分子生物学研究方法(下)概论

第六章

分子生物学研究法（下）——基因功能研究技术

基因功能的研究思路主要包括:

1. 基因的亚细胞定位和时空表达谱;

2. 基因在转录水平的调控；

3. 细胞生化水平的功能研究：对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位；

4. gain-of-function & loss-of-function: 分别在细胞和个体水平，做该基因的超表达和敲除，从表型分析该基因的功能。

功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究，综合分析。

本章内容

¾基因表达研究技术

¾基因敲除技术

¾蛋白质及RNA相互作用技术¾基因芯片及数据分析

¾利用酵母鉴定靶基因功能¾其他分子生物学技术

6.1 基因表达研究技术

6.1.1 基因表达系列分析技术6.1.2 RNA的选择性剪接技术6.1.3 原位杂交技术

6.1.4 基因定点突变技术

6.1.1 基因表达系列分析技术

基因表达系列分析技术（serial analysis of gene expression，SAGE）是1995年由Velculescu 等建立的技术，在整体水平上对细胞或者组织中的大量转录本同时进行定量分析，而无论其是否为已知基因。

9概念：

以DNA测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术，能直接读出任何一种细胞类型或组织的基因表达信息。

9原理：

根据理论上任何长度超过9～10(49=262144)个碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特异序列（转录本），因此，选择特定的限制性内切酶分离转录产物中这些代表基因特异性9～10个碱基的核苷酸序列并制成标签，将这些序列标签连接、克隆和测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。

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9Long SAGE技术:

标签来自转录物3’端一段21bp的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。其原理与ShortSAGE方法类似，只是用了不同的IIS类标签酶（Mme I），并将程序做了相应修改。

6.1.2 RNA选择性剪切

9概念

指用不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。

外显子遗漏

相互排斥剪切

5’选择性剪切

3’选择性剪切

平衡剪切

图6-3 RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切

图6-4果蝇（Drosophila melanogaster）的Dscam基因可以通过可变剪接产生38000多

种可能的mRNA异构体

6.1.3 原位杂交技术

9概念

用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。9分类

RNA原位杂交技术

染色体原位杂交技术

RNA原位杂交技术

9原理：是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度和离子强度等）可按碱基互补原则退火（annealling）形成双链的过程。这一杂交过程具有高度的特异性。

9待测的核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞mRNA。

9用于检测的已知核酸片段称之为探针（probe）。常用的标记物包括放射性标记和非放射性标记物两大类。

负对照，mRNA的同义链，无杂交信号。正对照，UBQ10杂交信号遍布于整个胚珠。

mRNA的互补链，杂交信

号集中于纤维细胞中。

图6-5 用组织原位杂交技术检测棉花纤维特异基因的表达

荧光原位杂交技术FISH

（fluorescence in situ hybridization）

FISH的是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点。

目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。

荧光原位杂交

荧光原位杂交显示的着丝粒卫星DNA 荧光原位杂交显示的端粒

6.1.4 定点突变技术

¾概念：

定点突变（site－directed mutagenesis）是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个（些）氨基酸残疾对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、维修表达载体、引入新的酶切位点等。

9类型:

体外定点突变的具体方法有三种：

（1）寡聚核苷酸介导的定点突变；

（2）双引物法定点突变（重叠延伸技术）；（3）大引物诱变法。

以上三种方法虽不同，但原理都一致。

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目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变。

9PCR介导的定点突变方法的优势:

1.突变体回收率高;

2.能用双链DNA作为模板，可在任何位点引

入突变;

3.可在同一试管中完成所有反应;

4.快速简便。

基因表达系列分析技术

外显子遗漏相互排斥剪切

5’选择性剪切3’选择性剪切

平衡剪切

选择性剪切的几种类型