配合饲料中维生素E含量的测定
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VE 的分离结果见图 1 和图 2。 由 图 1 和 图 2 可以看出， 色谱峰分离效果较好， 保留时间在 15.7min 左右。 2.2 定量测定
本试验采用单点比较法， 按上述色谱条件将 50mg/L 的标准工作溶液进样 20μL， 得到色谱峰面 积响应值，用外标法定量测定。 在本实验条件下，按 信噪比 S/N=3 为 检 出 限 （LOD），S/N=10 为 定 量 限 （LOQ），求得配合饲料中 VE 检出限为 0.6mg/kg，定 量限为 2.0 mg/kg，满足大部分配合饲料中维生素 E 测定灵敏度要求。 2.3 方法的回收率和精密度
回 收 率/%
平 均 回 收 率/%
38
99.89、102.32
76
99.24、103.99
100.8
190
102.76、96.6
由 表 1 可 知 ， 虾 饲 料 中 添 加 VE 的 回 收 率 为 96.6%～103.99%。
另外称取南美白对虾饲料 2g，共 6 份，采用本 试验方法进行测定，由表 2 可知样品检测结果的变 异系数 CV 为 4.08%。
结果显示， 加入 10mL 氢氧化钾溶液（500g/L） 足够皂化完全维生素 E 乙酸酯。 因此，样品选择加 入氢氧化钾溶液（500g/L）的量为 10mL。
表 4 氢氧化钾溶液体积的选择
体 积 数 （mL ）
5 7.5 10 12.5 15
维生素 E 含量（mg/kg） 133 164 180 179 177
将乙醚提取液经过无水硫酸钠（约 10g）滤入与 旋转蒸发器配套的 100mL 球形（已加入100mgBHT） 蒸发瓶内，用约 10mL 乙醚冲洗分液漏斗及无水硫 酸钠 2 次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器 上，于 55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中蒸 干 乙 醚 ， 残 渣 用 10mL 甲 醇 溶 解 。 取 适 量 溶 液 过 0.45μm 滤膜，滤液用于高效液相色谱分析。
表 6 皂化反应时间的选择
皂 化 时 间 （h）
2
3
4
5
6
维生素 E 含量（mg/kg） 148 159 171 172 173
2.5.4 样品称样量的选择 分 别 称 取 不 同 质 量 的 样 品 按 试 样 制 备 1.3 步
骤处理，处理后进高效液相色谱完成检测，结果见 表 7。
当称样量为 1g 和 2g 时提取效率最高，考虑为 了减小称量误差，因此选择称样量为 2g。
４２
TESTING AND ANALYSIS 检测分析
漩涡振荡后，把液体倒入 250mL 分液漏斗中，剩下 固体再用 25mL 乙醚提取两次倒入分液漏斗中，轻 轻振摇分液漏斗 2min，静置分层，弃去水层。 每次 用约 100mL 水洗分液漏斗中的乙醚层，用 pH 试纸 检验直至水层不显碱性（最初水洗轻摇，逐次振摇 强度可增加）。 1.3.3 浓缩
含量 194 208 107
99 54 75 54
2.5 实验条件优化 2.5.1 氢氧化钾溶液体积的选择
分别将 5 份 2.00g 相同样品按上述步骤分别加 入 氢 氧 化 钾 溶 液 （500g/L）5mL、7.5mL、10mL、 12.5mL、15mL 提取，按上 述 检 测 方 法 检 测 ，检 测 结 果见表 4。
2 结果与讨论 2.1 色谱分离
称取维生素 E 乙酸酯标准品 10.0mg 于 150mL 带盖密封玻璃瓶中，按上述方法（1.3.1）皂化，最 后 用 50mL 甲 醇 溶 解 。 此 时 维 生 素 E 乙 酸 酯 浓 度 为
图 1 VE 标准样色谱图
200mg/L，再将上述 200mg/L 标准配制成 50mg/L 的 标准工作溶液。
国内外有关 VE 检测方法主要有分光光度法[1]、 荧光比色法[2]、气相色谱法[3]和液相色谱法 等 [4-8] 。 分 光光度法的检测灵敏度较低，干扰比较多，荧光比 色法操作比较繁琐， 气相色谱法需要使用衍生剂， 增加检测样本成本。 国标 GB/T 17812-2008《饲料 中维生素 E 的测定 高效液相色谱法》 方法检测饲 料中 VE 也是采用高效液相色谱法，但前处理无法
饲 料 广 角 ·４３
检测分析 TESTING AND ANALYSIS
208mg/kg、 107mg/kg、 99mg/kg、 54mg/kg、 75mg/kg、 54mg/kg。
表 3 配合饲料中维生素 E 含量
mg/kg
饲料 南美
草鱼配 罗非鱼 鸡 猪 肥鸭
石斑鱼
名称 白对虾
合饲料 饲料 饲料 饲料 饲料
４４
40 50 60 70 80
维生素 E 含量（mg/kg） 135 159 176 179 173
2.5.3 皂化反应时间的选择 分别将 5 份 2.00g 相同样品按上述步骤分别在
2h、3h、4h、5h、6h 的不同温度下皂化反应， 检测结 果见表 6。
维生素 E 乙酸酯皂化反应时间在 4h 后反应完 全，因此选取皂化反应时间为 4h。
2.5.2 皂化温度的选择 分别将 5 份 2.00g 相同样品按上述步骤每两份
分别在 40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的不同温度下皂 化反应，检测结果见表 5。
结果显示， 维生素 E 乙酸酯在 60℃皂化反应 趋于完全，因此样品皂化反应温度选择为 60℃。
表 5 皂化温度的选择
皂 化 温 度 （℃）
检测分析 TESTING AND ANALYSIS
配合饲料中维生素 Ｅ 含量的测定
杨 曦 王华朗 * 刘成模 黄智成
（广东恒兴饲料实业股份有限公司）
［中 图 分 类 号 ］S816.2
［文献标Hale Waihona Puke Baidu码］ A
［文 章 编 号 ］1002-8358 （2015 ）22-42-3
摘 要：建立了一种高效液相色谱检测配合饲料中维生 素 E（VE）含量的方法。 该方法 相 比 较 国 标 容 易 适 合 批 量 检 测样本， 灵敏度也比较高 ， 检 出 限 为 0.6mg/kg， 定 量 限 为 2mg/kg， 回 收 率 在 96.6%~103.99%之 间 ， 相 对 标 准 偏 差 为 4.08%，方 法 准 确 ，达 到 实 验 的 要 求 ，适 用 于 配 合 饲 料 中 维 生 素 E 的检测。
表 7 样品称样量的选择
样 品 质 量 （g）
0.5 1 2 5 8 10 12
维生素 E 含量（mg/kg） 172 181 181 180 177 178 157
3 结论 本实验建立了一种用高效液相色谱法检测配
合饲料中 VE 含量的方法。 样品通过皂化后经乙醚 提取，浓缩过滤后，用液相色谱检测。 结果表明，该 方法前处理简单，回收率稳定、灵敏、准确，达到分 析要求，适用于配合饲料中 VE 含量的分析。
称取已知含量南美白对虾饲料 2g， 共 6 份，分 别 加 入 50μg/mL 维 生 素 E 乙 酸 酯 1 520μL、 3 040μL、7 600μL，按照上述方式检测其含量，进行 回收率测定，平均回收率为 100.8%，结果见表 1。
表 1 虾饲料中 VE 回收率试验结果
添 加 浓 度 /（μg/g）
表 2 精密度结果
测定次数 1 2 3 4 5 6 平均值 CV（n=6，%）
含量（mg/kg） 190 189 200 186 207 192 194
4.08
图 2 水产饲料样品 VE 色谱图
2.4 实际样品中维生素 E 的分析 用本文方法对市场上不同种类配合饲料按 1.3
方法所述进行检测。 结果见表 3，南美白对虾、石斑 鱼、草鱼配合饲料、罗非鱼饲料、鸡饲料、猪饲料、肥 鸭饲料等饲料样品的 VE 的检出率分别是 194mg/kg、
作者简介：杨曦，工程师，研究方向为农产品质量安全 与检测。
* 通讯作者：王华朗，高级畜牧师，研究方向为动物营养 与饲料研究。
批量检测样本，本方法针对国标方法无法进行批处 理样品进行改进， 改进后的检测方法提高工作效 率，适合对大批量样品进行检测。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂
安捷伦 1260 Infinity 高效液相色谱仪，台式高 速冷冻离心机（德国 SIGMA），旋转蒸发仪（瑞士步 琪），分析天平（感量 0.0001g，德国赛多利斯），恒温 水浴锅（上海沪南科学仪器联营厂）。
参考文献 [1] 崔 云 龙 ， 李 民. 分 光 光 度 法 测 定 维 生 素 E ［J］. 临 床 检 验 杂 志 ， 1990（8）：14-16 . [2] 阚 健 全. 荧 光 法 快 速 测 定 食 品 中 的 维 生 素 E［J］.分 析 测 试 学 报 ， 1993（3）：51-54 . [3] 邵晓芬， 张韵慧. 脱臭馏出物中游离生育酚的气相色谱分析 ［J］. 分析试验室，1994（5）：61-62 . [4] 李东，顾鹏. 高效液相色谱法测定维生素 E 的研究进展［J］. 食品 科学，2000（6）：57-59 . [5] 王 安 群 ，邓 益 群 ，彭 凤 仙.HPLC 法 测 定 饲 料 中 维 生 素 A、维 生 素 D3 和维生素 E［J］.环境监测管理与技术，2005，17（2）:33-34. [6] 谢云峰、王浩、刘佟等.在线固相萃取-高效液相色谱联用测定动 物源食品中的维生素 A、E［J］.分析化学，2014，42（9）:1343-1347. [7] Xiuping Xue，Jinming You，Pingli He.Simultaneous determination of five fat -soluble vitamins in feed by high -performance liquid chromatography following solid -phase extraction ［J］.Joural of chromatographic science，2008，46:345-350. [8] H.Qian，M.Sheng. Simultaneous determination of fat-soluble vitamins A，D and E and pro-vitamin D in animal feeds by one-step extraction and high-performance liquid chromatography analysis ［J］. Journal of Chromatography A，1998，825:127-133
标 准 品 ：VE （dl-а- 生 育 酚 乙 酸 酯 ） 标 准 品 ： （Sigma-Aldrich 公司）含量≥99.0%。
试剂：甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水 为超纯水。 1.2 色谱条件
A 色谱柱 XTerra MS C18，4.6×150mm，5μm B 进样量 20μL，柱温 27℃，流速 1.0mL /min C 检测器：紫外检测器 280nm 1.3 试样制备 1.3.1 皂化 称 取 2g（精 确 至 0.0001g）试 样 于 150mL 带 盖 密封玻璃瓶中，加 50mL 抗坏血酸溶液（5g/L），使试 样完全分散，浸湿，加 10mL 氢氧化钾溶液（500g/L）， 混匀。 充入氮气以隔绝空气，摇匀，置于 60℃水浴上 皂化 4h。 皂化后立即放入冰水中冷却。 1.3.2 提取 向皂化液中加入 50mL 乙醚（不含过氧化物），
关键词：高效液相色谱；维生素 E；配合饲料
VE 具有抗氧化功能、 维持动物正常的繁殖机 能、 增强动物机体的免疫功能和抗应激功能等，对 动物具有重要的营养作用，也是配合饲料中不可缺 少的成分。 但是，由于脂溶性维生素不能经尿排出， 所以摄入过量脂溶性维生素易引起中毒，导致动物 代谢障碍和生长受阻。 因此，准确快速测定配合饲 料 中 VE 含 量 ，对 于 优 化 饲 料 配 方 、提 高 养 殖 效 率 具有十分重要的意义。
本试验采用单点比较法， 按上述色谱条件将 50mg/L 的标准工作溶液进样 20μL， 得到色谱峰面 积响应值，用外标法定量测定。 在本实验条件下，按 信噪比 S/N=3 为 检 出 限 （LOD），S/N=10 为 定 量 限 （LOQ），求得配合饲料中 VE 检出限为 0.6mg/kg，定 量限为 2.0 mg/kg，满足大部分配合饲料中维生素 E 测定灵敏度要求。 2.3 方法的回收率和精密度
回 收 率/%
平 均 回 收 率/%
38
99.89、102.32
76
99.24、103.99
100.8
190
102.76、96.6
由 表 1 可 知 ， 虾 饲 料 中 添 加 VE 的 回 收 率 为 96.6%～103.99%。
另外称取南美白对虾饲料 2g，共 6 份，采用本 试验方法进行测定，由表 2 可知样品检测结果的变 异系数 CV 为 4.08%。
结果显示， 加入 10mL 氢氧化钾溶液（500g/L） 足够皂化完全维生素 E 乙酸酯。 因此，样品选择加 入氢氧化钾溶液（500g/L）的量为 10mL。
表 4 氢氧化钾溶液体积的选择
体 积 数 （mL ）
5 7.5 10 12.5 15
维生素 E 含量（mg/kg） 133 164 180 179 177
将乙醚提取液经过无水硫酸钠（约 10g）滤入与 旋转蒸发器配套的 100mL 球形（已加入100mgBHT） 蒸发瓶内，用约 10mL 乙醚冲洗分液漏斗及无水硫 酸钠 2 次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器 上，于 55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中蒸 干 乙 醚 ， 残 渣 用 10mL 甲 醇 溶 解 。 取 适 量 溶 液 过 0.45μm 滤膜，滤液用于高效液相色谱分析。
表 6 皂化反应时间的选择
皂 化 时 间 （h）
2
3
4
5
6
维生素 E 含量（mg/kg） 148 159 171 172 173
2.5.4 样品称样量的选择 分 别 称 取 不 同 质 量 的 样 品 按 试 样 制 备 1.3 步
骤处理，处理后进高效液相色谱完成检测，结果见 表 7。
当称样量为 1g 和 2g 时提取效率最高，考虑为 了减小称量误差，因此选择称样量为 2g。
４２
TESTING AND ANALYSIS 检测分析
漩涡振荡后，把液体倒入 250mL 分液漏斗中，剩下 固体再用 25mL 乙醚提取两次倒入分液漏斗中，轻 轻振摇分液漏斗 2min，静置分层，弃去水层。 每次 用约 100mL 水洗分液漏斗中的乙醚层，用 pH 试纸 检验直至水层不显碱性（最初水洗轻摇，逐次振摇 强度可增加）。 1.3.3 浓缩
含量 194 208 107
99 54 75 54
2.5 实验条件优化 2.5.1 氢氧化钾溶液体积的选择
分别将 5 份 2.00g 相同样品按上述步骤分别加 入 氢 氧 化 钾 溶 液 （500g/L）5mL、7.5mL、10mL、 12.5mL、15mL 提取，按上 述 检 测 方 法 检 测 ，检 测 结 果见表 4。
2 结果与讨论 2.1 色谱分离
称取维生素 E 乙酸酯标准品 10.0mg 于 150mL 带盖密封玻璃瓶中，按上述方法（1.3.1）皂化，最 后 用 50mL 甲 醇 溶 解 。 此 时 维 生 素 E 乙 酸 酯 浓 度 为
图 1 VE 标准样色谱图
200mg/L，再将上述 200mg/L 标准配制成 50mg/L 的 标准工作溶液。
国内外有关 VE 检测方法主要有分光光度法[1]、 荧光比色法[2]、气相色谱法[3]和液相色谱法 等 [4-8] 。 分 光光度法的检测灵敏度较低，干扰比较多，荧光比 色法操作比较繁琐， 气相色谱法需要使用衍生剂， 增加检测样本成本。 国标 GB/T 17812-2008《饲料 中维生素 E 的测定 高效液相色谱法》 方法检测饲 料中 VE 也是采用高效液相色谱法，但前处理无法
饲 料 广 角 ·４３
检测分析 TESTING AND ANALYSIS
208mg/kg、 107mg/kg、 99mg/kg、 54mg/kg、 75mg/kg、 54mg/kg。
表 3 配合饲料中维生素 E 含量
mg/kg
饲料 南美
草鱼配 罗非鱼 鸡 猪 肥鸭
石斑鱼
名称 白对虾
合饲料 饲料 饲料 饲料 饲料
４４
40 50 60 70 80
维生素 E 含量（mg/kg） 135 159 176 179 173
2.5.3 皂化反应时间的选择 分别将 5 份 2.00g 相同样品按上述步骤分别在
2h、3h、4h、5h、6h 的不同温度下皂化反应， 检测结 果见表 6。
维生素 E 乙酸酯皂化反应时间在 4h 后反应完 全，因此选取皂化反应时间为 4h。
2.5.2 皂化温度的选择 分别将 5 份 2.00g 相同样品按上述步骤每两份
分别在 40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的不同温度下皂 化反应，检测结果见表 5。
结果显示， 维生素 E 乙酸酯在 60℃皂化反应 趋于完全，因此样品皂化反应温度选择为 60℃。
表 5 皂化温度的选择
皂 化 温 度 （℃）
检测分析 TESTING AND ANALYSIS
配合饲料中维生素 Ｅ 含量的测定
杨 曦 王华朗 * 刘成模 黄智成
（广东恒兴饲料实业股份有限公司）
［中 图 分 类 号 ］S816.2
［文献标Hale Waihona Puke Baidu码］ A
［文 章 编 号 ］1002-8358 （2015 ）22-42-3
摘 要：建立了一种高效液相色谱检测配合饲料中维生 素 E（VE）含量的方法。 该方法 相 比 较 国 标 容 易 适 合 批 量 检 测样本， 灵敏度也比较高 ， 检 出 限 为 0.6mg/kg， 定 量 限 为 2mg/kg， 回 收 率 在 96.6%~103.99%之 间 ， 相 对 标 准 偏 差 为 4.08%，方 法 准 确 ，达 到 实 验 的 要 求 ，适 用 于 配 合 饲 料 中 维 生 素 E 的检测。
表 7 样品称样量的选择
样 品 质 量 （g）
0.5 1 2 5 8 10 12
维生素 E 含量（mg/kg） 172 181 181 180 177 178 157
3 结论 本实验建立了一种用高效液相色谱法检测配
合饲料中 VE 含量的方法。 样品通过皂化后经乙醚 提取，浓缩过滤后，用液相色谱检测。 结果表明，该 方法前处理简单，回收率稳定、灵敏、准确，达到分 析要求，适用于配合饲料中 VE 含量的分析。
称取已知含量南美白对虾饲料 2g， 共 6 份，分 别 加 入 50μg/mL 维 生 素 E 乙 酸 酯 1 520μL、 3 040μL、7 600μL，按照上述方式检测其含量，进行 回收率测定，平均回收率为 100.8%，结果见表 1。
表 1 虾饲料中 VE 回收率试验结果
添 加 浓 度 /（μg/g）
表 2 精密度结果
测定次数 1 2 3 4 5 6 平均值 CV（n=6，%）
含量（mg/kg） 190 189 200 186 207 192 194
4.08
图 2 水产饲料样品 VE 色谱图
2.4 实际样品中维生素 E 的分析 用本文方法对市场上不同种类配合饲料按 1.3
方法所述进行检测。 结果见表 3，南美白对虾、石斑 鱼、草鱼配合饲料、罗非鱼饲料、鸡饲料、猪饲料、肥 鸭饲料等饲料样品的 VE 的检出率分别是 194mg/kg、
作者简介：杨曦，工程师，研究方向为农产品质量安全 与检测。
* 通讯作者：王华朗，高级畜牧师，研究方向为动物营养 与饲料研究。
批量检测样本，本方法针对国标方法无法进行批处 理样品进行改进， 改进后的检测方法提高工作效 率，适合对大批量样品进行检测。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂
安捷伦 1260 Infinity 高效液相色谱仪，台式高 速冷冻离心机（德国 SIGMA），旋转蒸发仪（瑞士步 琪），分析天平（感量 0.0001g，德国赛多利斯），恒温 水浴锅（上海沪南科学仪器联营厂）。
参考文献 [1] 崔 云 龙 ， 李 民. 分 光 光 度 法 测 定 维 生 素 E ［J］. 临 床 检 验 杂 志 ， 1990（8）：14-16 . [2] 阚 健 全. 荧 光 法 快 速 测 定 食 品 中 的 维 生 素 E［J］.分 析 测 试 学 报 ， 1993（3）：51-54 . [3] 邵晓芬， 张韵慧. 脱臭馏出物中游离生育酚的气相色谱分析 ［J］. 分析试验室，1994（5）：61-62 . [4] 李东，顾鹏. 高效液相色谱法测定维生素 E 的研究进展［J］. 食品 科学，2000（6）：57-59 . [5] 王 安 群 ，邓 益 群 ，彭 凤 仙.HPLC 法 测 定 饲 料 中 维 生 素 A、维 生 素 D3 和维生素 E［J］.环境监测管理与技术，2005，17（2）:33-34. [6] 谢云峰、王浩、刘佟等.在线固相萃取-高效液相色谱联用测定动 物源食品中的维生素 A、E［J］.分析化学，2014，42（9）:1343-1347. [7] Xiuping Xue，Jinming You，Pingli He.Simultaneous determination of five fat -soluble vitamins in feed by high -performance liquid chromatography following solid -phase extraction ［J］.Joural of chromatographic science，2008，46:345-350. [8] H.Qian，M.Sheng. Simultaneous determination of fat-soluble vitamins A，D and E and pro-vitamin D in animal feeds by one-step extraction and high-performance liquid chromatography analysis ［J］. Journal of Chromatography A，1998，825:127-133
标 准 品 ：VE （dl-а- 生 育 酚 乙 酸 酯 ） 标 准 品 ： （Sigma-Aldrich 公司）含量≥99.0%。
试剂：甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水 为超纯水。 1.2 色谱条件
A 色谱柱 XTerra MS C18，4.6×150mm，5μm B 进样量 20μL，柱温 27℃，流速 1.0mL /min C 检测器：紫外检测器 280nm 1.3 试样制备 1.3.1 皂化 称 取 2g（精 确 至 0.0001g）试 样 于 150mL 带 盖 密封玻璃瓶中，加 50mL 抗坏血酸溶液（5g/L），使试 样完全分散，浸湿，加 10mL 氢氧化钾溶液（500g/L）， 混匀。 充入氮气以隔绝空气，摇匀，置于 60℃水浴上 皂化 4h。 皂化后立即放入冰水中冷却。 1.3.2 提取 向皂化液中加入 50mL 乙醚（不含过氧化物），
关键词：高效液相色谱；维生素 E；配合饲料
VE 具有抗氧化功能、 维持动物正常的繁殖机 能、 增强动物机体的免疫功能和抗应激功能等，对 动物具有重要的营养作用，也是配合饲料中不可缺 少的成分。 但是，由于脂溶性维生素不能经尿排出， 所以摄入过量脂溶性维生素易引起中毒，导致动物 代谢障碍和生长受阻。 因此，准确快速测定配合饲 料 中 VE 含 量 ，对 于 优 化 饲 料 配 方 、提 高 养 殖 效 率 具有十分重要的意义。