免疫标记技术的基本概念.ppt
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《标记免疫技术》课件
抗原或抗体的含量。
荧光物质具有高灵敏度、高特异性和可 定量检测等优点，使得荧光免疫技术成 为一种高灵敏度、高特异性的检测方法
。
荧光物质可以通过不同的激发光波长和 发射光波长进行选择，从而实现多组分
的同时检测。
荧光免疫技术的应用
荧光免疫技术在医学领域中广泛应用于感染性疾病、肿瘤标志物、激素、细胞因子 等的检测。
该技术的基本原理是利用酶标记的抗 体或抗原，与相应的抗原或抗体结合 ，形成酶-抗原-抗体的复合物。
酶联免疫技术的应用
酶联免疫技术广泛应用于医学、生物 学、化学等领域，如诊断试剂、药物 筛选、食品安全检测等。
在生物学领域，酶联免疫技术用于研 究生物分子相互作用、蛋白质表达和 细胞信号转导等方面。
在医学领域，酶联免疫技术被用于检 测各种传染病、肿瘤标志物、自身抗 体等，为疾病的早期诊断和治疗提供 了有力支持。
化学发光免疫技术的优缺点
优点
化学发光免疫技术具有高灵敏度 、高特异性和低检测限等优点， 能够实现快速、准确地定量分析 目标物质。
缺点
该技术的缺点是标记物的制备较 为复杂，且某些化学发光物质具 有一定的毒性，需要谨慎处理。
THANKS
感谢观看
REPORTING
环境监测
用于检测环境中的有害物 质、污染物等，评估环境 质量。
标记免疫技术的发展历程
19世纪末
免疫学基础理论建立，为标记免疫技术发 展奠定了基础。
21世纪初
随着生物技术的不断发展，新型标记免疫 技术不断涌现，如量子点标记免疫技术、 纳米材料标记免疫技术等。
20世纪初
放射免疫技术诞生，实现了对生物样本中 微量物质的定量分析。
20世纪90年代
荧光免疫技术和化学发光免疫技术得到广 泛应用，进一步提高了检测的灵敏度和自 动化程度。
荧光物质具有高灵敏度、高特异性和可 定量检测等优点，使得荧光免疫技术成 为一种高灵敏度、高特异性的检测方法
。
荧光物质可以通过不同的激发光波长和 发射光波长进行选择，从而实现多组分
的同时检测。
荧光免疫技术的应用
荧光免疫技术在医学领域中广泛应用于感染性疾病、肿瘤标志物、激素、细胞因子 等的检测。
该技术的基本原理是利用酶标记的抗 体或抗原，与相应的抗原或抗体结合 ，形成酶-抗原-抗体的复合物。
酶联免疫技术的应用
酶联免疫技术广泛应用于医学、生物 学、化学等领域，如诊断试剂、药物 筛选、食品安全检测等。
在生物学领域，酶联免疫技术用于研 究生物分子相互作用、蛋白质表达和 细胞信号转导等方面。
在医学领域，酶联免疫技术被用于检 测各种传染病、肿瘤标志物、自身抗 体等，为疾病的早期诊断和治疗提供 了有力支持。
化学发光免疫技术的优缺点
优点
化学发光免疫技术具有高灵敏度 、高特异性和低检测限等优点， 能够实现快速、准确地定量分析 目标物质。
缺点
该技术的缺点是标记物的制备较 为复杂，且某些化学发光物质具 有一定的毒性，需要谨慎处理。
THANKS
感谢观看
REPORTING
环境监测
用于检测环境中的有害物 质、污染物等，评估环境 质量。
标记免疫技术的发展历程
19世纪末
免疫学基础理论建立，为标记免疫技术发 展奠定了基础。
21世纪初
随着生物技术的不断发展，新型标记免疫 技术不断涌现，如量子点标记免疫技术、 纳米材料标记免疫技术等。
20世纪初
放射免疫技术诞生，实现了对生物样本中 微量物质的定量分析。
20世纪90年代
荧光免疫技术和化学发光免疫技术得到广 泛应用，进一步提高了检测的灵敏度和自 动化程度。
《免疫标记技术》PPT课件_OK
47
48
• 如抗原纯度高，可直接包被固相。 • 如抗原中有干扰物质，直接包被不易成功，可采用
捕获包被法。即先包被与固相抗原相应的抗体，再 加入抗原形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质， 然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。
49
• 捕获包被法：临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获 包被法。 间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或 IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体， 因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将 竞争结合固相抗原而使部份IgM抗体不能结合到固相 上。因此用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体。 此时必须先将标本用抗IgG抗体处理，以除去IgG干 扰。
29
• 竞争法：是将特异性抗体吸附于固相载体表面，此 过程称为包被（coated），或叫致敏。经洗涤后分成 两组，一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；另 一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色， 这两组底物的降解量之差，即为所要测定的未知抗 原量。
30
竞争法
31
• 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可。 因此，常用对小分子抗原如激素和药物类的测定。
– 应用酶标测定仪可作定量分析、敏感度可达ng水平。 常用于标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。 这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长 时间。
22
23
– 目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。 前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原，后者主要测 定可溶性抗原与抗体。
– 本法既无放射性污染又不需昂贵的测试仪器，且试剂 稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观，既可定 性也可定量分析等，已广泛用于免疫学、微生物学、 寄生虫学、肿瘤学和细胞因子检测等领域。
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• 如抗原纯度高，可直接包被固相。 • 如抗原中有干扰物质，直接包被不易成功，可采用
捕获包被法。即先包被与固相抗原相应的抗体，再 加入抗原形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质， 然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。
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• 捕获包被法：临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获 包被法。 间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或 IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体， 因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将 竞争结合固相抗原而使部份IgM抗体不能结合到固相 上。因此用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体。 此时必须先将标本用抗IgG抗体处理，以除去IgG干 扰。
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• 竞争法：是将特异性抗体吸附于固相载体表面，此 过程称为包被（coated），或叫致敏。经洗涤后分成 两组，一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；另 一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色， 这两组底物的降解量之差，即为所要测定的未知抗 原量。
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竞争法
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• 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可。 因此，常用对小分子抗原如激素和药物类的测定。
– 应用酶标测定仪可作定量分析、敏感度可达ng水平。 常用于标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。 这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长 时间。
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– 目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。 前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原，后者主要测 定可溶性抗原与抗体。
– 本法既无放射性污染又不需昂贵的测试仪器，且试剂 稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观，既可定 性也可定量分析等，已广泛用于免疫学、微生物学、 寄生虫学、肿瘤学和细胞因子检测等领域。
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《免疫标记技术》课件
胶体金标记抗体和抗原的制备
胶体金颗粒的制备： 通过化学方法将金 离子还原为胶体金 颗粒
抗体或抗原的制备： 通过生物技术方法 制备特异性抗体或 抗原
标记反应：将胶体 金颗粒与抗体或抗 原进行标记反应， 形成胶体金标记抗 体或抗原
纯化：通过离心、 过滤等方法对胶体 金标记抗体或抗原 进行纯化，去除杂 质和未结合的胶体 金颗粒
确性
实验室安全与防护
实验室环境：保持清洁、通风 良好
实验操作：遵守操作规程，避 免交叉污染
防护设备：使用防护服、手套、 口罩等防护设备
废弃物处理：妥善处理废弃物， 避免环境污染
07
免疫标记技术的未来发 展
新技术的应用和展望
免疫标记技 术在疾病诊 断中的应用
免疫标记技 术在药物研 发中的应用
免疫标记技 术在食品安 全检测中的 应用
镜ห้องสมุดไป่ตู้察等。
04 免疫酶技术
酶标抗体和酶标抗原的制备
酶标抗体的制 备：通过免疫 反应，将酶与 抗体结合，形
成酶标抗体
酶标抗原的制 备：通过化学 方法，将酶与 抗原结合，形
成酶标抗原
酶标抗体和酶 标抗原的纯化： 通过色谱法、 电泳法等方法
进行纯化
酶标抗体和酶 标抗原的保存： 低温保存，避 免酶的活性降
交叉学科融合与创新
免疫标记技术与生物医学的融合：提高疾病诊断和治疗效果
免疫标记技术与纳米技术的融合：开发新型免疫标记材料和检测方法
免疫标记技术与人工智能的融合：实现自动化、智能化的免疫标记检测和 分析 免疫标记技术与大数据、云计算的融合：提高免疫标记数据的处理和分析 效率，为疾病预防和治疗提供更准确的信息支持。
荧光免疫标记应用： 细胞标记、蛋白质 标记、DNA标记 等
免疫标记技术课件
1. 它不需 ELISA 法中所要求的作用的底物和显色 剂，使操作更简便;
2.胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境;
3.胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定,有 效期长; 4.灵敏度高，10-25IU/L。
免疫标记技术
Immunolabeling technique
免疫标记技术
用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）
进行抗原-抗体反应。 标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变 抗体或 抗原的免疫学特性，且极大的提高了反应的灵敏度，可以对 微量物质进行定量、定性 或定位检测。
免疫标记技术 = 免疫技术+ 标记技术
常用底物： 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。 AP灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，且稳定性低于HRP、 价高，故应用不如HRP普及。
基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性；
②酶促反应专一性，保证特异性；
③底物反应放大作用，提高敏感性； ④酶标试剂保存稳定；
⑤操作简便，安全易行。
常用方法: 酶联免疫吸附试验
一、双抗体夹心法检测HBsAg
实验材料
1.HBV诊断试剂盒； 2.HBsAg阳性对照品，阴性对照品，待检品。
HBV感染后的血清学指标: HBsAg, HBsAb
乙肝表面抗原,存在于 HBV感染的急性期及慢 性期的血清中,为感染 指标。
HBeAg, HBeAb
HBcAb(IgG,IgM)
实验步骤
层析流方向
G：金标鼠抗人HCG单抗
T：鼠抗人HCG单抗
C：羊抗鼠IgG抗体 B：吸水纸
HCG金标试纸
滴加标本 复溶 固定
反应条带
质控条带
A
G 层析流方向
2.胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境;
3.胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定,有 效期长; 4.灵敏度高，10-25IU/L。
免疫标记技术
Immunolabeling technique
免疫标记技术
用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）
进行抗原-抗体反应。 标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变 抗体或 抗原的免疫学特性，且极大的提高了反应的灵敏度，可以对 微量物质进行定量、定性 或定位检测。
免疫标记技术 = 免疫技术+ 标记技术
常用底物： 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。 AP灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，且稳定性低于HRP、 价高，故应用不如HRP普及。
基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性；
②酶促反应专一性，保证特异性；
③底物反应放大作用，提高敏感性； ④酶标试剂保存稳定；
⑤操作简便，安全易行。
常用方法: 酶联免疫吸附试验
一、双抗体夹心法检测HBsAg
实验材料
1.HBV诊断试剂盒； 2.HBsAg阳性对照品，阴性对照品，待检品。
HBV感染后的血清学指标: HBsAg, HBsAb
乙肝表面抗原,存在于 HBV感染的急性期及慢 性期的血清中,为感染 指标。
HBeAg, HBeAb
HBcAb(IgG,IgM)
实验步骤
层析流方向
G：金标鼠抗人HCG单抗
T：鼠抗人HCG单抗
C：羊抗鼠IgG抗体 B：吸水纸
HCG金标试纸
滴加标本 复溶 固定
反应条带
质控条带
A
G 层析流方向
《标记免疫技术》PPT课件
滴度
最大稀释度。在本技术方法中是指结合50％标记抗原时的
抗血清的稀释度。
a
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免疫学及免疫学检验
放射免疫分析（ RIA ）
基本原理
采用定量的标记抗原（Ag＋）和非 标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异 性抗体（Ab）的反应。
a
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免疫学及免疫学检验
a
12
免疫学及免疫学检验
a
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免疫学及免疫学检验
标记免疫技术
医学检验系临床微生物学及免疫学教研室 二OO四年三月
a
1
免疫学及免疫学检验
标记免疫技术= 免疫技术+标记技术
抗原抗体反应 示踪物标记
特异性
标记免疫技术的主要特点：
高特异性、高灵敏性
a
灵敏性
2
免疫学及免疫学检验
标记免 疫技术
免疫组 化技术
免疫测 定技术
示踪物及 标记技术
a
放射免疫技术 荧光免疫技术 酶免疫技术 化学发光技术 金免疫技术
a
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免疫学及免疫学检验
a
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免疫学及免疫学检验
IRMA与RIA的异同点
标记物 在RIA中 核素标记抗原，抗原有不同种类，根
据其化学结构，标记时需用不同的核素和不同的方法。在 IRMA中 核素标记抗体。抗体为蛋白质，有利于碘化标记， 不同抗体标记方法基本相同。标记抗体的比活度高，提高了 分析的灵敏度。
加样误差可严重影响测定结果。IRMA中标记和固相抗体在 反应中都是过量的，只有受检标本的加样误差才会影响分 析结果。因此，IRMA的批内和批间变异均比较小。
其他
RIA可以测定大分子量与小分子量的物质，双位点 IRMA只能测定在分子上具有2个以上抗原表位的物质。在 RIA中应用的为多克隆抗体，亲和力和特异性要求较高， 但用量很少。IRMA中标记抗体和固相抗体用量较多，一般 均用来源丰富、特异性较高的单克隆抗体。
动物免疫学课件：免疫标记技术
較高的敏感性和特異性。 動物糞便、黏膜拭子塗片、病變組織觸
片或切片、尿沉渣等均可作為樣本 對含菌少的樣本，可採用濾膜聚菌法，
然後在濾膜上進行免疫螢光染色
（2）病毒病診斷 直接檢測病變組織中的病毒，是病毒病診
斷的常用手段。如豬瘟、雞傳支 豬流行性腹瀉和傳染性胃腸炎，臨床症狀
相似，但將豬小腸做切片，即可區分 對於豬瘟等不出現細胞病變的病毒，免疫
2 包被 將抗原或抗體吸附於固相表面的過程。 大多數 抗原易吸附在表面。用碳酸鹽緩衝液 包被，4℃過夜或37℃吸附2~3h。 3 洗滌 用含0.05%Tween-80的PBS
4 實驗方法
直接法 用於測抗原 （如沙門氏菌）
（1）待檢抗原包被
（2）洗滌3~5次，每次3~5min
（3）封閉 含1%OVA的PBS（pH7.2，濃 10mmol）
雙抗體夾心法
（1）抗AIV多抗包被 （2）洗滌3~5次，每次3~5min （3）封閉 含1%OVA的PBS（pH7.2，濃度
為10mmol） （4）洗滌 同上 （5）加待檢抗原，置濕盒中， 37℃作用
1~2h
（6）洗滌 同上 （7）加抗AIV單抗，置濕盒中， 37℃作用
1~2h （8）洗滌 同上 （9）加酶標記抗AIV單抗，置濕盒中， 37℃作
指用螢光素對抗體進行標記，然後用螢 光顯微鏡觀察螢光，以分析示蹤相應的抗 原或抗體的方法。 Coons等1941年建立該技術，當時用螢 光黃標記，但效果不好，故不能推廣。
當發現異硫氰酸螢光素（FITC）被發現後， 以及螢光抗體純化技術的發展，顯著提高了螢 光抗體技術的敏感性和特異性，故得到廣泛應 用。
用於病原檢測、疫病診斷等
1 原理： 螢光素在超微濃度下，亦能被短波長光
片或切片、尿沉渣等均可作為樣本 對含菌少的樣本，可採用濾膜聚菌法，
然後在濾膜上進行免疫螢光染色
（2）病毒病診斷 直接檢測病變組織中的病毒，是病毒病診
斷的常用手段。如豬瘟、雞傳支 豬流行性腹瀉和傳染性胃腸炎，臨床症狀
相似，但將豬小腸做切片，即可區分 對於豬瘟等不出現細胞病變的病毒，免疫
2 包被 將抗原或抗體吸附於固相表面的過程。 大多數 抗原易吸附在表面。用碳酸鹽緩衝液 包被，4℃過夜或37℃吸附2~3h。 3 洗滌 用含0.05%Tween-80的PBS
4 實驗方法
直接法 用於測抗原 （如沙門氏菌）
（1）待檢抗原包被
（2）洗滌3~5次，每次3~5min
（3）封閉 含1%OVA的PBS（pH7.2，濃 10mmol）
雙抗體夾心法
（1）抗AIV多抗包被 （2）洗滌3~5次，每次3~5min （3）封閉 含1%OVA的PBS（pH7.2，濃度
為10mmol） （4）洗滌 同上 （5）加待檢抗原，置濕盒中， 37℃作用
1~2h
（6）洗滌 同上 （7）加抗AIV單抗，置濕盒中， 37℃作用
1~2h （8）洗滌 同上 （9）加酶標記抗AIV單抗，置濕盒中， 37℃作
指用螢光素對抗體進行標記，然後用螢 光顯微鏡觀察螢光，以分析示蹤相應的抗 原或抗體的方法。 Coons等1941年建立該技術，當時用螢 光黃標記，但效果不好，故不能推廣。
當發現異硫氰酸螢光素（FITC）被發現後， 以及螢光抗體純化技術的發展，顯著提高了螢 光抗體技術的敏感性和特異性，故得到廣泛應 用。
用於病原檢測、疫病診斷等
1 原理： 螢光素在超微濃度下，亦能被短波長光
免疫标记技术PPT参考幻灯片
14
ELISA基本的实验过程
15
【实验器材】
1、AFP诊断试剂盒 2、AFP阳性对照品，阴性对照品，待检品 3、微量加样器、温箱
16
【操作步骤】
1. 将包被孔编号，分别加入阳性对照、待测样品及阴性对 照各50ul
2. 在各孔内加入酶结合物1滴，37℃温育30分钟 3. 甩掉孔内液体，然后在各孔中分别加入洗涤液1滴，摇
hCG
24
【实验原理】
25
【操作步骤】
1.待测样品、检测试纸和其它检测材料等恢复到 室温后检测 2.将测试纸有箭头的一端插入尿液标本容器中， 5秒钟后取出平放，5分钟内观察结果
注意：测试纸插入尿液深度不可超过MAX标志 线
26
【实验结果】
阳 阴 无性效：
27
思考题
1、免疫标记技术的特点是什么？ 2、在酶免疫标记技术中，最常用的酶是
医学免疫学实验四 免疫标记技术
Immunolabeling Technique
主讲：谢永生 病原生物学与免疫学教研室
1
简介
免疫标记技术(immunolabeling technique) 是指用荧光素、酶、放射性同位素等对抗 体或抗原进行标记，然后再通过检测标记 物来观察抗原抗体反应的实验技术。
优点：特异、敏度和快速； 可定性、定量和定位
4
放射免疫技术
◆ 放射免疫技术具有灵敏度高、特异性强、 精密度好的优点，常用于各种激素、微量 蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的 测定，但具有放射污染的缺点。
5
免疫酶技术
◆ 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高 效催化作用有机结合的一种方法。
◆ 常用的酶： – 辣根过氧化物酶(HRP) – 碱性磷酸酶(AP)
ELISA基本的实验过程
15
【实验器材】
1、AFP诊断试剂盒 2、AFP阳性对照品，阴性对照品，待检品 3、微量加样器、温箱
16
【操作步骤】
1. 将包被孔编号，分别加入阳性对照、待测样品及阴性对 照各50ul
2. 在各孔内加入酶结合物1滴，37℃温育30分钟 3. 甩掉孔内液体，然后在各孔中分别加入洗涤液1滴，摇
hCG
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【实验原理】
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【操作步骤】
1.待测样品、检测试纸和其它检测材料等恢复到 室温后检测 2.将测试纸有箭头的一端插入尿液标本容器中， 5秒钟后取出平放，5分钟内观察结果
注意：测试纸插入尿液深度不可超过MAX标志 线
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【实验结果】
阳 阴 无性效：
27
思考题
1、免疫标记技术的特点是什么？ 2、在酶免疫标记技术中，最常用的酶是
医学免疫学实验四 免疫标记技术
Immunolabeling Technique
主讲：谢永生 病原生物学与免疫学教研室
1
简介
免疫标记技术(immunolabeling technique) 是指用荧光素、酶、放射性同位素等对抗 体或抗原进行标记，然后再通过检测标记 物来观察抗原抗体反应的实验技术。
优点：特异、敏度和快速； 可定性、定量和定位
4
放射免疫技术
◆ 放射免疫技术具有灵敏度高、特异性强、 精密度好的优点，常用于各种激素、微量 蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的 测定，但具有放射污染的缺点。
5
免疫酶技术
◆ 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高 效催化作用有机结合的一种方法。
◆ 常用的酶： – 辣根过氧化物酶(HRP) – 碱性磷酸酶(AP)
免疫学课件——第九章 标记技术
显色反应及标本观察
免疫学原理与技术
酶联免疫吸附测定法ELISA(定性,定量) 将抗原或抗体吸附于固相载体上(聚苯乙 烯微量滴定板),在载体上进行免疫酶染色,底物 染色后用肉眼或分光光度计判定结果.
免疫学原理与技术
抗原或抗体的包被
将抗原或抗体吸附于故相载体表面的过程. 为了增强包被能力可采取以下方法:
酶分子
醛基
酶结合物的提纯 酶结合物的鉴定 酶和抗体活性的鉴定 结合物定量测定 酶结合物的保存 小量分装,-20℃保存,或在33％的甘油溶液 中4℃保存.
免疫学原理与技术
3.免疫酶技术操作 免疫酶组化染色法(定性,定位) 标本的处理和制备:切片,压片,涂片等. 消除内源酶,消除背景染色. 染色方法: *直接法:待检抗原,酶标抗体,底物和供氢体
Hale Waihona Puke 免疫学原理与技术一.荧光抗体技术
荧光素在10-8超低浓度时,仍然可被短波光 激发,发出明亮的,肉眼能够感知的荧光. 免疫试验用到的荧光素有异硫氰酸荧光素 (FITC),四乙基罗丹明(RB200),四甲基异硫氰 酸罗丹明(TMRITC).其中应用最广的是异硫 氰酸荧光素,为黄色结晶状粉末,分子量389,有 Ⅰ,Ⅱ两种异构体,易溶于水和酒精,性质稳定, 低温干燥可保存多年,能与蛋白质良好结合,异 构体Ⅰ效果更好,它的最大吸收光谱为490-495 纳米,最大发射光谱为520-530纳米,呈明亮的黄 绿色荧光.
底物显色
本法的供氢体的产物必须是水溶性的.
终止反应
每孔加浓硫酸50微升
结果观察
肉眼或分光光度计记录显色结果
免疫学原理与技术
三.放射免疫技术
将同位素测量的高灵敏性和抗原抗体反应 的高特异性结合起来,则为放射免疫技术. 常用的同位素有: 131I,125I,3H,14C,32P,35S. 1.同位素标记 外标记与那标记 2.标记抗原的鉴定 放射化学纯度 免疫化学活性 标记抗原用量 放射性强度
第一节免疫标记技术的基本概念 ppt课件
免疫标记技术是标志物与免疫活性物质的联接技术，涉及多种方法如酶标志技术、荧光标志技术、放射性核素标志技术等。酶标志技术常用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶作为标志物，通过戊二醛交联法或过碘酸盐氧化法进行联接。荧光标志技术则利用荧光素与蛋白质结合，要求荧光素具有高荧光效率、与背景对比鲜明且不法或间接法实现。这些技术广泛应用于免疫测定和免疫组化，用于检测和分析各种生物样品中的靶物质。每种技术都有其特定的操作要点和鉴定方法，确保标志物的准确性和可靠性。通过学习和应用这些免疫标记技术，我们能够更深入地理解免疫系统的功能，并为生物医学研究提供有力工具。
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第一节 免疫标记技术的基本概念
一、免疫标记与标记免疫的概念 二、常用的免疫标记物质
免疫标记与标记免疫
免疫标记技术： 标记物与免疫活性物质的联接技术
标记免疫技术： 以标记免疫物质检测相应靶物质的技术
常用的免疫标记物质
类别
标记物
荧光素
FITC、RB200、TRITC
镧系元素螯合物
放射性核素 3H、14C、32P、57Gr
125I、131I
酶
HRP、AP
化学发光物 Luminol、lucigenin 金属颗粒 胶体金、铁蛋白
用途 免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定
免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定 免疫组化 免疫分析测定
第二节 酶标记技术
一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与鉴定
常用标记方法
1、常用酶 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP）
第一节 标记免疫技术的分类
一、按指示标记物质划分的类型 二、按测定方式划分的类型 三、按测定用途划分的类型
按指示标记物质划分的类型
1、酶免疫技术 2、荧光免疫技术 3、放射免疫技术 4、发光免疫技术 5、金免疫技术
按测定方式划分的类型
1、均相型（homogenous） 2、非均相型（heterogeneous）
间接法
夹心法
竞争法
酶标仪
酶标仪
ELISA技术的操作注意要点
试剂器材 操作环节 合适工作浓度
第三节 荧光抗体技术
一、荧光抗体技术的原理与方法 二、荧光抗体技术的操作注意要点
荧光抗体技术的原理与方法
直接法 间接法 补体法 双标记法
直接法 补体法
间接法 双标记法
荧光抗体技术的操作注意要点
1、具有与蛋白质共价结合的能力 2、荧光效率高 3、能与背景物质形成鲜明对比 4、不影响蛋白质的生物、免疫活性 5、标记方法安全、简便 6、标记物稳定，易保存
FITC的标记原理与方法
荧光素-N=C=S + NH2-抗体
荧光素-N-C-N-抗体 HSH
RB200的标记原理与方法
荧光素-SO3Na + PCl5
戊二醛交联法（二步法）
COH-（CH2）3-COH + NH2-酶 抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
过碘酸盐氧化法
O O
NaIO4
酶-五炭糖环
O O
O
O
+ NH2抗体
O NaBH4 O
OH N
O
抗体
Schiff碱
荧光素-SO2 Cl + PCl3 + NaCl
荧光素-SO2 Cl + NH2-抗体
荧光素-SO2 -NH-抗体 + HCl
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离荧光素 方法：柱层析
2、鉴定 抗体活性 标记物结合度 F/P比值的应用意义
第四节 放射性核素标记技术
一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与纯化
均相型（homogenous） 非均相型（heterogeneous）
双标记均相荧光免疫测定
酶扩大免疫测定技术
按测定用途划分的类型
1、免疫测定技术 2、免疫组化技术
第二节 酶联免疫吸附试验
一、ELISA技术的原理与方法 二、 ELISA技术的操作注意要点
ELISA技术的原理与方法
间接法 夹心法 竞争法
2、标记方法 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法
戊二醛交联法 (一步法）
抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶 抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体 酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
H O O=C-C-CH2
CH2
O
H-C-C-O-N-C-CH2
H O O=C-C-CH2
间接法（连接法）
OH
125I
+ NH2-蛋白质
CH2
O
H-C-C-O-N-C-CH2
H O O=C-C-CH2
OH 125I
CH2 H-C-C-N-蛋白质
HO H
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离放射性核素 方法：柱层析高Βιβλιοθήκη 高特异性高
高
高
重复性
差
好
好
检测对象 Ag/Ab
Ag/Ab
Ag
本章小结
1、标记免疫技术的类型 2、ELISA技术的原理与方法 3、荧光抗体技术的原理与方法 4、RIA技术的原理与方法
思考题
1、如何区别均相型与非均相型的测定方式？ 2、ELISA分几种类型，各有哪些特点？ 3、适于标记的荧光素应符合哪些要求？
O O
N
抗体
H2O
O O
N
OH
OH
抗体
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析
2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度
第三节 荧光标记技术
一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与纯化
常用标记方法
1、荧光素的概念 2、生物标记荧光素的要求 3、常用荧光素标记原理与方法
生物标记荧光素的要求
标本处理 染色操作 结果观测
荧光显微镜
荧光显微镜使用原理
激发滤片（BG） 标本 吸收滤片（OG）
FITC吸收光峰值：490-495nm FITC发射光峰值：520-530nm
BG：325-500
OG：410-650
吸收滤片
激发滤片
荧光滤镜使用原理
第四节 放射免疫测定技术
一、放射免疫测定技术的原理与方法 二、放射免疫测定技术的操作注意要点
常用标记方法
1、常用放射性核素
2、125I 的标记方法 直接法（氯胺T法） 间接法（连接法）
直接法（氯胺T法）
-NHCHONH-
CH2
氯胺T
Na125I
4。C
OH
-NHCHONHCH2
125I OH
间接法（连接法）
OH NSHPP
氯胺T
OH 125I
+ Na125I
CH2
O
H-C-C-O-N-C-CH2
结合相
游离相
放射免疫分析法的原理与方法
结 合、40 游 离 相 30 放 射 性 20 含 量 比 10 值
1
2
5 10 20 50 100
未标记抗原含量
β液闪仪
γ计数器
放射免疫测定技术的操作注意要点
反应的温度与时间 结合相与游离相的分离
免疫标记技术的比较
FIA
ELISA
RIA
敏感性
较低
2、鉴定 游离放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）应用意义
本章小结
1、免疫标记技术的概念 2、常用免疫标记物质及其标记方法 3、标记免疫物质的分离与鉴定
思考题
1、何谓免疫标记技术？ 2、常用的免疫标记物质有哪些？ 3、酶标记的主要方法有哪些？ 4、F/P比值的实用意义如何？ 5、何谓比放射性？有何意义？
一、免疫标记与标记免疫的概念 二、常用的免疫标记物质
免疫标记与标记免疫
免疫标记技术： 标记物与免疫活性物质的联接技术
标记免疫技术： 以标记免疫物质检测相应靶物质的技术
常用的免疫标记物质
类别
标记物
荧光素
FITC、RB200、TRITC
镧系元素螯合物
放射性核素 3H、14C、32P、57Gr
125I、131I
酶
HRP、AP
化学发光物 Luminol、lucigenin 金属颗粒 胶体金、铁蛋白
用途 免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定
免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定 免疫组化 免疫分析测定
第二节 酶标记技术
一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与鉴定
常用标记方法
1、常用酶 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP）
第一节 标记免疫技术的分类
一、按指示标记物质划分的类型 二、按测定方式划分的类型 三、按测定用途划分的类型
按指示标记物质划分的类型
1、酶免疫技术 2、荧光免疫技术 3、放射免疫技术 4、发光免疫技术 5、金免疫技术
按测定方式划分的类型
1、均相型（homogenous） 2、非均相型（heterogeneous）
间接法
夹心法
竞争法
酶标仪
酶标仪
ELISA技术的操作注意要点
试剂器材 操作环节 合适工作浓度
第三节 荧光抗体技术
一、荧光抗体技术的原理与方法 二、荧光抗体技术的操作注意要点
荧光抗体技术的原理与方法
直接法 间接法 补体法 双标记法
直接法 补体法
间接法 双标记法
荧光抗体技术的操作注意要点
1、具有与蛋白质共价结合的能力 2、荧光效率高 3、能与背景物质形成鲜明对比 4、不影响蛋白质的生物、免疫活性 5、标记方法安全、简便 6、标记物稳定，易保存
FITC的标记原理与方法
荧光素-N=C=S + NH2-抗体
荧光素-N-C-N-抗体 HSH
RB200的标记原理与方法
荧光素-SO3Na + PCl5
戊二醛交联法（二步法）
COH-（CH2）3-COH + NH2-酶 抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
过碘酸盐氧化法
O O
NaIO4
酶-五炭糖环
O O
O
O
+ NH2抗体
O NaBH4 O
OH N
O
抗体
Schiff碱
荧光素-SO2 Cl + PCl3 + NaCl
荧光素-SO2 Cl + NH2-抗体
荧光素-SO2 -NH-抗体 + HCl
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离荧光素 方法：柱层析
2、鉴定 抗体活性 标记物结合度 F/P比值的应用意义
第四节 放射性核素标记技术
一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与纯化
均相型（homogenous） 非均相型（heterogeneous）
双标记均相荧光免疫测定
酶扩大免疫测定技术
按测定用途划分的类型
1、免疫测定技术 2、免疫组化技术
第二节 酶联免疫吸附试验
一、ELISA技术的原理与方法 二、 ELISA技术的操作注意要点
ELISA技术的原理与方法
间接法 夹心法 竞争法
2、标记方法 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法
戊二醛交联法 (一步法）
抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶 抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体 酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
H O O=C-C-CH2
CH2
O
H-C-C-O-N-C-CH2
H O O=C-C-CH2
间接法（连接法）
OH
125I
+ NH2-蛋白质
CH2
O
H-C-C-O-N-C-CH2
H O O=C-C-CH2
OH 125I
CH2 H-C-C-N-蛋白质
HO H
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离放射性核素 方法：柱层析高Βιβλιοθήκη 高特异性高
高
高
重复性
差
好
好
检测对象 Ag/Ab
Ag/Ab
Ag
本章小结
1、标记免疫技术的类型 2、ELISA技术的原理与方法 3、荧光抗体技术的原理与方法 4、RIA技术的原理与方法
思考题
1、如何区别均相型与非均相型的测定方式？ 2、ELISA分几种类型，各有哪些特点？ 3、适于标记的荧光素应符合哪些要求？
O O
N
抗体
H2O
O O
N
OH
OH
抗体
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析
2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度
第三节 荧光标记技术
一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与纯化
常用标记方法
1、荧光素的概念 2、生物标记荧光素的要求 3、常用荧光素标记原理与方法
生物标记荧光素的要求
标本处理 染色操作 结果观测
荧光显微镜
荧光显微镜使用原理
激发滤片（BG） 标本 吸收滤片（OG）
FITC吸收光峰值：490-495nm FITC发射光峰值：520-530nm
BG：325-500
OG：410-650
吸收滤片
激发滤片
荧光滤镜使用原理
第四节 放射免疫测定技术
一、放射免疫测定技术的原理与方法 二、放射免疫测定技术的操作注意要点
常用标记方法
1、常用放射性核素
2、125I 的标记方法 直接法（氯胺T法） 间接法（连接法）
直接法（氯胺T法）
-NHCHONH-
CH2
氯胺T
Na125I
4。C
OH
-NHCHONHCH2
125I OH
间接法（连接法）
OH NSHPP
氯胺T
OH 125I
+ Na125I
CH2
O
H-C-C-O-N-C-CH2
结合相
游离相
放射免疫分析法的原理与方法
结 合、40 游 离 相 30 放 射 性 20 含 量 比 10 值
1
2
5 10 20 50 100
未标记抗原含量
β液闪仪
γ计数器
放射免疫测定技术的操作注意要点
反应的温度与时间 结合相与游离相的分离
免疫标记技术的比较
FIA
ELISA
RIA
敏感性
较低
2、鉴定 游离放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）应用意义
本章小结
1、免疫标记技术的概念 2、常用免疫标记物质及其标记方法 3、标记免疫物质的分离与鉴定
思考题
1、何谓免疫标记技术？ 2、常用的免疫标记物质有哪些？ 3、酶标记的主要方法有哪些？ 4、F/P比值的实用意义如何？ 5、何谓比放射性？有何意义？