基因工程工程菌构建ppt
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基因工程菌的构建过程
基因工程菌的构建过程
一、基因工程菌的构建过程
1.克隆
克隆技术是将目标基因从一种物种转移到另一种物种中的过程。
它由两个步骤组成：（1）将目标基因扩增到一种可以被容易地检测和分离的质粒中；（2）将扩增的基因质粒尽可能多地植入宿主细胞中，使宿主细胞拥有一个新的基因，为后续基因工程提供条件。
2.启动子定向突变
基因工程菌的定向突变是指在基因的启动子序列中引入突变，以改变其对基因表达的影响。
典型的定向突变包括插入、缺失或点突变，等等。
这些突变可以增强基因的表达，也可以减弱基因的表达，从而改变它的生物功能。
3.基因敲除
基因敲除技术是一种遗传改造技术，它是指将一个或多个基因从宿主的基因组中消除，以减少或完全抑制受体基因的表达。
基因敲除技术与基因表达调控技术一起衍生出了各种类型的基因工程菌，为基因研究提供了新的思路。
4.基因重组
基因重组技术是指在宿主细胞中重新连接两个不同的基因，以产生拥有新的功能的基因组。
通过基因重组，可以将一个基因的多个功能分解成多个更小的基因，从而丰富和改变生物的功能。
5.基因融合
基因融合技术是一种合成生物技术，它是把两个以上的基因连接在一起，形成一个新的基因，以改变基因组或改变其表达特征。
基因融合技术是基因工程的重要技术，能够改变宿主的生物功能，改变这种宿主的表达特征。
生化工程-基因工程菌培养
生物制药的挑战
基因工程菌在生产过程中可能产生变异或逃逸，对环境和人体健康造成潜在威胁。因此，需要加强安全 监管和风险评估。
生物农药
生物农药
基因工程菌可用于生产生物农药，如杀虫剂、杀菌剂等。通过基因工程技术改良微生物， 使其产生具有杀虫、杀菌作用的代谢产物，实现对病虫害的有效防治。
生物农药的优势
生物农药具有环保、安全、可持续等优点，能够减少化学农药的使用，降低对环境的污 染和对人体的危害。
生物农药的挑战
生物农药的作用机制和效果可能受到环境因素的影响，如温度、湿度等，因此在实际应 用中需要加强效果评估和监测。
生物肥料
生物肥料
基因工程菌可用于生产生物肥料，通过改良微生物的代谢 途径，使其产生具有营养价值的代谢产物，如氮、磷、钾 等矿物质元素，为植物提供养分。
生物肥料的优势
生物肥料具有环保、安全、高效等优点，能够提高土壤肥 力和植物生长效率，减少化肥的使用和环境污染。
3
加强下游处理技术的研究
针对基因工程菌产生的难分离纯化的产物，未来 将加强下游处理技术的研究，提高产物的纯度和 收率。
感谢您的观看
THANKS
基因工程菌能够高效降解有毒有 害物质或重金属离子，降低对环 境的污染和对生态系统的破坏。
生物环保的挑战
基因工程菌在降解过程中可能产 生变异或逃逸，对环境和人体健 康造成潜在威胁。因此，需要加 强安全监管和风险评估。
04
基因工程菌培养的挑战与前 景
基因工程菌培养的挑战
பைடு நூலகம்
基因工程菌种稳定性问题
培养基优化需求
基因表达技术
基因表达技术是指将重组后的目的基因导入宿主细胞中，并在宿主细胞中进行表达，产生相应的蛋白 质或代谢产物。
基因工程菌在生产过程中可能产生变异或逃逸，对环境和人体健康造成潜在威胁。因此，需要加强安全 监管和风险评估。
生物农药
生物农药
基因工程菌可用于生产生物农药，如杀虫剂、杀菌剂等。通过基因工程技术改良微生物， 使其产生具有杀虫、杀菌作用的代谢产物，实现对病虫害的有效防治。
生物农药的优势
生物农药具有环保、安全、可持续等优点，能够减少化学农药的使用，降低对环境的污 染和对人体的危害。
生物农药的挑战
生物农药的作用机制和效果可能受到环境因素的影响，如温度、湿度等，因此在实际应 用中需要加强效果评估和监测。
生物肥料
生物肥料
基因工程菌可用于生产生物肥料，通过改良微生物的代谢 途径，使其产生具有营养价值的代谢产物，如氮、磷、钾 等矿物质元素，为植物提供养分。
生物肥料的优势
生物肥料具有环保、安全、高效等优点，能够提高土壤肥 力和植物生长效率，减少化肥的使用和环境污染。
3
加强下游处理技术的研究
针对基因工程菌产生的难分离纯化的产物，未来 将加强下游处理技术的研究，提高产物的纯度和 收率。
感谢您的观看
THANKS
基因工程菌能够高效降解有毒有 害物质或重金属离子，降低对环 境的污染和对生态系统的破坏。
生物环保的挑战
基因工程菌在降解过程中可能产 生变异或逃逸，对环境和人体健 康造成潜在威胁。因此，需要加 强安全监管和风险评估。
04
基因工程菌培养的挑战与前 景
基因工程菌培养的挑战
பைடு நூலகம்
基因工程菌种稳定性问题
培养基优化需求
基因表达技术
基因表达技术是指将重组后的目的基因导入宿主细胞中，并在宿主细胞中进行表达，产生相应的蛋白 质或代谢产物。
基因工程工程菌构建.ppt
1，3-丙二醇用途
• 可直接用于防冻剂，是多种增塑剂、洗涤剂、防 腐剂和乳化剂的合成原料；也广泛应用于食品、 化妆品和制药等行业14j。
• 1，3．丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯PTT 的原料。PTT纤维克服了PET纤从而引起纤维材 料界的瞩目，可用于生产地毯、短丝及长丝产品， 产薄膜、非织造布和单丝，用作热塑性工程塑料
1，3-丙二醇基因工程菌构建的预期目标
• 本研究首先利用PCR方法从大肠杆菌中克 隆1．16 kb的1，3．丙二醇氧化还原酶同 工酶的编码基因yqhD2．80kb来源于克雷 伯氏杆菌甘油脱水酶的编码基因dhaB构建 了重组菌 i JM109(pEtac—dhaB—tacyqhD) 构建重组载体pUC．tac．dhaT，并 在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac． dhaB．tac-yqhD和pUC．tac-dhaT，研究 为提高1，3．丙二醇产量提供了新途径。
6000 r／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液 。
（7)加入750此漂洗液于离心吸附柱中，静置1 min后，6000r／min离心30s。倒掉废液收集管 中的废液。重复一次。倒掉废液后。再次于6000 r／min离心2min，尽量除去漂洗缓冲液。 (8)小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1 ．5 mLEppendorf离心管中，加入适量洗脱缓冲 液，常规50此，室温放置2．5min后，6000 r／ min离心2min。 (9)取5“L酶切后电泳鉴定。
（一）、质粒DNA的提取
(1)接重组大肠杆菌一环于LB培养基中，振荡培 养过夜。
(2)取1．5mL菌液于Eppendorf管中，6000r／ min离心5 min。 (3)弃去上清，加入溶液I 100“L重悬菌体。 (4)加入溶液II 150“L，轻柔混匀。 (5)加入溶液III 150此，倒转混匀，8000 r／min ，离心10min。 (6)将420¨L结合缓冲液加入离心吸附柱中，然 后将步骤5中的上清加入离心吸附柱中混匀，
基因工程工程菌构建
实例二：某工程菌的应用效果
应用领域
01
用于生产某种药物或工业酶。
应用效果
02
通过工程菌的构建和优化，实现了目标产物的高效表达和纯化
，降低了生产成本，提高了产品质量和产量。
经济效益
03
工程菌的应用为企业带来了显著的经济效益，推动了相关产业
的发展。
实例三：某工程菌的改进与优化
改进目标
提高工程菌的生长速度、产物表达量或产物纯度等。
基因工程工程菌构建
汇报人：XX
目 录
• 引言 • 基因工程原理与技术 • 工程菌构建流程 • 工程菌构建实例分析 • 工程菌构建的挑战与解决方案 • 工程菌在生物医药领域的应用前景
01
引言
基因工程概述
基因工程定义
基因工程是通过对生物体基因进行改造和重组， 以实现特定目标的方法和技术。
常用技术
包括基因克隆、基因编辑、基因转移等。
抗体药物研发
通过基因工程技术改造工程菌，实现抗体药物的高效表达和纯化。
疫苗研发与生产
利用工程菌生产疫苗，如基因工程疫苗、重组亚单位疫苗等，提高 疫苗的安全性和有效性。
基因治疗与细胞治疗
基因治疗载体
工程菌可作为基因治疗的载体，将治疗基因导入患者体内 ，修复或替换缺陷基因。
细胞治疗辅助工具
利用工程菌生产细胞治疗所需的生长因子、细胞因子等， 促进细胞生长和分化。
通过代谢工程手段，改造工程菌的代 谢途径，提高其对底物的利用效率和 产物合成能力。
提高遗传稳定性
采用合适的基因整合方法，确保外源 基因在工程菌中的稳定遗传和表达。
03
工程菌构建流程
目标基因的选择与获取
选择目标基因
第十一章 基因工程菌与固定化细胞
二）影响质粒稳定的因素
工程菌的稳定与否，取决于重组质粒本身的分子 组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件3个方面
1、与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳
定性的影响
例如： 质粒pSC101的Hind II片段有复制功能，并证明该片段上 还含有与质粒稳定性有关的序列 （0～0.27kb间； 被称为 分配定子 par ）
缺失有3种情况：
A）缺失发生在质粒复制起始区及选择性标记以外 往往使工程菌仍带有选择性标记但不能正常表现目 的基因的表型 B）缺失发生在质粒的选择性标记区域
e.g. pVC102(amy+ NmR CmR ) → amy – NmR CmS
如果重组质粒只有单一的选择性标记，这种情况会 被误认为质粒丢失 C）缺失可能发生在质粒复制的起始区 这种情况会导致整个质粒丢失
Par座位的功能类似于真核细胞染色体上的着丝点，在细 胞分裂时促进质粒分配，从而使质粒能稳定地传给子代细胞。
质粒pAcyc18 4在无选择压力下培养100代时丢失质粒的细 胞占32%；而由pAcyc184构建的含par座位片段的质粒pPM31 在同样条件下未测得有丢失质粒的细胞 Par座位可使与其无关的par-质粒稳定传代。 如将par座位插入到pBR322-trp上可使其质粒稳定性提高3-30 倍。
2、常用的基因工程宿主
1）大肠杆菌
2）枯草芽孢杆菌
3）酿酒酵母
特点： 生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长， 遗传学及分子生物学背景十分清楚
三、工程菌构建过程简介
克隆 PCR 合成
etc.
启动子
选择性基因
目 的 基 因
复制子
重组质粒
受 体 菌 表达产物
1）目的基因的获得 2）载体的选择与准备
石油类污染物降解基因工程菌的构建及应用
基因工程菌的构建结构图
石油类污染物降解基因工程菌的构建的发展
人物 方法 优点 缺点
Chakrabayty
能够同时降解脂肪 在同一菌株中植入 烃、芳烃、萜和多 降解乙烷、辛烷和 环芳烃，且降解石 癸烷，降解二甲苯， 油的速度快、效率 降解萘和分解樟脑 高，在几个小时内 的4种假单胞菌的不 能降解完海上溢油 中2/3的烃类，而自 同质粒，由此得到 的工程菌 然菌种则需要用一 年多的时间 用染色体DNA转化 原生质球的方法， 构建了一株处理含 PTA废水的工程菌 LEY3 同时降解PTA、萘、 苯 甲酸、十六兢、 乙二醇和甲醇6种化 合物
研究工物技术工程治理环境污染的安全性怎样； 2. 如何将生物降解修复技术与物理化学处理方法组 成统一的技术体系； 3. 如何确定生物修复技术彻底降解污染物所需要的运 行周期 ； 4. 怎样保证微生物与污染物有良好的接触，使污染 物能被微生物迅速降解 ； 5. 是否可以建立有关生物修复技术应用的、统一的评 价程序和标准。
但受融合子的耐酸 性能改进 不大的 影响，与JD亲本菌 比较接近，只能在 pH为6－10的环境 中产生多糖。
李焕杰等
在实际的柴油脱硫 通过构建血红蛋白 试验中，工程菌的 基因表达质粒并电 生长速率较高且最 脱硫率为69.19%， 击导入德氏假单胞 大脱硫活性提高了 而原 始菌为 菌中，得到基因工 214倍 57.12%，两者相差 程菌 不明显。
但质粒容易丢 失或 转移， 遗传稳定性 差
李尔炀
但供体基因进入细 胞后随机整合到受 体染色体上，导致 各供体基因所获启 动子活性不同，由 此造成各基因之间 表达强度不同
人物
方法
优点
缺点
宋绍富等
融合子进行多次传 代 培养优选， 最 采用原生质体融合 终获得了9株遗传 技术 性状稳定和代谢多 糖性能优异的融合 菌。
第六讲基因工程48ppt课件
2、构造重组•DNA分子
以质粒作载体为例
• 用与提取目的基因相同 的限制酶切割质粒使之 出现一个切口，将目的 基因插入切口处，让目 的基因的黏性末端与切 口上的黏性末端互补配 对后，在连接酶的作用 下连接形成一个环形的 重组DNA分子。
提取质粒并用 限制酶切割
用连接酶将目的 基因和质粒连接
目的基因与质粒的连接
3、将目的基因导入受体细胞并扩增
基因工程中常用的受体细胞有大肠杆 菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物 细胞等。
转化是指外源DNA分子或片段被细菌 细胞吸收，并整合进细胞染色体的遗 传现象，若受体细胞是动/植物细胞， 通常称为转染。
导入受体细胞常用的方法是借鉴细菌 或者病毒侵染细胞的途径。通常还要 对一些受体细胞进行增大通透性的处 理。（氯化钙或高压电脉冲打孔）
先将细胞核内的基因组转录为RNA，以信使RNA（mRNA） 为模板，在逆转录酶的作用下根据碱基互补原则人工合成一段 与之互补的DNA片段，再以此单链DNA为模版，人工合成另 外一条互补的DNA子链，从而获得所需的目的基因。
mRNA→单链DNA→ 双链DNA（cDNA）
DNA合成仪
（3）聚合酶链式反应（PCR） （如目的基因的核酸顺序已知）
在植物转基因中多采用农杆菌作为目的基因受体，再利用 重组农杆菌感染植物细胞进行转化，将目的基因整合到植 物基因中。
（7）转基因动物
转基因动物主要用于生产器官移植的研究，生产对人类有价 值的产品，使动物具有某些可遗传的抗性对付某些疾病与不 良环境，目前出于对安全性考虑，禁止将转基因动物进入食 品。 目前将人的某些基因转入动物，生产某些蛋白类药物已经广 泛实施。一般动物转基因多采用受精卵注射法，将目的基因 直接注射入动物的受精卵中，有一部分生产出的动物细胞内 含有这些目的基因。还有胚胎干细胞法，将目的基因转化胚 胎干细胞，再进行胚发育，一旦成为生殖细胞，可获得稳定 的遗传。
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• 化学性质：高温下与羧酸缩合成酯，与异氰酸盐 及酸性氯化物生成聚氨酯。1。3一丙二醇最重 要的性质就是与二酸反应生成聚酯和聚氨酯。
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1，3-丙二醇用途
• 可直接用于防冻剂，是多种增塑剂、洗涤剂、防 腐剂和乳化剂的合成原料；也广泛应用于食品、 化妆品和制药等行业14j。
• 1，3．丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯PTT 的原料。PTT纤维克服了PET纤从而引起纤维材 料界的瞩目，可用于生产地毯、短丝及长丝产品， 产薄膜、非织造布和单丝，用作热塑性工程塑料
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1，3-丙二醇基因工程菌构建的预期目标
• 本研究首先利用PCR方法从大肠杆菌中克 隆1．16 kb的1，3．丙二醇氧化还原酶同 工酶的编码基因yqhD2．80kb来源于克雷 伯氏杆菌甘油脱水酶的编码基因dhaB构建 了重组菌 i JM109(pEtac—dhaB—tacyqhD) 构建重组载体pUC．tac．dhaT，并 在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac． dhaB．tac-yqhD和pUC．tac-dhaT，研究 为提高1，3．丙二醇产量提供了新途径。
-
(二)、大肠杆菌感受态细胞的制备
(1)接种EcoliJM109于LB培养基中振荡培养过 夜。 (2)取0．5mL培养液于50mLLB培养基中37℃ 振荡培养至OD值O．3—0．4。 (3)菌液三角瓶放入冰水中，轻轻摇晃，使菌 液迅速冷却约10分钟。 (4)分装菌液到Eppendorf管(1．5mL)中， Eppendorf管迅速放入冰水中静置15min。 (5)8000r／min离心5min，然后静置2min，冰 水中迅速弃上清，加入-预冷的Ca组大肠杆菌一环于LB培养基中，振荡培 养过夜。 (2)取1．5mL菌液于Eppendorf管中，6000r／ min离心5 min。 (3)弃去上清，加入溶液I 100“L重悬菌体。 (4)加入溶液II 150“L，轻柔混匀。 (5)加入溶液III 150此，倒转混匀，8000 r／min ，离心10min。 (6)将420¨L结合缓冲液加入离心吸附柱中，然 后将步骤5中的上清加入- 离心吸附柱中混匀，
(3)在摇瓶水平，对已构建的- 产1，3．丙二醇重组菌
1，3．丙二醇生物合成途径
l，3一丙二醇是一种典型的甘油发酵产物,并 未发现其可由其他有机底物厌氧转化而来。甘 油作为唯一碳源和能源，它可以沿着氧化和还 原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类 发酵产物一致，并产牛供细胞牛长所必需的 ATP，在某些产物形成的同时释放还原力NADH ；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力， 生成1，3一丙二醇 。
-
1，3-丙二醇基因工程菌构建的路线
(1)串联表达来源于克雷伯氏菌(Klebsiella)编码油脱 水酶的基因dhaB以及来源于大肠杆菌(编码1，3 一丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD，构建
重组菌E coliJMl09(pEtac．dhaB．tac-yqhD);考 察其转化甘油的能力。
(2)利用PCR扩增来源于克雷伯氏茵的1，3一丙二醇 氧化还原酶dhaT，构建重组载体pUC．tac一砌口 T，并在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac— dhaB—tac-yqhD和pUC—tac-dhaT。
周期长和转化率低等问题，目前仅有化学
合成法应用于工业生产。因此，利用基因
工程技术构建高产菌株备被认为是今后的
发展方向。
-
1，3-丙二醇性质
• 物理性质：1，3．丙二醇(1，3-propanediol，l， 3-PD)是一种无色无味透明的液体，易溶于水、 乙醇、醚类和甲酰胺，微溶于氯仿和苯【3j，相 对密度为1．053 g／cm3，熔点．27℃，沸点 211℃，自燃温度为400℃。
-
（四）、大肠杆菌JMl09基因工程菌的构建
首先将来源于大肠杆菌的基因片段yqhD 连入载体pEtac上，得到重组质粒pEtacyqhD，经酶切，得到片段tac-yqhD连入载体 pUCl9，得到重组质粒pUC．tac-yqhD，将来 源于克雷伯氏菌的基因片段dhaB连入载体 pUC．tac-yqhD，以得到的重组质粒 pUC．dhaB．tac-yqhD。将重组表达载体酶 切连接到pEtac上，得到双启动子重组表达大 肠杆菌JM 109(pEtac—- dhaB-tac-yqhD)。
轻轻吹吸悬浮菌体，冰水中放置30min。 （6)重复步骤(5)两次。
(7)8000r／min离心5min，然后静置2min， 冰水中迅速弃上清，加入预冷的CaCl280uL 。 也可加40 uL50％的甘油保存代用。
-
（三）、转化大肠杆菌
(1)取出感受态细胞，在冰水中融化。 (2)加入待转化的DNA，用吸头轻柔混合，不可 用漩涡混合仪。 (3)冰水浴40min。 (4)42℃热激90s。 (5)加入1mL LB培养基，37℃震荡培养1．2 h。 (6)涂布含有相应抗生素的LB平板。
6000 r／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液 。 （7)加入750此漂洗液于离心吸附柱中，静置1 min后，6000r／min离心30s。倒掉废液收集管中 的废液。重复一次。倒掉废液后。再次于6000 r ／min离心2min，尽量除去漂洗缓冲液。 (8)小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1 ．5 mLEppendorf离心管中，加入适量洗脱缓冲 液，常规50此，室温放置2．5min后，6000 r／ min离心2min。 (9)取5“L酶切后电泳鉴定。
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一、大肠杆菌JMl09的构建及其表达
-
材料
1，菌株、质粒及基因片断： 大肠杆菌JMl09，质粒pUCl9，pEtac由
本实保藏；yqhD和dhaB基因分别从大肠 杆菌和克雷伯氏菌中克隆得到。 2，主要试剂：
质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒化 试剂盒 ；工具酶、抗生素 ；丙烯酰胺、甲 叉双丙烯酰胺、
1，3-丙二醇新型基因工程菌的构建
生物技术1101班 李娟
-
1，3．丙二醇简介
1，3．丙二醇是目前国际上公认的六大
石化新产品之一，其主要功能是作为合成
聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1，3一丙
二醇的生产方法有化学合成法和微生物转
化法，但从自然界中筛选的微生物厌氧发
酵甘油生产l，3一丙二醇还存在产物生产
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1，3-丙二醇用途
• 可直接用于防冻剂，是多种增塑剂、洗涤剂、防 腐剂和乳化剂的合成原料；也广泛应用于食品、 化妆品和制药等行业14j。
• 1，3．丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯PTT 的原料。PTT纤维克服了PET纤从而引起纤维材 料界的瞩目，可用于生产地毯、短丝及长丝产品， 产薄膜、非织造布和单丝，用作热塑性工程塑料
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1，3-丙二醇基因工程菌构建的预期目标
• 本研究首先利用PCR方法从大肠杆菌中克 隆1．16 kb的1，3．丙二醇氧化还原酶同 工酶的编码基因yqhD2．80kb来源于克雷 伯氏杆菌甘油脱水酶的编码基因dhaB构建 了重组菌 i JM109(pEtac—dhaB—tacyqhD) 构建重组载体pUC．tac．dhaT，并 在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac． dhaB．tac-yqhD和pUC．tac-dhaT，研究 为提高1，3．丙二醇产量提供了新途径。
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(二)、大肠杆菌感受态细胞的制备
(1)接种EcoliJM109于LB培养基中振荡培养过 夜。 (2)取0．5mL培养液于50mLLB培养基中37℃ 振荡培养至OD值O．3—0．4。 (3)菌液三角瓶放入冰水中，轻轻摇晃，使菌 液迅速冷却约10分钟。 (4)分装菌液到Eppendorf管(1．5mL)中， Eppendorf管迅速放入冰水中静置15min。 (5)8000r／min离心5min，然后静置2min，冰 水中迅速弃上清，加入-预冷的Ca组大肠杆菌一环于LB培养基中，振荡培 养过夜。 (2)取1．5mL菌液于Eppendorf管中，6000r／ min离心5 min。 (3)弃去上清，加入溶液I 100“L重悬菌体。 (4)加入溶液II 150“L，轻柔混匀。 (5)加入溶液III 150此，倒转混匀，8000 r／min ，离心10min。 (6)将420¨L结合缓冲液加入离心吸附柱中，然 后将步骤5中的上清加入- 离心吸附柱中混匀，
(3)在摇瓶水平，对已构建的- 产1，3．丙二醇重组菌
1，3．丙二醇生物合成途径
l，3一丙二醇是一种典型的甘油发酵产物,并 未发现其可由其他有机底物厌氧转化而来。甘 油作为唯一碳源和能源，它可以沿着氧化和还 原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类 发酵产物一致，并产牛供细胞牛长所必需的 ATP，在某些产物形成的同时释放还原力NADH ；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力， 生成1，3一丙二醇 。
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1，3-丙二醇基因工程菌构建的路线
(1)串联表达来源于克雷伯氏菌(Klebsiella)编码油脱 水酶的基因dhaB以及来源于大肠杆菌(编码1，3 一丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD，构建
重组菌E coliJMl09(pEtac．dhaB．tac-yqhD);考 察其转化甘油的能力。
(2)利用PCR扩增来源于克雷伯氏茵的1，3一丙二醇 氧化还原酶dhaT，构建重组载体pUC．tac一砌口 T，并在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac— dhaB—tac-yqhD和pUC—tac-dhaT。
周期长和转化率低等问题，目前仅有化学
合成法应用于工业生产。因此，利用基因
工程技术构建高产菌株备被认为是今后的
发展方向。
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1，3-丙二醇性质
• 物理性质：1，3．丙二醇(1，3-propanediol，l， 3-PD)是一种无色无味透明的液体，易溶于水、 乙醇、醚类和甲酰胺，微溶于氯仿和苯【3j，相 对密度为1．053 g／cm3，熔点．27℃，沸点 211℃，自燃温度为400℃。
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（四）、大肠杆菌JMl09基因工程菌的构建
首先将来源于大肠杆菌的基因片段yqhD 连入载体pEtac上，得到重组质粒pEtacyqhD，经酶切，得到片段tac-yqhD连入载体 pUCl9，得到重组质粒pUC．tac-yqhD，将来 源于克雷伯氏菌的基因片段dhaB连入载体 pUC．tac-yqhD，以得到的重组质粒 pUC．dhaB．tac-yqhD。将重组表达载体酶 切连接到pEtac上，得到双启动子重组表达大 肠杆菌JM 109(pEtac—- dhaB-tac-yqhD)。
轻轻吹吸悬浮菌体，冰水中放置30min。 （6)重复步骤(5)两次。
(7)8000r／min离心5min，然后静置2min， 冰水中迅速弃上清，加入预冷的CaCl280uL 。 也可加40 uL50％的甘油保存代用。
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（三）、转化大肠杆菌
(1)取出感受态细胞，在冰水中融化。 (2)加入待转化的DNA，用吸头轻柔混合，不可 用漩涡混合仪。 (3)冰水浴40min。 (4)42℃热激90s。 (5)加入1mL LB培养基，37℃震荡培养1．2 h。 (6)涂布含有相应抗生素的LB平板。
6000 r／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液 。 （7)加入750此漂洗液于离心吸附柱中，静置1 min后，6000r／min离心30s。倒掉废液收集管中 的废液。重复一次。倒掉废液后。再次于6000 r ／min离心2min，尽量除去漂洗缓冲液。 (8)小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1 ．5 mLEppendorf离心管中，加入适量洗脱缓冲 液，常规50此，室温放置2．5min后，6000 r／ min离心2min。 (9)取5“L酶切后电泳鉴定。
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一、大肠杆菌JMl09的构建及其表达
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材料
1，菌株、质粒及基因片断： 大肠杆菌JMl09，质粒pUCl9，pEtac由
本实保藏；yqhD和dhaB基因分别从大肠 杆菌和克雷伯氏菌中克隆得到。 2，主要试剂：
质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒化 试剂盒 ；工具酶、抗生素 ；丙烯酰胺、甲 叉双丙烯酰胺、
1，3-丙二醇新型基因工程菌的构建
生物技术1101班 李娟
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1，3．丙二醇简介
1，3．丙二醇是目前国际上公认的六大
石化新产品之一，其主要功能是作为合成
聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1，3一丙
二醇的生产方法有化学合成法和微生物转
化法，但从自然界中筛选的微生物厌氧发
酵甘油生产l，3一丙二醇还存在产物生产