模块四 常见植物组培方法与易发问题处理

视频4-1-11 接种
二、培养方法和程序
1.培养
最常用的基本培养基为MS培养基，加 入3%蔗糖，用0.7%的琼脂固化。培养条件 保持25℃左右，给予充分的光照和光期。 经培养后茎段的切口特别是基部切口上会 长出愈伤组织，呈现稍许增大，而芽开始 长长，有时会出现丛生芽，从而得到无菌 苗。
月季茎段侧芽萌发
学习提示
多动手，勤实践； 多比较，多联想，勤归纳； 手、口、脑并用，学做合一。
理论阅读
植物器官培养主要是指离体的根、茎、 叶、花器和果实、种子的无菌培养，是植物 组织培养中最主要的一个方面。植物器官培 养不仅是研究器官生长、营养代谢、生理生 化、组织分化和形态建成的最好材料和方法， 而且具有重要的应用价值。
单元一 器官培养（一） 单元二 器官培养（二） 单元三 花药培养和花粉培养 单元四 培养物的不良表现及
改进措施 单元五 花卉的组织培养
单元六 水果作物的组织培养
单元一 器官培养（一）
1 一般掌握离体根培养的取材部位和培养基的 选择；
2 掌握茎尖培养的种类和操作步骤； 3 掌握茎段培养中材料的选择、处理及培养基
视频4-1-2 外植体采集与处理视频
茎尖取材示意图
茎尖的解剖构造
（引自刘进平，2005）
一、普通茎尖培养
2. 灭菌
将采到的茎尖切成0.5～1.0cm长，并将大 叶除去，休眠芽预先剥除鳞片。将茎尖置于 流水冲洗2～4小时(视干净程度），再在70% 的酒精中处理10-30秒，然后在稀释5 ～ 10倍 的次氯酸钠（商品次氯酸钠为10%）中浸 10～15分钟，最后用无菌水冲洗3 ～ 4次， 或者用0.1 ～ 0.2%的氯化汞灭菌5 ～ 10分钟， 无菌水冲洗5次以上。
1.取材
取生长健壮无病虫的当年生幼嫩枝条或鳞茎 盘，•去掉叶片，剪成3～4cm的小段。取材时注意 茎的基部比顶部切段、侧芽比顶芽的成活率低， 所以应优先利用顶部的外植体，但由于每个新梢 仅一个顶芽，也可利用腋芽，茎上部的腋芽培养 效果较好。还应注意尽量在生长期取芽，如苹果 在3～6月取材的成活率为60%，7～11月下降到10%， 12～2月都在10%以下。
生根培养时最好在培养基中加0.3%活 性炭，以促进生根。
二、培养方法和程序
2.移植
二、培养方法和程序
这是组织培养的关键一环。试管苗是 在恒温、湿度饱和、营养丰富、激素适 当和无菌条件下生长的。植物的组织发 育程度不高，植株幼嫩，表皮角质层变 薄，抵抗力减弱。移植是一个由异养转 变为自养的过程。因此，在驯化时要进 行炼苗。然后洗净琼脂，小心移栽，初 期湿度要大，基质通气良好，保湿保温， 更要精心管理等。
茎尖灭菌
视频4-1-3 外植体灭菌
一、普通茎尖培养
3.接种
为了减少污染，可在接种前再剥掉一些 叶片，使茎尖为0.5cm左右大小。有些植物 的茎尖由于多酚氧化酶的氧化作用而发生褐 化，使培养基变褐，影响材料的成活。所以 在接种时，不能用生锈的解剖刀，动作要敏 捷，随切随接，减少伤口在空气中暴露的时 间，也可配制1～5%Vc液，将切下的茎尖材 料浸入处理一下。
视频4-1-7 生根培养
单芽茎段微繁示意图
单 芽 茎 段 增 殖 示 意 图
丛生芽微繁示意图
（引自刘进平，2005）
丛生芽增殖示意图
4.培养
一、普通茎尖培养
（5）培养条件
每天照光16小时，照度1500～3000Lx即 可，温度通常为25±2℃。一般茎尖培养在 40天左右可长成新梢，进行继代培养。
首先营养钵的培养土要浇透水，所放 置的床面也要浇湿，然后搭小拱棚，以减 少水分的蒸腾，初期要常喷雾处理，保持 拱棚薄膜上有水珠出现。当发现小苗有生 长趋势，可逐渐减少湿度将拱棚两端打开 通风，并且减少喷水次数。使小苗适应湿 度较小的条件。以后揭去拱棚的薄膜，并 给予水分控制，少浇水或不浇水，促进小 苗长得粗壮。
一、普通茎尖培养
5．驯化移栽
生根培养一个月左右，多数新梢即可 获得生长健壮而发达的根系。移植时可根 据生根情况来进行。若发现新梢基部生有 较浓密的不定根，长度在1cm以内，就可移 栽入土。移栽时通过几天的炼苗过程，从 试管中取出小植株，轻轻洗掉培养基。栽 后给予较高的空气湿度条件。
视频4-1-8 驯化
第三节 茎段培养
茎段培养是指对植物带有一个以上芽的 外植体（包括块茎、球茎、鳞茎的幼茎切段） 进行培养的技术。茎段培养的主要目的是进 行植物的离体快速繁殖。茎段培养用于快速 繁殖的优点在于：培养技术简单易行、繁殖 速度较快；芽生芽方式增殖的苗木质量好， 且无病、变异小、性状均一等。
一、无菌培养物的建立
的来自百度文库整；
1 能够根据不同植物及种类选择合适的外植体进行启动
培养；
2 能够根据不同的植物器官及器官状态，选择合适的灭
菌剂和适宜的灭菌时间，对外植体进行表面处理与灭
菌；
3 会通过观察试管苗的长势，大体判断采取何种措施改
善培养条件；
4 熟练外植体灭菌的工艺操作流程； 5 熟练各种试管苗继代培养过程中的切割方式与技术； 6 熟练无菌操作技术。
三、影响因素
1. 植物种类 2. 培养基 多为浓度低的White培养基，许多
植物在1/2MS培养基上能生根。糖的使用浓 度应稍低，如玫瑰生根蔗糖为2%。 3. 生长物质 培养基中添加适宜浓度的生长素 有利于根的形成和生长，常用生长素为IAA、 NAA、IBA，浓度范围一般为0.0-1.0mg/L。
余下较短的新梢继续进行继代培养。
视频4-1-6 继代培养
一、普通茎尖培养
4. 培养
（4）诱导生根
诱导生根多采用1/2MS培养基，即MS培 养基的各种组成成份用量均减半的培养基。 并加入一定的生长素类调节物质，如NAA、 IBA等。也可将切下的新梢基部浸入50或 100ppm的IBA溶液中处理4～8小时，然后转 移到无激素的生根培养基中。注意较高浓度 的生长素对生根有抑制作用。
类型： 茎尖培养分为微茎尖培养和普通茎尖 培养。微茎尖指带有1～2个叶原基的生长锥， 其长度不超过0.5mm。普通茎尖指较大的茎尖 （如几mm到几十mm）、芽尖及侧芽。这里主 要讲普通茎尖培养。这种培养技术简单，操作 方便，茎尖容易成活，成苗所需时间短。
一、普通茎尖培养
1. 取材
挑选杂菌污染少，生长不久的茎尖。 木本植物可在取材前对茎尖喷几次灭菌药 剂。以保证材料不带或少带杂菌。用于普 通茎尖培养，可先从植物的茎、藤或匍匐 枝上切取2cm以上的顶梢。
视频4-1-5 初代培养
一、普通茎尖培养
4. 培养
（3）继代培养
茎尖长成的新梢，可切成若干小段，转入到增 殖培养基中。长大后又可切成小段，再转入新培养 基，这样一代一代继续下去，便建立和维持了茎尖 无性繁殖系。继代培养的激素浓度要降低或用MS0 培养基。有时也可边进行继代培养边进行诱导生根。
取比较长的新梢（如2cm以上）转入生根培养基，
第一种途径 的好处是不会产 生变异，能保持 品种优良特性， 且方法简便，可 在各种植物上使 用。每年从一个 芽可扩繁增殖10 万株以上。
二、培养方法和程序
第二种途径（诱导形成大量不定芽） 有时会产生变异。
继代增殖过程所用培养基和生长调节 剂与初代培养相同，有时会稍低。
二、培养方法和程序
生根培养主要是降低或除去细胞分裂素 而加入生长素。由于在苗增殖时施用了较高 浓度的细胞分裂素，其苗中保持着一定的量， 因此在生根培养中不需要加细胞分裂素。生 长素的浓度，NAA一般为0.01～1.0mg/L， IBA和IAA可稍高。
桑树茎尖萌发
杨树顶芽萌发成丛生芽
一、普通茎尖培养
4. 培养
（2）初代培养
茎尖的初代培养主要是通过适宜的培 养条件刺激顶芽和腋芽的生长。外植体启 动生长的关键主要是培养基的激素配比与 浓度，一般应使用较高浓度的细胞分裂素 和较低浓度的生长素，解除顶端优势的抑 制作用，生长素浓度过高容易产生愈伤组 织。
最适宜的温度是16～20℃，春季地温 较低时，可用电热线来加温。
光照管理上，初期可用较弱的光照， 在小拱棚上加盖遮阳网或报纸等，以防阳 光灼伤小苗和增加蒸腾作用，后期可直接 利用自然光照。
为了提高驯化效率，可用育苗盘进行 驯化生根，选择2cm左右孔径的育苗盘即可。 孔穴装入蛭石：珍珠岩：草炭土为1︰1︰ 0.5的基质。
油棕根培养 （引自刘进平，2005）
二、培养方法
一、植株再生培养
根的离体培养也可以用来再生植株。 第一步诱导形成愈伤组织； 第二步在再分化培养基上诱导芽的分化 在愈伤组织上分化成小植株。
需要注意的是，愈伤组织如果先分化形成 根则往往抑制芽的形成。
再生培养流程
视频4-1-1 再生培养
二、培养方法
视频4-1-4 接 种
一、普通茎尖培养
4. 培养
（1）培养基 多数茎尖培养采用MS作为基 本培养基或改良MS培养基。 培养基中生长素是必须的，如2,4-D， IAA，NAA等，一般用0.1mg/L左右，高于 此浓度，往往产生畸变芽或形成愈伤组织。 茎尖在培养过程中会出现生长太慢、生 长太快和生长正常等三种类型。
视频4-1-9 取材
一、无菌培养物的建立
2.灭菌
20分钟，如果材料表面有绒毛应在消毒 剂中滴加1-2滴土温—20或80。因材料老嫩 和蜡质多少而定时间。最后用无菌水冲洗数 次以致干净，否则植物材料会受残留灭菌剂 的危害。
视频4-1-10 灭菌
一、无菌培养物的建立
3.接种
消毒好的茎段用锋利的解剖刀或 剪刀剪去两端消毒剂杀伤的部位，分 切成单芽小段接种于预先配好的诱导 侧芽萌发的培养基中，一般每瓶接种 一块外植体，防止交叉感染。
实际应用
植物器官培养可利用茎、叶和花器 培养建立的试管培养物，进行名优特新 品种的快速繁殖；利用茎尖培养可以得 到脱毒试管苗，解决品种的退化问题， 提高产量和品质；将植物器官作诱变处 理，利用器官培养可得到突变株，进行 细胞的突变育种。
第一节 根的培养 第二节 茎尖培养 第三节 茎段培养
第一节 根的培养
三、影响因素
4. pH 根的培养适宜的pH范围为5.0～6.0， 5. 光照大多数人认为，黑暗有利于根的形成。
试管苗的生根一般无需考虑光照的影响， 有时加一点活性炭可减弱光照，对植物的 生根比较有利。 6. 温度生根温度一般控制在16～25℃。
第二节 茎尖培养
意义： 茎尖不仅生长速度快、繁殖率高、不 易产生遗传变异，而且是获得无病毒苗木的有 效途径，故茎尖培养是植物组织培养最常用的 试材之一。
二、固氮培养
通过分离和培养具有固氮作用的根瘤菌，接种 到禾谷类等作物的试管苗根系中，可以实现谷物直接 利用生物固氮的捷径。
通过选择有效的适当浓度的诱瘤剂诱导根瘤菌侵 入试管苗根部结瘤固氮，固氮菌接种时要给根系创造 伤口，以利于根瘤菌的侵入。
接种根瘤菌形成的根瘤具有一定的固氮活性并向 宿主提供氮素，能促进植株生长和氮营养的改善，无 论在株高、鲜重和叶绿素含量都有提高。
离体根培养是进行根系生理和代谢研 究最优良的实验体系。因为根系生长快， 代谢强，变异小，能根据研究需要，改变 培养基的成分来研究其营养吸收、生长和 代谢的变化。在工厂化生物反应器系统中 通过工艺调控实现大规模根培养，不受环 境和季节的限制，随时随地生产根培养物， 进行药物、微量活性物质及一系列次生代 谢产物的工厂化生产。另一方面，由根细 胞可再生成植株用于生产实践。
（引自谭文澄、戴策刚，1991）
二、培养方法和程序
在茎段培养中，促进腋芽增殖用6-BA 是最为有效的。生长素虽不能促进腋芽增 殖，但可改善苗的生长。GA对芽的伸长有 促进作用。
继代扩繁是茎段培养的主要一步。这 可由二种途径解决：一是促进腋芽的快速 生长；二是诱导形成大量不定芽。
茎段快繁方式 模式图
一、根无性繁殖系的建立
1.外植体
根的培养材料一般来自 无菌种子发芽产生的幼根或植 株根系经灭菌处理后的切段。
2.根无性繁殖系的建立
将种子进行表面消毒，在无菌条件下萌发， 待根伸长后从根尖一端切取长1.2cm的根尖（或 植株的根系经表面灭菌后）接种于培养基中。这 些根的培养物生长甚快，几天后发育出侧根。待 侧根生长约一周后，即切取侧根的根尖进行扩大 培养，它们又迅速生长并长出侧根，又可切下进 行培养，如此反复，就可得到从单个根尖衍生而 来的离体根的无性繁殖系。这种根可用来进行根 系生理生化和代谢方面的实验研究。