转基因植物

第五章转基因植物

是指利用基因工程技术，在离体条件下，对不同生物的DNA进行加工，并按照人们的意愿和适当的载体重新组合，再将重载体转入受体中，并使其在体内表达的植物。

转基因植物通常具有高产优质、抗病虫、环境抗性、抗除草剂、耐储存、提高某些成分的含量等优良性状。

第一节植物转基因技术

一、植物细胞培养技术

植物组织培养的重要理论基础是植物细胞的全能性。植物细胞全能性(totipotency)，就是植物体细胞或性细胞，在人为控制的培养条件下都具有再生成新个体的潜能，因而在适宜的条件下可以被诱导生长分化形成完整植株。

二、植物转基因技术的基本路线

1.目的基因的分离

2.载体构建

3.导入细菌并利用细菌繁殖扩增重组DNA

4.对植物组织或细胞进行转化

5.植株再生

6.转基因植株的鉴定

7.转基因植株的种植

三、转基因的受体系统

1．植物组织受体系统：

受伤的细胞容易受到病毒或质粒的感染。这些病毒或质粒上的某些DNA通过各种不同的方式转移到受伤的植物细胞，并形成愈伤组织。愈伤组织可以培养成完整的转化植株。该受体系统转化率高，可获得较多的转化植株，取材广泛、适用性广。但再生植株无性系变异较大，转化的外源基因稳定性差，嵌合体多。

2．原生质体受体系统：

是植物细胞除去细胞壁后的部分，是一个质膜包围的“裸露细胞”。原生质体在合适的条件下具有分化、繁殖并再生成完整植株的能力，具有全能性。原生质体在体外比较容易完成一系列细胞操作或遗传操作，互相之间可以发生细胞融合，而且还可以直接高效的捕获外源基因，嵌合体少。但缺点是遗传稳定性差，培养周期长，难度大，再生频率低。

3．生殖细胞受体系统：

它是以植物生殖细胞如花粉细胞、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统。目前主要以两条途径利用生殖细胞进行基因转化：一是利用组织培养技术进行花粉细胞和卵细胞的单倍体培养，诱导愈伤组织细胞，进一步分化发育成单倍体植株，从而建立单倍体的基因转化系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法、花粉粒浸泡法、子房微针注射法等。由于该受体系统与其它受体系统相比有许多优点，如：具有全能性的生殖细胞直接为受体细胞，具有更强的接受外源DNA的潜能，一旦将外源基因导入这些细胞，犹如正常的受精过程会收到“一劳永逸”的效果；利用植物自身的受粉过程，具有操作方法方便、简单。不足之处是利用该受体系统进行转化受到季节的限制；只能在短暂的开花期进行，且无性繁殖的植物不能采用。

4.叶绿体转化系统

外源基因可以在叶绿体中得到稳定表达，而且还具有许多优点：

（1）便于外源基因定位整合

（2）基因为多拷贝，表达量高

（3）导入的外源基因性状稳定性高

（4）能直接表达原核基因

四、外源基因导入植物的方法

（一）DNA直接转移法

1.化学刺激法

植物原生质体借助一些化学试剂（如PEG、氯化钙等）的诱导能吸收外源DNA、质粒等遗传物质，并有可能整合到植物染色体上去。

此法对细胞伤害少，可避免嵌合体产生，易于选择转化体，受体细胞不受种类限制。

2.电击法

首先是将原生质体在溶液中与DNA混合，利用高压电脉冲作用在原生质体膜上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果，现在这一方法已被广泛用于各种单、双子叶植物中，特别是在禾谷类作物中更有发展潜力。不但原生质体而且完整的单细胞也可利用此法，这对于那些难以从原生质体再生植株的植物或许有更大意义。

3.显微注射法

显微注射进行基因转化是一种比较经典的技术，其理论和技术方面的研究都比较成熟。特别在动物细胞或卵细胞的基因转化，核移植及细胞器的移植方面应用很多，并已取得重要成果。植物细胞的显微注射在以前使用很少，但近年来发展很快，并在理论技术上有所创新。

4.基因枪法

克莱因（Klein）等1987年首次用基因枪轰击洋葱上表皮细胞，成功地将包裹了外源DNA的钨弹射入其中，并实现了外源基因在完整组织中的表达。这一方法要使用一种防枪结构的装置——基因枪，枪管的前端是封口的，上面只有直径1mm左右的小孔，弹头不能通过。其具体操作是将直径4um左右的钨粉或其它重金属粉在外源DNA中形成悬浮液，则外源DNA会被吸附到钨粉颗粒的表面，再把这些吸附有外源遗传物质的金属颗粒装填到圆筒状弹头的前端，起爆后，弹头加速落入枪筒，在枪筒口附近被挡住，而弹头前端所带的钨粉颗粒在惯性作用下脱离弹头，以高速通过1mm的小孔直接射入受体，其表面吸附的外源DNA 也随之进入细胞。也可以用高压放电或高压气体使金属粒子加速。

5.脂质体介导法

脂质体是由磷脂组成的膜状结构，将磷脂悬浮在水中，在适当条件下，受到高能声波处理时，磷脂分子群集在一起形成密集的小囊泡状结构，称为脂质体。用脂质体包裹一些DNA、RNA分子就成了一种人工模拟的原生质体，它的外膜相当于人造的细胞质膜。然后与植物原生质体共保温，于是脂质体与原生质体膜结构之间发生相互作用，而后通过细胞的内吞作用而将外源DNA 导入植物的原生质体。这种方法具有许多方面的优点，包括可保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用，降低了对细胞的毒性效应，适用的植物种类广泛，重复性高，包装在脂质体内的DNA可稳定地贮藏等。

6.微激光束法

是利用激光脉冲引起细胞膜可逆性穿孔，从而将外源DNA导入受体细胞。

可在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源替代荧光光源，使细胞壁被击穿，外源DNA进入受体细胞。

7.花粉管通道法

这种方法最早是由周光宇1983年建立。花粉管通道法是将外源的DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，使外源DNA沿花粉管通道进入胚囊，转化受精卵或其前后细胞，转化率高达10%。这一方法的建立开创了整株活体转化的先例，可以应用于任何开花植物。

（二）农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化

人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，该病在法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发生。1907年Smith 和Townsent等首先发现这种冠瘿瘤病是由根癌农杆菌引发的。

1974年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于200kb），称为Ti质粒。

1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌Ti质粒的一个片段，称为T-DNA（Transfer-DNA）。实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代，Ti质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重要基础。

Ti质粒为根癌农杆菌核外的一种环状双链DNA分子，长约200Kb。其中含有一段称为T-DNA的可转移区段，当农杆菌侵染寄主细胞后，T-DNA可以从农杆菌转移到寄主细胞内并整合到寄主细胞的基因组中。Ti质粒的这一特性为农杆菌介导法植物转基因奠定了基础。

T-DNA的长约23Kb，在其两端各有一个25bp左右的正向重复序列，称之为T-DNA的边界序列。在不同的农杆菌Ti质粒上该序列高度保守，一般认为右端重复序列对T-DNA的转移起决定性作用。