液相色谱固定相与流动相
高效液相色谱仪的原理及应用
高效液相色谱仪的原理及应用
高效液相色谱仪（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分析仪器，根据物质在固定相和流动相
间的相互作用差异来实现物质分离和测定的方法。
高效液相色谱的主要原理如下：
1. 样品进样：样品通过进样器注入到流动相中。
2. 流动相泵：流动相泵将流动相以一定的压力送入进样阀。
3. 进样阀：进样阀控制样品的进入量，并通过连接固定相柱。
4. 固定相柱：固定相在柱中，对流动相和待分离的样品进行分离。
5. 检测器：根据样品的特性和分离程度选择合适的检测器进行检测。
6. 数据处理器：将检测的信号转化为柱温度、流量和检测器信号等数据。
高效液相色谱仪的主要应用包括：
1. 分析化学：用于定性和定量分析化学样品中的成分。
2. 生物化学：用于分析蛋白质、核酸、多肽等生物大分子。
3. 药学：用于分析药物中的活性成分、控制药品的质量。
4. 环境分析：用于监测环境中的有机污染物和无机物质。
5. 食品分析：用于检测食品中的添加剂、残留农药和毒性物质。
高效液相色谱仪的优点包括分离效率高、分析速度快、样品容量小、样品制备简单等。
然而，高效液相色谱仪的操作要求严格，仪器费用较高，且需要使用高纯度的溶剂和试剂。
液相色谱流动相选择的一般原则
液相色谱流动相选择的一般原则
液相色谱流动相选择的一般原则如下：
1.选择合适的溶剂：流动相应该是能够溶解待分离物质的溶剂，并且与固定相不发生相互作用。
2.调整流动相的极性：根据待分离物质的极性选择适当的流动相极性，以实现良好的分离效果。
3.控制流动相的 pH 值：如果待分离物质在特定的 pH 值下有更好的分离效果，那么应该选择相应的流动相。
4.控制流动相的流速：流速会影响分离效果和分离时间，需要根据具体情况进行调整。
5.避免使用对柱子有害的溶剂：某些溶剂可能会损坏柱子，应该避免使用。
6.考虑成本和环保：选择流动相时应该考虑成本和环保因素，尽可能选择低成本、无毒、可回收的溶剂。
以上是液相色谱流动相选择的一般原则，具体的选择还需要根据实际情况进行调整。
1。
固定相与流动相
3. 流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使 保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮>二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫 化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)
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4. 选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱 子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并 在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测 器时，流动相不应有紫外吸收。
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4. 空间排阻分离固定相
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响 小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。
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５. 手性固定相
生物、药物分子和天然有机 产物的分离。 环糊精（CD） 结构：
液相色谱分离过程
液相色谱分离过程
液相色谱（LiquidChromatography，简称LC）是一种基于化学
分子间相互作用和物理化学性质差异的分离方法。
液相色谱的分离原理是在固定相和液相的作用下，溶液中的物质在固定相表面上被吸附、分离、吸附和洗脱。
液相色谱的分离过程可以分为样品进样、流动相进样、固定相吸附、洗脱和检测几个步骤。
首先，待分离物质被进样器吸入，随后被送入流动相中。
流动相通过固定相时，待分离物质会在固定相表面进行吸附，然后通过不同的洗脱条件，把吸附在固定相上的不同成分分离开来。
最后，各组分被检测器检测出来。
液相色谱的分离过程主要受到以下因素的影响：
1. 流动相的选择：流动相的性质直接影响着样品的分离情况。
因此，在选择流动相的时候，需要考虑样品的特性和分离条件。
2. 固定相的选择：固定相的特性决定了分离过程中样品在固定
相表面的吸附情况。
不同的固定相会对不同的样品产生不同的分离效果。
3. 洗脱条件的选择：洗脱条件的选择会直接影响各组分的分离
效果。
总的来说，液相色谱的分离过程是一个复杂的过程，需要综合考虑多种因素。
在实际应用中，可以通过调节流动相、固定相和洗脱条件等参数，来实现对待分离物质的高效分离。
- 1 -。
液相色谱的固定相与流动相
不同流动相的特点
有机溶剂
常用的流动相之一，适用于分 离非极性化合物。
水
常用于分离极性化合物，具有 良好的溶解性。
缓冲溶液
用于调节样品的酸碱度，对某 些化合物有选择性。
如何选择合适的固定相和流动相
1 样品特性
根据样品的性质选择合适 的固定相。
2 分离需求
根据对目标化合物的选择 性需求，选择合适的流动 相。
液相色谱的固定相与流动 相
液相色谱是一种重要的分析技术，其中固定相扮演着关键的角色。
固定相介绍
液相色谱中的固定相是一种材料，通常填充在色谱柱中。 固定相可以根据其化学性质和粒径大小进行选择。
流动相介绍
流动相是在液相色谱过程中对样品进行携带的溶剂。 流动相的选择会影响分离的选择性和分辨率。
液相色谱的工作原理
液相色谱通过固定相和流动相之间的相互作用将样品分离。 不同组分在固定相上的相互作用力不同，导致不同程度的保留和分离。
不同固定相的特点
反相色谱柱
常用于分离非极性化合物，具有较强的保留和分离能力。
离子交换色谱柱
适用于分离带电离子化合物，具有良好的选择性。
大小排除色谱柱
可分离不同分子大小的化合物，常用于生物分析。
3 分析目的
根据分析的目的和需要， 综合考虑选择合适的固定 相和流动相。
案例分析
例如，当分析复杂的生物样品时，可以使用离子交换色谱柱和缓冲溶液作为流动相，以实现对带电离子的有效 分离。 根据需要，还可以选择具有不同化学性质的固定相，以进一步提高分离效果。
液相色谱的固定相与流动相
不同固定相的选择与优势
C18
适用于中极性非极性化合物，适用于医药化 学等领域。
手性
可以实现大量手性化合物的分离，广泛应用 于制药、医药等领域。
芳香族
由于分子间的π-π堆积作坊，固定相表面可 以容纳一定分子体积。主要用于分离芳香族 或含芳香族结构物质。
离子交换
适用于分离具有离子性的化合物和混合物。
常见的流动相
液相色谱的固定相与流动 相
液相色谱（Liquid Chromatography）是一种高效、分辨率较高、适用于大多 数分子的分离技术。本文将介绍液相色谱的固定相和流动相。
固定相的介绍
作用
固定相是固定在色谱柱中的一种材料。它的 主要作用是提供一个分离的平台。
种类
常见的固定相有C18、C8、芳香族、离子交 换、手性等，不同的固定相分离作用不一样。
选择因素
在选择固定相时需要考虑分离物的化学性质 和分子结构，以及分离柱的长度和直径等。
优势
固定相具有高分离效率、高分离分辨率、操 作简单、时间短、试剂消耗小等优点。
流动相的 按一定比例调配而成。
种类
常见的流动相种类有水、有机 溶剂、盐酸等，不同种类的流 动相适用于不同的分离柱。
3 环境领域
4 化工领域
适用于环境污染物分析、有机化合物测定、 微量元素测定等。
分离和纯化有机化学品、研究石油化工原 料和煤化学反应机理等。
总结与展望
液相色谱是一种高效、分辨率较高的分离技术，应用领域较广。未来液相色谱技术将更好地结合质谱， 等离子体及纳米技术，应用的领域将更加广泛和深入。
作用
流动相可以作为分离物在色谱 柱中移动的载体，通过改变流 动相的性质，对分离物产生分 离作用。
HPLC固定相与流动相
复杂样品中各种组分的方法。
02
它利用不同物质在固定相和流动 相之间的分配平衡进行分离，通 过检测器检测各个组分的性质和 含量。
HPLC的原理
高效液相色谱法基于物质在固定相和 流动相之间的分配平衡进行分离。
不同物质在固定相和流动相之间的分 配系数不同，因此通过色谱柱时，会 按照一定顺序流出，从而实现分离。
流动相以避免干扰。
测需求选择合适的固定相和流动相组合。
05 HPLC固定相与流动相的 优化
优化分离效果
01
02
03
选择合适的固定相
根据待测物质的性质，选 择具有适宜极性、选择性、 稳定性和寿命的固定相， 以提高分离效果。
调整流动相组成
通过调整流动相的组成， 如改变溶剂类型、比例和 pH值，可以改善分离效果。
固定相的选择
根据化合物性质选
择
对于不同极性和性质的化合物， 应选择具有相应极性和功能基团 的固定相。
根据分离要求选择
根据分离要求，如分离度、分析 时间等，选择具有合适粒度和性 能的固定相。
实验验证
在实际应用中，对固定相的选择 应进行实验验证，以确保其性能 和分离效果符合要求。
03 HPLC流动相
控制温度
适当升高温度可以提高流 动相的流速和降低黏度， 有助于提高分离效果。
提高检测灵敏度
选择高灵敏度检测器
根据待测物质的性质，选择高灵敏度的检测器，如紫 外、荧光、电化学检测器等。
优化检测波长
选择合适的检测波长可以降低背景干扰，提高检测灵 敏度。
降低样品浓度
通过优化样品处理和稀释方法，降低样品浓度，可以 降低检测限和提高灵敏度。
流动相的组成和性质也会影响分离效果。例如，使用不同的有机溶剂或 混合溶剂可以改变流动相的极性和粘度，从而影响物质在固定相上的吸 附和解析能力。
液相色谱的固定相与流动相
supercritical fluid chromatograph
结束
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（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正 相柱。
（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液 液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺序相动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇 、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
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2.液-固吸附分离固定相
种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：5～10 μm；
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3.离子交换色谱分离固定相
结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂
薄壳玻璃珠为担体，表 面涂约1%的离子交换树脂； （2）离子交换键合固定相
薄壳键合型；微粒硅胶 键合型（键合离子交换基团）
（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相不应有紫外吸收。
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第一节 高效液相色谱的特点与仪器
feature and instrument of HPLC
第二节 基本原理与主要分离类型
basic principle and main separating types
化学键合固定相的特点
（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快； （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；
耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； （5）有利于梯度洗脱；
2.高效液相色谱仪和固定相、流动相
光电二极管阵列检测器
3. 差示折光检测器（differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器；
可连续检测参比池和样品池中溶液的折光 指数差值。差值与浓度呈正比；
特点：
通用型检测器 ; 灵敏度低（10-7g.mL-1），不能用于痕量分 析; 对温度敏感，要求使用温度恒定; 对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱。
六、液相色谱法流动相
1. 流动相特性 2. （1）流动相的种类、配比可显著改变组
分分离状况； 3. （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相
， 称为正相液液色谱法; 4. （3）流动相的极性大于固定液的极性，
则称为反相液液色谱 。
组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。
2. 流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗
外梯度: 两台高压泵， 将两种不同极性的溶剂 按一定的比例送入梯度 混合室，混合后进入色 谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两 种或多种不同极性的溶 剂按一定的比例抽入高 压泵中混合。
讨论1
用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品， 以某一比例甲醇-水为流动相时，样品容 量因子较小，若想使容量因子增加，较 好的办法是 A 增加流动相中甲醇的比例 B增加流动相中水的比例 C流动相中加入少量HAc D流动相中加入少量的氨水
高压泵按其性质可分为恒压泵、恒流泵两类
1）往复式柱塞泵： 恒流 泵； 易于更换溶剂，适用于梯 度洗脱但有脉冲波动，可 以加一阻尼器抑制脉冲。
2）气动放大泵： 恒压泵 液缸体积大，更换流动相 不方便，不便于梯度洗脱， 无脉冲、稳定流量的输出, 现多用于装柱。
2 液相色谱流动相和固定相的选择
• 流动相能吸附在固定相上， 造成溶质在固定相上吸附力 的减弱
• 痕量的水足以改变吸附表面活性 • 控制水含量是得到较好重现性的主要因素
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离子交换溶剂
CONFIDENTIAL
使用缓冲溶液在一 pH 值下让样品带电 • 酸性样品：pH 必須大于 5 • 碱性樣品：pH 必須小于 5 当缓冲溶液浓度增加、溶剂强度变强， 减少保留 加入有机溶剂能改变保留特性与选择性 离子对试剂通常微短链离子
24
非极性相互作用
CONFIDENTIAL
键和官能团 (C8)
NH2
SO3-
硅胶基体
范德华力
25
极性相互作用
CONFIDENTIAL
硅胶基体
O OH H
H
O
H
O
O N
C
偶极性引力、氢键
26
离子交换相互作用力
CONFIDENTIAL
硅胶基体
OH
SO3+N
NH3+
CO2H
CO2OCON(CH3)2
17
17
等度洗脱
CONFIDENTIAL
等度洗脱不能完全分离样品 • 某些样品太复杂 • 较早洗脱出的色谱峰分离度太差 • 较晚洗脱出的色谱峰变宽或拖尾 • 考虑梯度洗脱
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梯度洗脱
CONFIDENTIAL
梯度洗脱时流动相强度随溶剂组成的改变而增强 • 梯度洗脱广泛适用于许多复杂样品与生物、聚合物样 品的分离
CONFIDENTIAL
Immiscible Miscible
Diisopropyl ether
Tetrachloroethane Tetrahydrofuran Toluene Trichloroethane Xylene
常见液相色谱种类
常见液相色谱种类液相色谱（Liquid Chromatography, LC）是一种基于液体作为流动相的色谱分析技术。
根据不同的分离原理、柱填充材料和应用领域的不同，液相色谱可以分为多种不同的类型。
以下是常见的几种液相色谱种类：1. Normal Phase液相色谱（NPC）：常用极性柱填料，非极性试样分配在固定相上，较极性的成分在流动相中移动快，实现分离。
主要适用于天然产物、大多数有机化合物和水溶性物质的分离。
2. Reverse Phase液相色谱（RPC）：常用非极性柱填料，非极性试样在固定相上分配，极性的成分在流动相中移动快，实现分离。
广泛应用于生物分子、药物、环境污染物等的分离和分析。
3.离子交换液相色谱（IEC）：柱填充材料含有带电离子交换功能的固定相，利用样品中的带电离子与固定相上相反电荷的离子交换吸附作用进行分离。
主要应用于电解质分析、酸碱度测定和水质分析等。
4.凝胶渗透液相色谱（GPC）：柱填充材料为聚合物凝胶，根据溶质在凝胶孔隙中的渗透性差异进行分离。
主要用于高分子物质的分子量分析。
5.亲和液相色谱（AEC）：柱填充材料为具有亲和作用的固定相，其分离流动相中的目标化合物与固定相上的配体发生特异性结合，实现目标分离。
常用于生物分子、金属离子以及抗体和抗原等的纯化和分离。
6.氢氟酸-离子含量液相色谱（HFIC）：利用离子交换柱在氢氟酸流动相中与离子交换固定相发生相互作用进行分离，主要用于离子含量测定。
7.毛细管电泳液相色谱（CE-LC）：将毛细管电泳和液相色谱相结合的技术，利用电动力和液体流动相进行分离，具有快速分离、高效和高灵敏度等优点。
此外，还有射流色谱、微生物液相色谱、薄层液相色谱、离子对色谱、CPC连续萃取液相色谱等种类。
这些液相色谱类型在一定程度上适用于特定的分析需求和应用领域，可以根据具体的研究目的和样品特性选择合适的液相色谱方法。
高效液相色谱 固定相和流动相
高压液相色谱HPLC培训教程(六)IV．固定相和流动相在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离，是色谱工作者的重要工作，也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。
本章着重讨论填料基质、化学键合固定相和流动相的性质及其选择。
一、基质（担体）HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。
无机物基质主要是硅胶和氧化铝。
无机物基质刚性大，在溶剂中不容易膨胀。
有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。
有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。
1．基质的种类1）硅胶硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。
除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。
硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。
缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。
通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2~8。
硅胶的主要性能参数有：①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布。
与比表面积成反比。
③比表面积。
在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度（率）。
在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性。
在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾。
在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状。
硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差；后者无此缺点。
⑧硅胶纯度。
对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。
2）氧化铝具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。
它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。
但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。
不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。
液相色谱仪的工作原理
液相色谱仪的工作原理液相色谱仪（HPLC）是一种高效分离和分析化学物质的仪器，广泛应用于制药、生物化学、环境监测等领域。
其工作原理基于化学物质在液相流动中的分配和分离特性，通过不同化学物质在固定相和流动相之间的相互作用来实现分离和检测。
1. 流动相在液相色谱仪中，流动相是指用于将样品输送到色谱柱中的溶剂。
流动相通常是由溶剂混合而成的，常用的溶剂包括水、甲醇、乙腈等。
流动相的选择取决于待分离的化合物的特性，如极性、溶解度等。
流动相的选择对色谱分离的效果有重要影响。
2. 固定相固定相是色谱柱中的填料，其作用是将化合物分离开来。
固定相通常是由多孔硅胶或者聚合物制成的微小颗粒，颗粒的大小和化学性质对分离效果起着重要作用。
固定相的选择也取决于待分离的化合物的特性，如分子大小、极性等。
3. 样品注入样品注入是将待分析的化合物引入色谱系统的过程。
通常情况下，样品会被溶解在流动相中，然后通过进样器注入色谱柱。
进样器可以采用不同的方式，如手动注射、自动进样器等。
4. 色谱柱色谱柱是液相色谱仪中最关键的部件之一，其内部填充有固定相。
当样品进入色谱柱后，不同化合物会因为与固定相的相互作用而发生分离，从而实现对化合物的分析和检测。
5. 检测器色谱柱中分离的化合物会通过检测器进行检测和定量分析。
常用的检测器包括紫外-可见吸收检测器（UV-Vis）和荧光检测器等。
检测器会根据化合物的特性产生相应的信号，然后通过数据采集系统进行记录和分析。
6. 数据分析最后，液相色谱仪通过数据采集系统将检测到的信号转化为图谱或者色谱图，进而进行数据分析和定量分析。
数据分析可以帮助人们快速准确地获得化合物的信息，如浓度、纯度等。
总的来说，液相色谱仪的工作原理是基于化学物质在固定相和流动相之间的相互作用来实现分离和检测。
通过流动相、固定相、样品注入、色谱柱、检测器和数据分析等步骤，液相色谱仪能够快速准确地分离和分析化合物，为化学分析提供了重要的技术手段。
hplc测定原理
hplc测定原理HPLC（高效液相色谱）是一种常用的分离技术，广泛应用于化学、生物、环境等领域。
它基于样品在液相中的分配行为，通过样品在固定相和流动相之间的相互作用来实现分离。
HPLC的原理可以简单概括为样品在固定相上的分配和再分配过程。
HPLC的分离原理主要依赖于固定相和流动相之间的相互作用。
固定相通常是一种固定在柱子中的微小颗粒，其表面会覆盖有各种化学官能团。
而流动相则是由溶剂组成的移动相，通过泵浦将其送入柱子中。
在HPLC分析过程中，样品被注入到柱子中，并随着流动相的通过而进行分离。
样品中的化合物会与固定相发生相互作用，其分配在固定相表面上。
不同的化合物由于其在固定相上的亲疏水性质不同，会在固定相上停留的时间也不同。
这样，不同的化合物就可以通过调整流动相的性质，如溶剂的成分和浓度，来实现分离。
通过调整流动相的性质，可以控制不同化合物的停留时间。
分离程度较好的化合物会在柱子中停留的时间长，而分离程度较差的化合物则停留的时间短。
当流动相从柱子中流出时，不同化合物会以不同的时间被检测器检测到。
通过测量各个化合物的峰面积或峰高，可以计算出它们的浓度或含量。
HPLC测定原理的关键在于固定相和流动相之间的相互作用。
通过调整流动相的组成，可以改变固定相上化合物的分配行为，从而实现分离。
同时，通过检测器对不同化合物的检测，可以获得定量的分析结果。
HPLC测定原理是基于样品在固定相和流动相之间的相互作用来实现分离的。
通过调整流动相的性质和检测不同化合物的信号，可以获得准确的分析结果。
HPLC在分析领域的广泛应用，为科学研究和工业生产提供了强有力的支持。
高效液相色谱法常用的流动相
高效液相色谱法常用的流动相
高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分离和分析技术，其流动相的选择对分离效果至关重要。
常用的流动相分为以下几种：
1. 甲醇：甲醇是一种常用的有机溶剂，具有良好的溶解性和极性。
在反相色谱中，甲醇常与水混合作为流动相，以实现对极性物质的分离。
2. 乙腈：乙腈是一种有机溶剂，具有较高的极性。
与甲醇类似，乙腈也可以与水混合作为流动相，用于反相色谱中对极性物质的分离。
3. 水：水是一种无机溶剂，具有良好的极性。
在正相色谱中，水常与有机溶剂（如甲醇、乙腈等）混合作为流动相，以实现对极性物质的分离。
4. 乙酸乙酯：乙酸乙酯是一种有机溶剂，具有较弱的极性。
在正相色谱中，乙酸乙酯可以与水混合作为流动相，用于分离弱极性物质。
5. 庚烷：庚烷是一种非极性有机溶剂，适用于分离非极性物质。
在反相色谱中，庚烷可以与甲醇或乙腈混合作为流动相。
6. 混合溶剂：根据被测物的极性和分离需求，可以选用两种或多种溶剂混合作为流动相。
例如，甲醇与水混合用于反相色谱，乙腈与水混合用于正相色谱等。
流动相的选择应考虑以下因素：
1. 被测物的极性：根据被测物的极性选择相应的流动相，以实现良好的分离效果。
2. 固定相的选择：根据固定相的极性，选择与之匹配的流动相。
3. 检测器的要求：某些检测器对流动相的极性有要求，需根据检测器类型选择合适的流动相。
4. 实验条件：如流速、柱温等实验条件，也会影响流动相的选择。
在高效液相色谱法中，常用的流动相包括甲醇、乙腈、水、乙酸乙酯、庚烷等，具体选择需根据被测物的极性、固定相、检测器要求等因素综合考虑。
液相色谱中固定相和流动相的概念
在液相色谱中，流动相通过样品混合物，使其与固定相发生相互作用，从而导 致样品中的成分以不同速度通过柱，实现分离。分离的过程基于样品成分在固 定相和流动相之间的相互作用和亲和性。
总体而言，液相色谱通过调整固定相和流动相的性质，使不同的化合物以不同 的速度在柱中传播，从而实现对混合物中化合物的分离和检测。
2. 流动相（Mobile Phase）： • 定义： 流动相是在液相色谱柱中流动的溶剂，它将样品与固定相 接触并推动它们通过柱，实现分离。流动相的组成和性质会对分 离过程产生重要影响。 • 性质： 流动相通常是液体，可以是有机溶剂、水或它们的混合 物，具体取决于分离的目标和所使用的固定相。例如，在反相液 相色谱中，水和有机溶剂（如甲醇或乙腈）的比例将影响化合物 的亲水性与亲油性。
液相色谱中固定相和流动相的概念
在液相色谱（Liquid Chromatography，简称 LC）中，固定相和流动相是两 个关键的概念，它们共同作用以实现化合物的分离。
1. 固定相（Stationary Phase）： • 定义： 固定相是液相色谱柱中的不动的部分，通常涂覆或填充在 柱内。这个相对于流动相而言是固定不动的。 • 性质： 固定相通常是一种固体或涂层，它的性质直接影响到分离 的选择性。不同类型的固定相对于不同类型的化合物具有不同的 选择性。例如，正相液相色谱使用亲油性的固定相，而反相液相 色谱则使用亲水性的固定相。
第十章高效液相色谱分析法第三节高效液相色谱固定相与流动相
第十章高效液相色谱分析法第三节高效液相色谱固定相与流动相高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种使用高压泵将样品溶液通过固定相柱进行分离和分析的方法。
在HPLC中，固定相和流动相是非常重要的组成部分，对于分离和分析的效果起着决定性的作用。
1.高效液相色谱固定相高效液相色谱固定相是指填充在色谱柱中的材料，它起到分离样品的作用。
常见的固定相有：（1）硅胶固定相：硅胶是一种多孔材料，具有较大的比表面积，能够有效地吸附样品分子，是一种通用的固定相材料。
（2）反相固定相：反相色谱是基于样品中非极性化合物与反相固定相之间的亲水作用力不强而进一步分离的一种方法。
常见的反相固定相有碳链固定相（如C18、C8等）和脂肪酸链固定相（如ODS、ODPS等）。
（3）离子交换固定相：离子交换色谱是通过固定相中的离子交换基团与样品中的离子之间的相互作用来实现分离的一种方法。
常见的离子交换固定相有阴离子交换基团和阳离子交换基团。
（4）亲和层析固定相：亲和层析是一种根据样品中分子与固定相中的特殊结构之间的亲和作用力来实现分离的方法。
常见的亲和层析固定相有金属离子螯合固定相、抗体亲和固定相等。
2.高效液相色谱流动相高效液相色谱流动相是指用于输送样品溶液的溶剂。
它在分离和分析过程中起到溶解和移动样品分子的作用。
根据溶剂的极性不同，可以分为非极性溶剂、极性溶剂和离子对溶剂。
（1）非极性溶剂：如正己烷、甲苯，主要用于非极性物质的分离。
（2）极性溶剂：如乙醇、乙酸乙酯，主要用于极性物质的分离。
（3）离子对溶剂：如甲酸和甲醇的混合物，主要用于离子性物质的分离。
离子对溶剂一般用于反相色谱中，可以增加色谱的选择性。
高效液相色谱固定相和流动相的选择主要根据被分离物的性质、分析的需求和设备的特点来确定。
对于样品中多种成分的分离，可以采用多种固定相和流动相的组合，以达到最佳的分离和分析效果。
高效液相色谱对流动相的要求
高效液相色谱对流动相的要求是什么呢对于高效液相色谱来说，流动相的选择是非常重要的。
以下是一些对于流动相的基本要求：
1、流动相应与固定相相容，即不会与固定相发生化学反应或物理吸附。
2、流动相应具有合适的极性和沸点，以便在色谱柱中进行分离。
3、流动相应具有足够的纯度，以保证在色谱柱中不会产生背景杂质或干扰峰。
4、流动相应具有合适的pH值，以保护色谱柱和检测器，同时保证样品的完全分离。
5、流动相应具有合适的缓冲能力，以保持分离峰的稳定性和分离效果。
6、流动相应具有合适的流速和流量，以保证分离效果和分离速度。
7、流动相应易于更换和再生，以保持色谱柱的性能和延长其使用寿命。
因此，在选择流动相时，需要根据具体的实验条件和样品特点进行综合考虑，选择最适合的流动相，以确保高效液相色谱分析的准确性和可靠性。
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５. 手性固定相
生物、药物分子和天然有机 产物的分离。 环糊精（CD）疏水性，所有 羟基在空腔的外沿呈亲水性，这 使它们能与各种极性、非极性分 子、离子形成包含化合物（主客 体配合物）。 1984年Armstrong首次将环糊精键合到二氧化硅上 用作HPLC的手性分离固定相，目前已成为十分普及的 手性固定相。 全苯基环糊精分离柱特别适合于分离氨基醇类β阻 断剂，而其他类型手性固定相则很难分离。
第三节 液相色谱固定相 与流动相
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4.3.1 液相色谱固定相
1. 液-液分配及离子对分离固定相
（1）全多孔型担体 氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用 100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。 （2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30 ～ 40 μ m 的玻璃微球， 表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。 表面积小，柱容量低。
（1）传质快，表面无深凹陷。 （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 耐水，耐光，耐有机溶剂，稳定。 （4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性。 （5）有利于梯度洗脱。 存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定) 高覆盖率：分配为主； 低覆盖率：吸附为主。
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2.液-固吸附分离固定相
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2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、 乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
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4. 空间排阻分离固定相
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等，多孔网状结构。 水为流动相，适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响 小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。
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（3）化学键合固定相
化学键合固定相：应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水，耐光，耐有机溶剂，应用最广。 c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
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化学键合固定相的特点：
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请选择内容
4.1 高效液相色谱法的特性
4.2 高效液相色谱仪
4.3 液相色谱的固定相与流动相 4.4 液相色谱中的主要分离类型 4.5 液相色谱分析条件的选择 4.6 高效液相色谱法的应用
4.7 离子色谱法
4.8 超临界流体色谱法
结束
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4. 选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱 子。如使固定液溶解流失，酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并 在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测 器时，流动相不应有紫外吸收。
第四章 4.3.1 液相色谱固定相 高效液相色谱法和 4.3.2 液相色谱流动相 超临界流体色谱法
High performance liquid chromatography and Supercritical fluid chromatography
Stationary phase and mobile phase of HPLC
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4.3.2 液相色谱的流动相
1. 流动相特性
（1 ）流动相组成改变，极性改变，可 显著改变组分分离状况。
（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性 小于固定相的极性，正相，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液 色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺序相反。
种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。种类有
限，应用面相对较窄。
结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：5～10 μm。
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3.离子交换色谱分离固定相
结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂 约1%的离子交换树脂。 （2）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合 型（键合离子交换基团）。 树脂类别： （ 1 ） 阳离子交换树脂（强酸 性、弱酸性）。 （ 2 ） 阴离子交换树脂（强碱 性、弱碱性）。
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3. 流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时，首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使 保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮>二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫 化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)