高级生化技术实验

实验一鸡卵类黏蛋白的分离与纯化

【目的要求】

1、掌握从鸡蛋清中提取鸡卵类黏蛋白的原理及方法。

2、了解凝胶过滤层析、离子交换层析的工作原理，掌握基本操作技术。

3、掌握消光系数法测定蛋白质含量的原理及计算方法。

【实验原理】

鸡卵类黏蛋白是由鸡蛋清中提取的一种糖蛋白，可强烈地抑制胰蛋白酶，常用于胰蛋白酶学性质的研究，也可将其制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效的分离与纯化胰蛋白酶。

鸡卵类黏蛋白在中性或酸性溶液中对热及高浓度的脲、有机溶剂都相当稳定，而在碱性溶液中不稳定，尤其是当温度较高时会迅速失活。它在10%三氯乙酸或50%丙酮溶液中有较好的溶解度。选择合适的pH值及适当浓度的三氯乙酸或丙酮，可以从蛋清中除去大量的非卵类黏蛋白，或得鸡卵类黏蛋白的粗提液。

含盐或其他小分子的蛋白质混合溶液，在经过凝胶层析柱时，大分子蛋白质不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙以较快的速速最先流出柱外，而相对分子量较低的盐或其他小分子物质则可以进入凝胶内部的微孔中，所以向下移动的速度较慢而最后流出柱外。这样鸡卵类黏蛋白粗提液经过凝胶柱层析后可以除去小分子物质（盐）而得到初步纯化。

初步纯化的鸡卵类黏蛋白，经过DEAE-纤维素离子交换柱进一步纯化，可除去少量的杂蛋白，得到鸡卵类黏蛋白的纯溶液。

本实验先将鸡蛋清先用三氯乙酸溶液处理，离心后去除沉淀物，然后由丙酮分级沉淀获得粗品，经SephadexG-25柱层析脱盐，DEAE-纤维素离子交换柱层析纯化，再经透析及丙酮沉淀进一步纯化，最后真空干燥可得到鸡卵类黏蛋白合格产品。

鸡卵类黏蛋白在280nm处得消光系数A 1%1cm=4.13，即蛋白质浓度为1mg/mL时溶液的吸光度A280=0.413,据此可以测定鸡卵类黏蛋白的含量。

【试剂与器材】

1、试剂

（1）丙酮（2）新鲜鸡蛋（3）0.5mol/L HCL溶液

（4）Sephadex G-25 (5) DEAE-纤维素粉

（6）10% pH 1.15三氯乙酸（TCA）：将称取的三氯乙酸置烧杯中，加入2/3体积的蒸馏水溶解，用6mol/L的NaOH调至约pH 1.15，静置约1h，然后在pH计上校正至pH 1.15，最后补充水到所配体积。

（7）0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液

（8）0.02 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液

（9）0.3mol/L NaCl-0.02 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液

2、器材

恒温水浴 752 紫外分光光度计离心机 pH酸度计

核酸蛋白质检测仪真空干燥器

层析柱（25×300mm, 15×200mm）贮液瓶离心管

布氏漏斗（80mm）玻璃烧结漏斗（G-3）抽液瓶沸水浴

【操作方法】

1、鸡卵类黏蛋白的提取

（1）取1个鸡蛋蛋清，加入等体积的10%，pH 1.15三氯乙酸溶液，这时出现大量白色沉淀，充分搅匀后，此时溶液的pH值应是3.5±0.2，若偏离此值，用5mol/L NaOH或5mol/L HCL调至pH值3.5。继续搅拌10 min，室温下静置4h以上。

（2）4000r/min 离心10 min。收集清液，再用滤纸过滤，除去上清液中脂类物质及其它不溶物。收集滤液转入500 mL烧杯中。检查滤液的pH值是否为3.5，否则要调到pH3.5。然后缓慢加入3倍体积预冷的丙酮，用玻璃棒搅匀并用塑料薄膜封严，冰浴放置2～4h。

（3）待鸡卵类黏蛋白完全沉淀后，小心虹吸出部分上清液，剩余浑浊液转到离心管中，3500r/min 离心10 min，弃去上清液，将盛有沉淀的离心杯置于真空干燥器内，抽气，除去残留丙酮。

（4）将离心管中鸡蛋黏蛋白加20 mL蒸馏水，玻璃棒搅拌溶解，滤纸过滤除去不溶物。将滤液用Sephadex G-25层析柱脱盐或透析袋除盐。

2、Sephadex G-25层析柱脱盐

（1）凝胶的处理：量取100 mL Sephadex G-25（已溶胀好）入250 mL烧杯中，加入200mL 0.02 mol/L ，pH6.5的磷酸盐缓冲液，于沸水浴中加热1h。冷却后用真空干燥器脱气。

（2）装柱：选用25×300mm层析柱，垂直夹与铁架台上。关闭层析柱出水口，然后在搅拌下将浆状的凝胶缓缓地倾入柱中，使之自然沉降，打来柱出水口，调节合适流速，使凝胶继续沉集。待沉集的胶面上升之距柱上口3～5 cm时关闭层析柱出水口。

（3）平衡：打开核酸蛋白检测仪及记录仪电源开关。将贮液瓶中加入0.02 mol/L， pH6.5的磷酸盐缓冲液，与柱上端接口连接。再将柱出水口与核酸蛋白检测仪比色池进液口相连。开启柱出水口夹子，调节流速2 mL/min，用约2倍体积的缓冲液平衡。流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线即可上样。

（4）上样：关闭柱上、下口夹子，用滴管小心吸出层析柱上层液体。打开柱出水口，使残余液体降至与胶面相切，立即关闭出水口。吸取蛋白提取液在距离床面1mm处沿柱内壁轻轻转动加到凝胶床表面，打开出水口夹子，调节流速15 d/min，使样品流入凝胶床内，直到与胶面相切，立即用1mL缓冲液冲洗柱壁，使其缓慢进入凝胶床内，然后在胶面上端加入3～4 cm高度洗脱液，并将上端接口与贮液瓶连接。

（5）洗脱：控制流速15 d/min，开始洗脱，在检测仪上观察到开始出峰时开始收集。将收集的蛋白峰液体放置冰箱，准备进一步用DEAE-纤维素柱层析纯化。

3、DEAE-纤维素柱层析纯化

通过上述方法得到的鸡卵类黏蛋白溶液中仍含有少量的卵清清蛋白。由于二者的等电点不同，采用DEAE-纤维素离子交换层析可以将二者分开。

（1）DEAE-纤维素的处理：称取10g DEAE-纤维素粉，置于250 mL烧杯中，加入150 mL 0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡20 min。然后用布氏漏斗抽滤，蒸馏水洗至pH 8.0左右，抽干。再移至250 mL烧杯中，加入150 mL HCL溶液浸泡20 min，转移到布氏漏斗中，抽滤，用蒸馏水洗至pH6.0左右，最后转移到烧杯中，用150 mL 0.02 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液浸泡15min，经真空干燥器脱气后装柱。

（2）装柱：选用15×200mm层析柱，垂直夹与铁架台上。将脱气后的DEAE-纤维素装入柱内（装柱操作同上）。用pH6.5磷酸盐缓冲液平衡，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线即可加样。

（3）吸附：将经Sephadex G-25脱盐后的卵类黏蛋白粗提液上样吸附，调节流速15d/min，待样品全部流入柱床后，再用pH6.5磷酸盐缓冲液平衡，目的是洗去未被吸附的杂质蛋白，直至基线稳定。

（4）改用含0.3mol/L NaCl的pH6.5磷酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白峰。如果在前面的