盐酸克伦特罗完全抗原的合成及其偶联工艺的优化

2009 年 4 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Apr. 2009文章编号：1003-9015(2009)02-0355-05盐酸克伦特罗完全抗原的合成及其偶联工艺的优化杨香瑜, 黄鹤(天津大学化工学院生物化工系系统生物工程教育部重点实验室, 天津 300072)摘要：为获取用于快速免疫分析的免疫抗原和包被抗原，本实验采用重氮化反应制备盐酸克伦特罗(Clenbuterolhydrochloride, CL)完全抗原，在强酸条件下CL先经重氮化，再与鸡卵清白蛋白(OV A)发生共价取代制备了盐酸克伦特罗包被抗原(OV A-CL)，并以正交实验确定了共价取代反应的关键影响因素，进一步采用单因素实验确定了反应所需的最佳条件，并通过紫外扫描对制得的包被抗原进行了鉴定。

结果表明，投料比例是盐酸克伦特罗完全抗原合成的关键因素，搅拌转速和反应时间也起着至关重要的作用。

而且偶联反应在1 h内基本完成，延长反应时间对提高产物偶联比影响不大。

当投料比例为30:1，pH值约为8，低速搅拌状况下，包被抗原和免疫抗原的偶联比分别高达29:1和48:1，盐酸克伦特罗完全抗原合成条件的优化筛选取得了预期的效果。

关键词：盐酸克伦特罗；重氮化反应；完全抗原；偶联比中图分类号：O625.14 文献标识码：ASynthesis of Clenbuterol Hydrochloride Complete Antigen and Optimization of itsConjugation ConditionsYANG Xiang-yu, HUANG He(Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, Department of Biochemical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)Abstract: In order to synthesize the immunogen and coatigen used for the rapid immunoassay, the diazotization was adopted to prepare the Clenbuterol hydrochloride (CL) complete antigen. During which, the CL was firstly activated under strongly acidic conditions, and the activated CL was then conjugated with ovalbumin (OV A) to form coatigen OV A-CL. The important factors affecting the conjugating reaction were determined by orthogonal experiments, and the optimum value of those important factors was confirmed by single factor experiments. The prepared OV A-CL was characterized by UV scan. It was found that the CL/OV A dropping proportion is the key factor for preparing the complete antigen, while the stirring speed and reaction time are important too. The conjugating reaction can be completed within one hour and prolonging the reaction time has little effect on the increase of coupling ratio. When the CL/OV A dropping proportion (molar ratio) is 30:1, the pH value is 8 and at a low stirring dispersion speed (<250 r⋅min−1), the coupling ratio of coatigen and immunogen can be up to 29:1 and 48:1, respectively. It indicates that the optimization of the conjugation conditions of Clenbuterol hydrochloride complete antigen achieves the expected results.Key words: Clenbuterol hydrochloride; diazotization; complete antigen; coupling ratio1前言盐酸克伦特罗是一种β2-肾上腺受体激动剂 [1]。

大量用其作为饲料添加剂，可显著提高畜禽生长速率，瘦肉相对增加[2]。

但该药易在牲畜体内沉积，人食用含有该药残留的动物产品后可引起食物中毒，严重收稿日期：2008-01-29；修订日期：2008-06-02。

基金项目：天津市自然科学基金资助项目(06YFJMJC13200)。

作者简介：杨香瑜(1983-)，女，河北省沧州人，天津大学硕士生。

通讯联系人：黄鹤，E-mail：huang@者导致死亡[3~5]。

为此，各国禁止盐酸克伦特罗用作牲畜的饲料添加剂。

在食品安全检测领域，盐酸克伦特罗传统的仪器分析方法由于操作复杂、技术水平要求高限制了其广泛应用。

而免疫分析技术因其操作简便快捷，特异性强，易于现场检测等优点，具有很大的实际应用价值[6]。

实现高质量免疫分析检测的技术关键在于获得特异性好，亲和性强的盐酸克伦特罗单克隆或多克隆抗体，而由于盐酸克伦特罗的分子量较小，不具有免疫原性，必须与大分子载体蛋白偶联后才能借助大分子的T 细胞表位刺激免疫动物机体产生抗体[7]。

因此必须制备出具有高偶联比，高免疫原性的完全抗原。

目前，已报道的盐酸克伦特罗完全抗原的合成主要采用重氮化反应(反应式如图1所示)，但是并没有形成一套系统成型的工艺，合成产物的偶联比均较低[8,9]。

本实验采用重氮化反应，运用正交试验确定了最佳实验条件，并进一步采用紫外光谱扫描加以验证，结果显示完全抗原的偶联比较以往文献报道有很大的提高，该实验工作为下一步免疫实验提供了可靠的免疫抗原，同时为同类化学物质的免疫分析检测技术奠定了基础。

2 实 验2.1 试剂与仪器试剂：盐酸克伦特罗(CL)(武汉远城科技有限公司)；鸡卵清白蛋白(OVA)(华生生物有限公司)；亚硝酸钠(国药集团化学试剂有限公司)；磷酸二氢钠(上海精化科技研究所)；磷酸氢二钠(上海精化科技研究所)；盐酸(天津市北方天医化学试剂厂)；氢氧化钠(天津市北方天医化学试剂厂)。

仪器：Sartoriµs 精密电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；UV-7502 PCS 紫外可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)；“NIGER” RCT-A 磁力搅拌器(杭州利加电器有限公司)；“雷磁”PHS-25数显pH 计(上海精密科学仪器有限公司)；Aqµapro 艾科浦微量有机分析专用超纯水机(重庆颐洋企业发展有限公司)；透析袋(10000)及其他常用玻璃仪器。

2.2 实验方法2.2.1 盐酸克伦特罗的活化取3 mg CL ，加入1 mL 1 mol ⋅L −1 HCL 和500 μL 蒸馏水于反应烧杯中，同时调节pH 约等于0.5，然后在4℃下往其中连续缓慢加入60 μL 0.2 mol ⋅L −1NaNO 2, 4℃低速搅拌1 h 。

2.2.2 盐酸克伦特罗与蛋白质的偶联按表1完成正交实验，将不同质量的OVA 溶于磷酸盐缓冲液中。

边搅拌边将活化的CL 缓慢加入其中，滴加过程中用1 mol ⋅L −1 NaOH 调节各pH 值维持恒定,滴加完成后，将反应体系置于4℃下，调节转速进行反应，按规定时间结束实验，将偶联反应后的反应液于4℃下，0.01 mol ⋅L −1 pH=7的磷酸盐缓冲液中透析3 d ，转入容器中静止4 h 后离心，取上清液适当稀释后进行紫外图谱扫描，结果不再发生变化，证明反应液透析完全。

2.2.3 偶联物的鉴定配置适当浓度的CL 溶液(0.25 mg ⋅mL −1)和载体蛋白溶液(0.5 mg ⋅mL −1)，分别对CL 、载体蛋白和偶联物溶液进行紫外扫描，根据紫外吸收图谱的变化可定性确定CL 和OVA 是否已经偶联成功。

H 3CC NHCH 3CH 3CH 2CH OHClNH 2ClNaNO 2HClH 3CC NHCH 3CH 3CH 2CH OHClNClNClProteinH 3CC NHCH 3CH 3CH 2CH OHClNClNProtein图1 完全抗原合成的反应式Fig.1 The reaction formula for synthesis of complete antigen表1 正交实验表L 16(44)设计Table 1 Orthogonal L 16(44)design of the testLevelsDropping proportion (molar ratio) pHStirring dispersion speed / r ⋅min −1 Reaction time/ hⅠ 20:1 7 0 0 Ⅱ 30:1 7.5150 1 Ⅲ 40:1 8 300 7 Ⅳ 50:1 8.5600 10第23卷第2期 杨香瑜等： 盐酸克伦特罗完全抗原的合成及其偶联工艺的优化 3572.2.4 偶联比例的计算将偶联物稀释10倍后，测其280 nm 和260 nm 波长下的分光光度值，按如下公式C protein (mg ⋅mL −1) =(1.45OD 280 nm −0.74 OD 260 nm )×10[10]，计算偶联产物中蛋白质浓度。

假设产物的偶联比例为n ，以偶联物溶液中1分子蛋白为基准，根据光路叠加原理：OD 280 CL +OD 280O VA =OD 280OVA-CL ，并由朗伯-比尔定律OD =εCL (ε为摩尔吸光系数，OD 为吸光值，C 为物质量浓度，L 为光程)，将该定律公式代入上式中可得，ε280 CL nC protein (摩尔浓度)L +ε280 OVA C protein L =ε280 OVA-CL C protein L ，即ε280 CL n +ε280 OVA =ε280 OVA-CL ，根据测出的CL 和OVA 的OD 280 nm 计算各自的摩尔吸光系数，而ε280 OVA-CL =OD 280 OVA-CL /[C protein /(45000+n ×313.7)]，通过以上几式，可确定偶联比例n =280OVA CL protein 280OVA protein 280CL CL 280OVA CL protein45000313.7OD C OD C OD C OD C −−−×− ////3 结果与讨论3.1 偶联产物的鉴定偶联产物的紫外图谱扫描如图2所示，CL 在296nm 处有最高吸收峰，在310 nm 附近存在一个肩峰，OVA 最高吸收峰在279 nm 处，两者在325 nm 之后吸光强度都很弱，而偶联后的完全抗原的最高吸收峰移到269 nm 处，原来CL 的296 nm 处吸收峰已经消失，但是可能由于重氮化反应过程中存在副反应产生了其他物质致使偶联后产物在325 nm 后仍有较高的吸收值。