玉米副产物中玉米赤霉烯酮的ELISA测定_张东升
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６．８９￣７．３８
平均值 ５１９．２５ ７８４．１６ ７９１．７０ ６８３．１５ １２０．０４
７．１７
样品处理 ｂ
测定结果 ２２０．０３￣１９８．３５ ４１３．５９～４６８．９７ ５０２．３４￣４５６．２４ ６４３．４３￣６８９．７１ ９５．４０￣１０９．６４
６．５４￣７．０２
平均值 ２０６．３９ ４４３．８６ ４８１．７０ ６６６．８１ １０２．２８
图 １ ＺＥＮ 标准曲线
２ 测定结果与讨论 ２．１ 线性范围及灵敏度
由图 １ 标准曲线可以看出， ＺＥＮ 标准品在 ０￣２０．０ μｇ／ｌ 时有良好的线性关系 ， ｒ＝－ ０．９９１ ８ 线 性回 归 方程 ｙ＝－ ０．３６８ ２ｘ＋０．７２７ ６（见表 １）。当抑制率（１－ Ａ／Ａ０）＞０．２０ 时的最低浓度即为灵敏度。由表 １ 可以看出 １．０ μｇ／ｌ 为灵敏度。
１．３ 方法 １．３．１ 原理
样 品 中 的 玉 米 赤 霉 烯 酮 经 提 取 、纯 化 后 与 定 量 特
ＺＥＮ 是影响其质量的重要卫生指标之一。 目前分析 ＺＥＮ 的方法包括： 薄层色 谱 法［６， ７］、气 相
色 谱 法 （ ＧＣ） ［８］、高 压 液 相 色 谱 法 （ ＨＰＬＣ） ［９， １０］和 酶 联 免 疫法（ ＥＬＩＳＡ） ［１１， １２］。对于大量样品的常规性定量检测， 酶 联 免 疫 分 析 具 有 简 便 、成 本 低 、快 速 的 优 点 。因 玉 米 副产物随生产工艺的不同， 其中的成分也有区别， 在 用 ＥＬＩＳＡ 准确测定其含量时带来很大的难度。本文旨
１＃
２＃
均值
０．２２１ ０．２８９ ０．２５５
０．２９４ ０．３０２ ０．２９８
０．３８２ ０．４０６ ０．３９４
０．４４５ ０．４８６ ０．４６５
０．５４７ ０．４８７ ０．５１７
０．６３５ ０．５８４ ０．６０９
０．５６０ ０．５２２ ０．５４１
０．５６４ ０．６１６ ０．５８９
０．６９５ ０．６６８ ０．６８２
３０１１＃ ６３０．８
３１４７＃ ３７８．５
２３９９＃ ４８８．５
２８７２＃ ３９６．７
表 ５ 不同玉米蛋白粉样品测定结果（ μｇ／ｋｇ）
玉米酒精糟
玉米蛋白饲料
玉米胚芽粕
玉米麸
项目
２８３６＃ ２５７９＃ ２７９０＃ ２６９６＃ ３０４０＃ ３０４１＃ ２７０８＃ ２７２０＃ ２６０５＃ ２６０６＃ ２８６１＃ ２７８８＃ ２６０４＃
和表 ５。其中有 ９ 份样品检测为阳性（结果＞５００ μｇ／ｋｇ）［１３］。
２．５ 验证 用薄层色谱法对上述阳性样品进行检测， 结果
见表 ６。
项目 测定结果
２３４３＃ ６４２．５
３０４５＃ ４０３．８
表 ４ 不同玉米蛋白粉样品测定结果（ μｇ／ｋｇ）
２５２８＃ ７７３．６
２５３１＃ ３２８．３
玉米蛋白粉 ３１２５＃ ３００５＃ ３０１０＃ ８６３．１ ５２０．４ ４２６．１
测定结果 ３５６．７ ２７６．４ ２１８．６ ５０３．５ ３８７．７ ２０３．８ １ ０８３．１ ８４３．４ １１４．８５ １２０．０５ ５４３．７６ １３２．１０ ９８．６
样品编号 测定结果
２３４３＃ ＞５００
２５２８＃ ＞５００
表 ６ 薄层色谱检测结果（ μｇ／ｋｇ）
３１２５＃ ＞５００
３００５＃ ＞５００
箱 ； 小型 粉 碎机 ， 微 量移 液 器 （ ２０￣２００ μｌ， ｌａｂｓｙｓｔｅｍ） ； 微 型 摇 床 （ ＫＳ１３０， ＩＫＡ， 德 国 ） ； 高 速 离 心 机 ； ｐＨ 计 ；
张东升， 江苏省微生物研究所， 助理研究员， ２１４０６３， 江苏 省无锡市钱荣路 ７ 号。
王虎， 新希望集团中心化验室。 蔡建荣、蔡正森， 单位及通讯地址同第一作者。 收稿日期： ２００７－ ０９－ ２８
选 玉 米 酒 精 糟 、玉 米 蛋 白 粉 及 玉 米 蛋 白 饲 料 样 品 各 １ 例， １０．０ ｇ 中分别加入 ０．５×１０３、１．０×１０３ 和 ２．５×１０３ ｎｇ 的 ＺＥＮ 标准品。按 １．３．２ 样品处理方法 ｂ 测定， 每 份做 ２ 个平行， 同时测定样品空白， 并计算回收率。
新希望集团各分公司提供， 共 ２４ 份玉米副产物： 玉 米酒精糟（ＤＤＧＳ）３ 份， 玉米蛋白粉 １１ 份、玉米蛋白饲 料 ３ 份、玉米胚芽粕 ２ 份、玉米麸 ５ 份。另外玉米 ２ 份。
程 度 的 分 布 。玉 米 副 产 物 是 饲 料 生 产 中 不 可 缺 少 的 重 要原料之一， 它是很多非优质玉米深加工过程中的副 产 物 ［５］， 其 质 量 好 坏 直 接 影 响 饲 料 的 利 用 率 ， 而 其 中
试剂盒中有 ０、１．０、２．５、５．０、１０．０、２０．０ μｇ／ｌ 系列标 准溶液。
３８
张东升等： 玉米副产物中玉米赤霉烯酮的 ＥＬＩＳＡ 测定
检测技术
１．３．４ 测定过程 试剂盒平衡至室温。用一抗稀释液 １．５ ｍｌ 将一抗
浓缩液配制成工作溶液； 用酶标二抗稀释液 ５．０ ｍｌ 将 酶 标 二 抗 浓 缩 液 配 制 成 工 作 溶 液 。配 制 好 洗 涤 液 。插 入 一 定 数 量 的 酶 标 板 于 反 应 支 架 上 。标 记 标 准 品 孔 和 样品 孔， 标 准 品孔 中 加 入 ５０ μｌ ＺＥＮ 的 系 列 标 准 溶 液 ， 样 品 孔 中 加 入 ５０ μｌ 的 样 品 待 测 液 ， 再 在 每 孔 中 加入一抗工作溶液 ５０ μｌ， 充分混匀， ３７ ℃恒温箱中孵 育 ６０ ｍｉｎ。将微孔中反应液倒掉， 拍干。洗涤液洗涤 ３ 次（ ２ ｍｉｎ／次） ， 拍干。各孔中加入 １００ μｌ 的酶标二抗 工作液， 充分混匀， ３７ ℃恒温箱中孵育 ３０ ｍｉｎ。将微孔 中反应液倒掉， 拍干。洗涤液重复洗涤 ５ 次（２ ｍｉｎ／次）， 拍干。各孔中分别加入 ５０ μｌ 的基质液和 ５０ μｌ 的显 色剂， ３７ ℃显色 １５ ｍｉｎ。最后各孔中加入 ５０ μｌ 终止 液， 并在酶标仪 ４５０ ｎｍ 波长处测定各孔吸光度值。 １．３．５ 标准曲线的绘制
检测技术
《饲料工业》·２００８ 年第 ２９ 卷第 １ 期
玉米副产物中玉米赤霉烯酮的 ＥＬＩＳＡ 测定
张东升 王 虎 蔡建荣 蔡正森
摘 要 通过试验研究了酶联免疫吸附法在玉米及其副产物中玉米赤霉烯酮检测的应用。在优 化了样品前处理后， 其方法灵敏度为 １．０ ｎｇ／ｍｌ， 线性范围为 ０￣２０ ｎｇ／ｍｌ， 回收率为 ７０．３％￣９０．９％， 并用 该法测定了 ２４ 份玉米副产物样品， 检出率达 １００％， 阳性率为 ３７．５％， 其结果表明该方法快速、灵敏、 准确， 有较好的实用性。
在通过优化该类样品的前处理， 通过碱性水溶液提 用样品稀释液适当稀释后作样品待测液。
取， 中和并转相至有机相中， 然后进行 ＥＬＩＳＡ 检测。该 法具 有较 高 的灵 敏 度、良 好的 重 现 性 ， 为 解 决 该 类 样 品中 ＺＥＮ 的快速、准确检测提供了有效途径。 １ 材料与方法 １．１ 仪器与试剂
以 １．３．３ 配制成的标准系列溶液浓度的对数值为 横坐标， 吸光度 Ａ／Ａ０ 比值为纵坐标， Ａ 为吸光度值， Ａ０ 为 ０ μｇ／ｌ 浓度的吸光度值， 绘制标准曲线（ 见图１） 。
Ａ／Ａ０
８０％
６０％
４０％ ｙ＝－ ０．３６８ ２ｘ＋０．７２７ ６
２０％ Ｒ２＝０．９８３ ７
０
０．５
１
１．５
ｌｇＣ
２．２ 玉米及其副产物经不同样品处理后测定结果 随机取五类玉米副产物各 １ 例， 按 １．３．２ 样品处
理方法分别测定 ＺＥＮ， 另取玉米 １ 份同样进行测定， 结果见表 ２。其中玉米、玉米麸和 玉米 胚芽 粕 的测 定 中， 两 种 方 法 结 果 差 异 不 大 ， 其 相 对 标 准 差 为 ３．７％、 １１．２％和 １．７％； 其它副产物的测定结果差异较大， 相 对标准差分别为 ３４．４％、３９．２％和 ６０．９％。 ２．３ 回收率试验（ 见表 ３）
３９
样品空白（ μｇ／ｋｇ） ２１８．６ ４２６．１ ５０３．５
平均回收率（ ％）
７４．２ ８０．１ ７０．３ ７８．８ ９０．９ ７３．４ ７５．０ ８６．５ ７１．２
检测技术
张东升等： 玉米副产物中玉米赤霉烯酮的 ＥＬＩＳＡ 测定
２．４ 样品测定结果 用上述方法测定收集的 ２４ 份样品检测结果见表４
ＺＥＮ ＥＬＩＳＡ 检测试剂盒（ 无锡市艾赛生物技术有限公 司 ） ； 甲 醇 （ ＡＲ 级 ） ； ｐＨ 值 ７．５ 的 ＰＢＳ 缓 冲 溶 液 ： ８．７ ｇ ＮａＣｌ， ０．２５ ｇ ＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ， ３．０ ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ， 超 纯水定容至 １ ０００ ｍｌ。ＺＥＮ 标准品（ Ｓｉｇｍａ，美国） ； 标准 品及样品稀释液（ 甲醇： ＰＢＳ＝１： ９） 。 １．２ 样品来源
酶 标 仪 （ ＭＫ３， ｌａｂｓｙｓｔｅｍ，热 电 ） ； 隔 水 式 恒 温 培 养
ｂ： 称取 １０．００ ｇ 试样置于带塞三角瓶中， 加 ４ ｍｌ水 和 ５０ ｍｌ 的三氯甲烷， 盖紧瓶塞， 提取 ３０ ｍｉｎ， 加 ５．０ ｇ 无水硫酸钠， 混匀， 过滤， 取滤液 ２５ ｍｌ 置于分液 漏斗 中， 沿管壁慢慢加入氢氧化钠溶液（４０ ｇ／ｌ）２０ ｍｌ， 并轻轻 转动 ２ ｍｉｎ， 静置分层， 弃去三氯甲烷层。向氢氧化钠溶 液层中加入 ３ ｍｌ 磷酸溶液（１＋１０）， 再用磷酸溶液（１＋１９）
异性抗体反应， 多余的游离抗体则与酶标板内的包被 抗原结合， 加入酶标记物和底物后显色， 与标准比较 来测定含量。 １．３．２ 样品处理
ａ： 称取过筛（ ２０ 目筛） 样品 ５．００ ｇ 置于 带塞 的 三 角 瓶 中， 加 入 ０．５ ｇ ＮａＣｌ， 加甲 醇水 （ １： １） ５０ ｍｌ 振摇 １０ ｍｉｎ， ８ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心 ２０ ｍｉｎ， 取上清液一定体积，
６．７９
样品名称 玉米酒精糟 ２７９０＃ 玉米蛋白粉 ３０１０＃ 玉米蛋白饲料 ２６９６＃
加标浓度（ μｇ／ｋｇ）
０．０５×１０３ ０．１×１０３ ０．２５×１０３ ０．０５×１０３ ０．１×１０３ ０．２５×１０３ ０．０５×１０３ ０．１×１０３ ０．２５×１０３
表 ３ 回收率试验结果
检出浓度（ ×１０３ μｇ／ｋｇ）
关键词 玉米副产物； 玉米赤霉烯酮； ＥＬＩＳＡ； 测定 中图分类号 Ｓ８１６．７
玉米赤霉烯酮（ Ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ， 又名 Ｆ－ ２、ＦＥＳ 或ＲＡＬ， 以下简称 ＺＥＮ） 是唯一由禾谷镰刀菌产生的非甾类雌 激素型毒素。ＺＥＮ 为白色晶体， 溶于氯仿、二氯甲烷、乙 腈、醇类和苯； 微溶于石油醚和正己烷； 几乎不溶于水， 但溶于碱性水溶液［１，２］。ＺＥＮ 对动物繁殖的影响是各国 普遍关注的问题， 主要引起动物雌激素亢进症， 导致动 物不孕或流产， 对猪、牛和羊影响较大， 给畜牧业带来 很大的经济损失［３， ４］。玉米、小麦和配合饲料污染 ＺＥＮ 的 报 告较 多， 此 外 ， 其它 麦 类、高 粱 、大 米 中 也 有 一 定
试样名称
玉米酒精糟 玉米蛋白粉 玉米蛋白饲料 玉米胚芽粕 玉米麸 玉米
表 ２ 玉米及其副产物经不同样品处理后， ＺＥＮ 测定结果（ μｇ／ｋｇ）
样品ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ理 ａ
测定结果 ５５０．１５￣４８６．２４ ８１２．６２￣７５３．６５ ７６７．２１￣８１４．４２ ６３８．６６￣７２５．１３ １１２．５４￣１２７．５５
表 １ 各标准浓度测得的吸光度值及比值
浓度 Ｃ（ μｇ／ｌ） ０ ０．５ １．０ ２．５ ５．０
１０．０ ２０．０
吸光度值
１．６４２ １．４５２ １．２２０ ０．９５５ ０．７３７ ０．５４８ ０．４５９
吸光度比值 Ａ／Ａ０（ ％） １００ ８８．４３ ７４．３０ ５８．１６ ４４．８８ ３３．３７ ２７．９５
来调节 ｐＨ 值（请用 ｐＨ 计来调节）至 ９．５ 左右， 然后加 入 ３０ ｍｌ 三氯甲烷振摇提取 ５ ｍｉｎ， 静置分层， 放出三 氯 甲 烷 层 至 蒸 发 皿 中 ， ６５ ℃水 浴 挥 干 ， ５０ ｍｌ 的 甲 醇 水（１： １）溶解残渣。摇匀， 稀释后作样品的待测液。 １．３．３ ＺＥＮ 标准溶液
平均值 ５１９．２５ ７８４．１６ ７９１．７０ ６８３．１５ １２０．０４
７．１７
样品处理 ｂ
测定结果 ２２０．０３￣１９８．３５ ４１３．５９～４６８．９７ ５０２．３４￣４５６．２４ ６４３．４３￣６８９．７１ ９５．４０￣１０９．６４
６．５４￣７．０２
平均值 ２０６．３９ ４４３．８６ ４８１．７０ ６６６．８１ １０２．２８
图 １ ＺＥＮ 标准曲线
２ 测定结果与讨论 ２．１ 线性范围及灵敏度
由图 １ 标准曲线可以看出， ＺＥＮ 标准品在 ０￣２０．０ μｇ／ｌ 时有良好的线性关系 ， ｒ＝－ ０．９９１ ８ 线 性回 归 方程 ｙ＝－ ０．３６８ ２ｘ＋０．７２７ ６（见表 １）。当抑制率（１－ Ａ／Ａ０）＞０．２０ 时的最低浓度即为灵敏度。由表 １ 可以看出 １．０ μｇ／ｌ 为灵敏度。
１．３ 方法 １．３．１ 原理
样 品 中 的 玉 米 赤 霉 烯 酮 经 提 取 、纯 化 后 与 定 量 特
ＺＥＮ 是影响其质量的重要卫生指标之一。 目前分析 ＺＥＮ 的方法包括： 薄层色 谱 法［６， ７］、气 相
色 谱 法 （ ＧＣ） ［８］、高 压 液 相 色 谱 法 （ ＨＰＬＣ） ［９， １０］和 酶 联 免 疫法（ ＥＬＩＳＡ） ［１１， １２］。对于大量样品的常规性定量检测， 酶 联 免 疫 分 析 具 有 简 便 、成 本 低 、快 速 的 优 点 。因 玉 米 副产物随生产工艺的不同， 其中的成分也有区别， 在 用 ＥＬＩＳＡ 准确测定其含量时带来很大的难度。本文旨
１＃
２＃
均值
０．２２１ ０．２８９ ０．２５５
０．２９４ ０．３０２ ０．２９８
０．３８２ ０．４０６ ０．３９４
０．４４５ ０．４８６ ０．４６５
０．５４７ ０．４８７ ０．５１７
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０．５６０ ０．５２２ ０．５４１
０．５６４ ０．６１６ ０．５８９
０．６９５ ０．６６８ ０．６８２
３０１１＃ ６３０．８
３１４７＃ ３７８．５
２３９９＃ ４８８．５
２８７２＃ ３９６．７
表 ５ 不同玉米蛋白粉样品测定结果（ μｇ／ｋｇ）
玉米酒精糟
玉米蛋白饲料
玉米胚芽粕
玉米麸
项目
２８３６＃ ２５７９＃ ２７９０＃ ２６９６＃ ３０４０＃ ３０４１＃ ２７０８＃ ２７２０＃ ２６０５＃ ２６０６＃ ２８６１＃ ２７８８＃ ２６０４＃
和表 ５。其中有 ９ 份样品检测为阳性（结果＞５００ μｇ／ｋｇ）［１３］。
２．５ 验证 用薄层色谱法对上述阳性样品进行检测， 结果
见表 ６。
项目 测定结果
２３４３＃ ６４２．５
３０４５＃ ４０３．８
表 ４ 不同玉米蛋白粉样品测定结果（ μｇ／ｋｇ）
２５２８＃ ７７３．６
２５３１＃ ３２８．３
玉米蛋白粉 ３１２５＃ ３００５＃ ３０１０＃ ８６３．１ ５２０．４ ４２６．１
测定结果 ３５６．７ ２７６．４ ２１８．６ ５０３．５ ３８７．７ ２０３．８ １ ０８３．１ ８４３．４ １１４．８５ １２０．０５ ５４３．７６ １３２．１０ ９８．６
样品编号 测定结果
２３４３＃ ＞５００
２５２８＃ ＞５００
表 ６ 薄层色谱检测结果（ μｇ／ｋｇ）
３１２５＃ ＞５００
３００５＃ ＞５００
箱 ； 小型 粉 碎机 ， 微 量移 液 器 （ ２０￣２００ μｌ， ｌａｂｓｙｓｔｅｍ） ； 微 型 摇 床 （ ＫＳ１３０， ＩＫＡ， 德 国 ） ； 高 速 离 心 机 ； ｐＨ 计 ；
张东升， 江苏省微生物研究所， 助理研究员， ２１４０６３， 江苏 省无锡市钱荣路 ７ 号。
王虎， 新希望集团中心化验室。 蔡建荣、蔡正森， 单位及通讯地址同第一作者。 收稿日期： ２００７－ ０９－ ２８
选 玉 米 酒 精 糟 、玉 米 蛋 白 粉 及 玉 米 蛋 白 饲 料 样 品 各 １ 例， １０．０ ｇ 中分别加入 ０．５×１０３、１．０×１０３ 和 ２．５×１０３ ｎｇ 的 ＺＥＮ 标准品。按 １．３．２ 样品处理方法 ｂ 测定， 每 份做 ２ 个平行， 同时测定样品空白， 并计算回收率。
新希望集团各分公司提供， 共 ２４ 份玉米副产物： 玉 米酒精糟（ＤＤＧＳ）３ 份， 玉米蛋白粉 １１ 份、玉米蛋白饲 料 ３ 份、玉米胚芽粕 ２ 份、玉米麸 ５ 份。另外玉米 ２ 份。
程 度 的 分 布 。玉 米 副 产 物 是 饲 料 生 产 中 不 可 缺 少 的 重 要原料之一， 它是很多非优质玉米深加工过程中的副 产 物 ［５］， 其 质 量 好 坏 直 接 影 响 饲 料 的 利 用 率 ， 而 其 中
试剂盒中有 ０、１．０、２．５、５．０、１０．０、２０．０ μｇ／ｌ 系列标 准溶液。
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张东升等： 玉米副产物中玉米赤霉烯酮的 ＥＬＩＳＡ 测定
检测技术
１．３．４ 测定过程 试剂盒平衡至室温。用一抗稀释液 １．５ ｍｌ 将一抗
浓缩液配制成工作溶液； 用酶标二抗稀释液 ５．０ ｍｌ 将 酶 标 二 抗 浓 缩 液 配 制 成 工 作 溶 液 。配 制 好 洗 涤 液 。插 入 一 定 数 量 的 酶 标 板 于 反 应 支 架 上 。标 记 标 准 品 孔 和 样品 孔， 标 准 品孔 中 加 入 ５０ μｌ ＺＥＮ 的 系 列 标 准 溶 液 ， 样 品 孔 中 加 入 ５０ μｌ 的 样 品 待 测 液 ， 再 在 每 孔 中 加入一抗工作溶液 ５０ μｌ， 充分混匀， ３７ ℃恒温箱中孵 育 ６０ ｍｉｎ。将微孔中反应液倒掉， 拍干。洗涤液洗涤 ３ 次（ ２ ｍｉｎ／次） ， 拍干。各孔中加入 １００ μｌ 的酶标二抗 工作液， 充分混匀， ３７ ℃恒温箱中孵育 ３０ ｍｉｎ。将微孔 中反应液倒掉， 拍干。洗涤液重复洗涤 ５ 次（２ ｍｉｎ／次）， 拍干。各孔中分别加入 ５０ μｌ 的基质液和 ５０ μｌ 的显 色剂， ３７ ℃显色 １５ ｍｉｎ。最后各孔中加入 ５０ μｌ 终止 液， 并在酶标仪 ４５０ ｎｍ 波长处测定各孔吸光度值。 １．３．５ 标准曲线的绘制
检测技术
《饲料工业》·２００８ 年第 ２９ 卷第 １ 期
玉米副产物中玉米赤霉烯酮的 ＥＬＩＳＡ 测定
张东升 王 虎 蔡建荣 蔡正森
摘 要 通过试验研究了酶联免疫吸附法在玉米及其副产物中玉米赤霉烯酮检测的应用。在优 化了样品前处理后， 其方法灵敏度为 １．０ ｎｇ／ｍｌ， 线性范围为 ０￣２０ ｎｇ／ｍｌ， 回收率为 ７０．３％￣９０．９％， 并用 该法测定了 ２４ 份玉米副产物样品， 检出率达 １００％， 阳性率为 ３７．５％， 其结果表明该方法快速、灵敏、 准确， 有较好的实用性。
在通过优化该类样品的前处理， 通过碱性水溶液提 用样品稀释液适当稀释后作样品待测液。
取， 中和并转相至有机相中， 然后进行 ＥＬＩＳＡ 检测。该 法具 有较 高 的灵 敏 度、良 好的 重 现 性 ， 为 解 决 该 类 样 品中 ＺＥＮ 的快速、准确检测提供了有效途径。 １ 材料与方法 １．１ 仪器与试剂
以 １．３．３ 配制成的标准系列溶液浓度的对数值为 横坐标， 吸光度 Ａ／Ａ０ 比值为纵坐标， Ａ 为吸光度值， Ａ０ 为 ０ μｇ／ｌ 浓度的吸光度值， 绘制标准曲线（ 见图１） 。
Ａ／Ａ０
８０％
６０％
４０％ ｙ＝－ ０．３６８ ２ｘ＋０．７２７ ６
２０％ Ｒ２＝０．９８３ ７
０
０．５
１
１．５
ｌｇＣ
２．２ 玉米及其副产物经不同样品处理后测定结果 随机取五类玉米副产物各 １ 例， 按 １．３．２ 样品处
理方法分别测定 ＺＥＮ， 另取玉米 １ 份同样进行测定， 结果见表 ２。其中玉米、玉米麸和 玉米 胚芽 粕 的测 定 中， 两 种 方 法 结 果 差 异 不 大 ， 其 相 对 标 准 差 为 ３．７％、 １１．２％和 １．７％； 其它副产物的测定结果差异较大， 相 对标准差分别为 ３４．４％、３９．２％和 ６０．９％。 ２．３ 回收率试验（ 见表 ３）
３９
样品空白（ μｇ／ｋｇ） ２１８．６ ４２６．１ ５０３．５
平均回收率（ ％）
７４．２ ８０．１ ７０．３ ７８．８ ９０．９ ７３．４ ７５．０ ８６．５ ７１．２
检测技术
张东升等： 玉米副产物中玉米赤霉烯酮的 ＥＬＩＳＡ 测定
２．４ 样品测定结果 用上述方法测定收集的 ２４ 份样品检测结果见表４
ＺＥＮ ＥＬＩＳＡ 检测试剂盒（ 无锡市艾赛生物技术有限公 司 ） ； 甲 醇 （ ＡＲ 级 ） ； ｐＨ 值 ７．５ 的 ＰＢＳ 缓 冲 溶 液 ： ８．７ ｇ ＮａＣｌ， ０．２５ ｇ ＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ， ３．０ ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ， 超 纯水定容至 １ ０００ ｍｌ。ＺＥＮ 标准品（ Ｓｉｇｍａ，美国） ； 标准 品及样品稀释液（ 甲醇： ＰＢＳ＝１： ９） 。 １．２ 样品来源
酶 标 仪 （ ＭＫ３， ｌａｂｓｙｓｔｅｍ，热 电 ） ； 隔 水 式 恒 温 培 养
ｂ： 称取 １０．００ ｇ 试样置于带塞三角瓶中， 加 ４ ｍｌ水 和 ５０ ｍｌ 的三氯甲烷， 盖紧瓶塞， 提取 ３０ ｍｉｎ， 加 ５．０ ｇ 无水硫酸钠， 混匀， 过滤， 取滤液 ２５ ｍｌ 置于分液 漏斗 中， 沿管壁慢慢加入氢氧化钠溶液（４０ ｇ／ｌ）２０ ｍｌ， 并轻轻 转动 ２ ｍｉｎ， 静置分层， 弃去三氯甲烷层。向氢氧化钠溶 液层中加入 ３ ｍｌ 磷酸溶液（１＋１０）， 再用磷酸溶液（１＋１９）
异性抗体反应， 多余的游离抗体则与酶标板内的包被 抗原结合， 加入酶标记物和底物后显色， 与标准比较 来测定含量。 １．３．２ 样品处理
ａ： 称取过筛（ ２０ 目筛） 样品 ５．００ ｇ 置于 带塞 的 三 角 瓶 中， 加 入 ０．５ ｇ ＮａＣｌ， 加甲 醇水 （ １： １） ５０ ｍｌ 振摇 １０ ｍｉｎ， ８ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心 ２０ ｍｉｎ， 取上清液一定体积，
６．７９
样品名称 玉米酒精糟 ２７９０＃ 玉米蛋白粉 ３０１０＃ 玉米蛋白饲料 ２６９６＃
加标浓度（ μｇ／ｋｇ）
０．０５×１０３ ０．１×１０３ ０．２５×１０３ ０．０５×１０３ ０．１×１０３ ０．２５×１０３ ０．０５×１０３ ０．１×１０３ ０．２５×１０３
表 ３ 回收率试验结果
检出浓度（ ×１０３ μｇ／ｋｇ）
关键词 玉米副产物； 玉米赤霉烯酮； ＥＬＩＳＡ； 测定 中图分类号 Ｓ８１６．７
玉米赤霉烯酮（ Ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ， 又名 Ｆ－ ２、ＦＥＳ 或ＲＡＬ， 以下简称 ＺＥＮ） 是唯一由禾谷镰刀菌产生的非甾类雌 激素型毒素。ＺＥＮ 为白色晶体， 溶于氯仿、二氯甲烷、乙 腈、醇类和苯； 微溶于石油醚和正己烷； 几乎不溶于水， 但溶于碱性水溶液［１，２］。ＺＥＮ 对动物繁殖的影响是各国 普遍关注的问题， 主要引起动物雌激素亢进症， 导致动 物不孕或流产， 对猪、牛和羊影响较大， 给畜牧业带来 很大的经济损失［３， ４］。玉米、小麦和配合饲料污染 ＺＥＮ 的 报 告较 多， 此 外 ， 其它 麦 类、高 粱 、大 米 中 也 有 一 定
试样名称
玉米酒精糟 玉米蛋白粉 玉米蛋白饲料 玉米胚芽粕 玉米麸 玉米
表 ２ 玉米及其副产物经不同样品处理后， ＺＥＮ 测定结果（ μｇ／ｋｇ）
样品ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ理 ａ
测定结果 ５５０．１５￣４８６．２４ ８１２．６２￣７５３．６５ ７６７．２１￣８１４．４２ ６３８．６６￣７２５．１３ １１２．５４￣１２７．５５
表 １ 各标准浓度测得的吸光度值及比值
浓度 Ｃ（ μｇ／ｌ） ０ ０．５ １．０ ２．５ ５．０
１０．０ ２０．０
吸光度值
１．６４２ １．４５２ １．２２０ ０．９５５ ０．７３７ ０．５４８ ０．４５９
吸光度比值 Ａ／Ａ０（ ％） １００ ８８．４３ ７４．３０ ５８．１６ ４４．８８ ３３．３７ ２７．９５
来调节 ｐＨ 值（请用 ｐＨ 计来调节）至 ９．５ 左右， 然后加 入 ３０ ｍｌ 三氯甲烷振摇提取 ５ ｍｉｎ， 静置分层， 放出三 氯 甲 烷 层 至 蒸 发 皿 中 ， ６５ ℃水 浴 挥 干 ， ５０ ｍｌ 的 甲 醇 水（１： １）溶解残渣。摇匀， 稀释后作样品的待测液。 １．３．３ ＺＥＮ 标准溶液