物质具有 特异性结合的能力，当该化学物质被加入到被分离混 合物中时，便于目标物质进行特异性结合，从而达到 分离目的。这些具有化学性分子识别能力的物质暂称 为“识别分子” 其作用机理在于目标物与识别分子之间存在一定 的相互作用力（如范德华力、氢键、疏水作用力、静 电引力及化学结合力等）。
为Y字型IgG分子的主干部分（Fc片段），可纯化各种抗体 凝集素：是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称 （AMP, ADP,`ATP）与辅酶的结构类似 三嗪类色素：三嗪类色素与各种需要在NAD(辅酶II)的存在下表现其生物活性 的脱氢酶和激酶具有结合能力，另外还可纯化血清白蛋白、干扰素、核糖酶和糖 解酶等。 过渡金属离子：可与N, S和O等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表面的 组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基发生亲和结合作用 组氨酸：具有弱疏水性、其咪唑环为弱点性，可与蛋白质发生亲和结合作用 （受PH和盐浓度影响），用来分离等电点相差较大的蛋白 肝素：可纯化脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性内切酶、抗凝血酶、凝血蛋 白等
•
生物学过程的机理
特异性相互作用的影响因素 影响蛋白质立体构象的环境因素会制约上述的特异性 相互作用 热：热是影响蛋白质构象的最普通的因素 温度：温度的上升，使原子、分子的热运动更活泼，因而离子
间的相互作用、氢键、金属原子配位作用等变弱。相反．疏水性 的相互作用因温度上升而加强。
• •
• PH： pH也对蛋白质侧链上的氨基酸残基的离解度影响很大。 • 静电性的环境变化：溶液离子强度增加，离子间相互作用变
识 别 分 子
下游技术中的化学反应
• 柠檬酸 + CaCO3 柠檬酸钙
• 草酸 + Ca2+ 草酸钙 • 谷氨酸+ ZnSO4 谷氨酸锌
（存在环境污染问题，工业上被禁用）
下游技术中的生物学过程
• 生物学过程的机理
—— 特异性相互作用
• 生物学过程在下游技术中的应用
—— 亲和色谱
拟平衡分离操作
被分离的混合物在其物性（密度、电荷等）上存在 一定的差异，但并不能将它们完全分开，必须借助外力 场（离心力场、电场、磁场等），方可将它们完全分开。
非平衡分离操作
以被分离混合物在被分离界面两侧的物性参数之差 （温度差、压力差、浓度差等）为推动力，使物质从非平 衡状态向平衡状态转化，从而达到分离的目的。其理论基 础为“三传原理”。
生物学过程在下游技术中的应用
亲和色谱
配体和目标物 • 酶的抑制剂：可与被抑制的酶特异性结合 • 抗体：免疫亲和层析，抗体和抗原之间具有高度特异性结合能力 • A蛋白：A抗原，与动物免疫球蛋白G(IgG)具有很强的亲和结合作用，结合部位 • • 辅酶和磷酸腺苷：脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用，磷酸腺苷 • •
• 试剂：尿素、盐酸胍、十二烷基磺酸钠等会对蛋白质构象造成
影响。
生物学过程在下游技术中的应用
来自百度文库
亲和色谱
亲和色谱是利用了生物物质间的持异性相互作用， 或者说是利用了某些生物物质之间特异的亲和力进行 选择性分离的一种色谱分离技术。其基本组成如下：
目标物
生物学过程在下游技术中的应用
生物学过程的机理
特异性相互作用的含义
生物学分离过程的主要特征是生物高分子的特异性相互作用。主要 以蛋白质为代表的生物高分子（另外含有肝素、明胶、核苷酸等）（亲 和介质），能分辨特定的物质（目标物），再与其可逆性结合。这种现 象是非常排他性的、特异性的结合，故称为特异性相互作用（或生物亲 和力）。注意：亲和介质和目标物是相对的。
•
•
生物学过程在下游技术中的应用
亲和色谱的操作过程
生物学过程在下游技术中的应用
亲和色谱的操作过程
吸附操作
• 保证介质对目标物有较高的吸附作用和吸附容量 • 杂质的非特异吸附要控制在最低水平 • 影响因素有：目标物和杂质的浓度、缓冲液离子强度和pH值等；
提高介质本身的质量；在料液中加入表面活性剂（尤其适用于目 标物为疏水性强的蛋白质）
• 料液流速是影响层析柱效和分离速度的重要因素 • 料液流速与操作压力成正比，需根据吸附柱的不同载
体来选择
生物学过程在下游技术中的应用
亲和色谱的操作过程
洗涤操作
• 目的是洗去吸附介质内部及柱空隙中存在的杂质，一
般使用与吸附操作相同的缓冲液，必要时可加入表面 活性剂，保证目标物的吸附和杂质的除去。
(Cu2+/Ni2+/Zn2+) 配位，二者可间接结合） [例] 固定化亲和离子层析： 接合部位—亚胺二乙酸（IDA）/三羧甲基乙二胺（TED） 目标物中含有组氨酸（His）(咪唑基)/半胱氨酸（Cys）(巯基)/色氨酸 （Trp）(吲哚基) 弱共价键结合（醛基和羟基间形成半缩醛形式的弱共价键的结合） 可逆性（主要受PH影响）
第二章 下游技术的理论基础
主要内容
• 下游技术的物理学过程 • 下游技术的化学过程
• 下游技术的生物学过程
下游技术的物理学过程
• 平衡分离过程 • 拟平衡分离操作
• 非平衡分离操作
平衡分离过程
根据被分离混合物的物性参数（蒸气压、溶解 度、表面张力、离子强度等）使不同物质在一定条 件下达到其固有的相平衡，从而达到分离不同物质 的目的。其理论基础为平衡论（详 见“物理化 学”）。
亲和色谱
载体（担体）的选择
• • • •
具有亲水性 便于载体固定化 非特异吸附很少 有一定的机械强度
Sephadex—葡聚糖通过-1,6结合与交联制备的葡聚糖凝胶 Sepharose—含有半乳糖的琼脂糖凝胶 (Pharmacia 公司) TSK gel—硅胶基质（Tayo 公司）
• 常用的载体：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、硅胶等。
生物学过程的机理
特异性相互作用的类型 • 离子间的相互作用（亲和介质和目标物均为蛋白/多肽） • 氢键结合（目标物含有O/N原子）
与配体的立体结构有关
天冬氨酸/谷氨酸（-）；精氨酸/赖氨酸（+）
• 疏水性相互作用（目标物和结合部位均含有烃链/芳香环类疏水基团） • 金属原子配位结合 （结合部位和目标物均可以与同一金属离子
下游技术的化学过程
• 化学性分子识别 • 化学反应
化学性分子识别
某些化学物质对被分离混合物中的目标物质具有 特异性结合的能力，当该化学物质被加入到被分离混 合物中时，便于目标物质进行特异性结合，从而达到 分离目的。这些具有化学性分子识别能力的物质暂称 为“识别分子” 其作用机理在于目标物与识别分子之间存在一定 的相互作用力（如范德华力、氢键、疏水作用力、静 电引力及化学结合力等）。
为Y字型IgG分子的主干部分（Fc片段），可纯化各种抗体 凝集素：是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称 （AMP, ADP,`ATP）与辅酶的结构类似 三嗪类色素：三嗪类色素与各种需要在NAD(辅酶II)的存在下表现其生物活性 的脱氢酶和激酶具有结合能力，另外还可纯化血清白蛋白、干扰素、核糖酶和糖 解酶等。 过渡金属离子：可与N, S和O等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表面的 组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基发生亲和结合作用 组氨酸：具有弱疏水性、其咪唑环为弱点性，可与蛋白质发生亲和结合作用 （受PH和盐浓度影响），用来分离等电点相差较大的蛋白 肝素：可纯化脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性内切酶、抗凝血酶、凝血蛋 白等
•
生物学过程的机理
特异性相互作用的影响因素 影响蛋白质立体构象的环境因素会制约上述的特异性 相互作用 热：热是影响蛋白质构象的最普通的因素 温度：温度的上升，使原子、分子的热运动更活泼，因而离子
间的相互作用、氢键、金属原子配位作用等变弱。相反．疏水性 的相互作用因温度上升而加强。
• •
• PH： pH也对蛋白质侧链上的氨基酸残基的离解度影响很大。 • 静电性的环境变化：溶液离子强度增加，离子间相互作用变
识 别 分 子
下游技术中的化学反应
• 柠檬酸 + CaCO3 柠檬酸钙
• 草酸 + Ca2+ 草酸钙 • 谷氨酸+ ZnSO4 谷氨酸锌
（存在环境污染问题，工业上被禁用）
下游技术中的生物学过程
• 生物学过程的机理
—— 特异性相互作用
• 生物学过程在下游技术中的应用
—— 亲和色谱
拟平衡分离操作
被分离的混合物在其物性（密度、电荷等）上存在 一定的差异，但并不能将它们完全分开，必须借助外力 场（离心力场、电场、磁场等），方可将它们完全分开。
非平衡分离操作
以被分离混合物在被分离界面两侧的物性参数之差 （温度差、压力差、浓度差等）为推动力，使物质从非平 衡状态向平衡状态转化，从而达到分离的目的。其理论基 础为“三传原理”。
生物学过程在下游技术中的应用
亲和色谱
配体和目标物 • 酶的抑制剂：可与被抑制的酶特异性结合 • 抗体：免疫亲和层析，抗体和抗原之间具有高度特异性结合能力 • A蛋白：A抗原，与动物免疫球蛋白G(IgG)具有很强的亲和结合作用，结合部位 • • 辅酶和磷酸腺苷：脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用，磷酸腺苷 • •