分子生物学研究方法(下)概论
5分子生物学研究方法-精选文档116页
ddGTP
ddGAC-5'
5'-AdAdCGTAGCCGTAGC--35''3+6
2019/10/31
dNTP ddTTP
5'-AACTGCTG-3' ddTGACGAC-5'
5'-AACTGCTG-3' ddTTGACGAC-5'
7+8
18
3’ 5’
AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5’
2019/10/31
3
2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复 制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；
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Rosalind Franklin
X-ray source
Crystallized DNA
Photographic film
Maurice Wilkins
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优点：i. 四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间； ii. 可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影； iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。
Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline
Only cells with recombinant plasmid survive to produce colonies
Herbert Boyer
13
General process of gene engineering
SV40 DNA
8
几百碱基对长短的DNA片段适于进行精细的物理图谱以及DNA序列分析等；因此 常选用切点较多的识别限制性内切酶通常产生1一10kB长短的限制性寸段 ，适于进行较长的DNA分子的物理图谱和包括内含子．结构基因以及调控序列 在内的完整基因的克隆；
大学分子生物学经典课件第七章 分子生物学的研究方法-114页PPT文档资料
19.10.2019
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第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模 型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制 和世代交替问题；
第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心 法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码， 阐明了遗传信息的流动与表达机制。
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3
但是：
当时由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子 的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生 化分析。随着DNA分子体外切割与连接技术及 核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组 DNA技术的产生与发展。
聚合时，由单体丙烯酰胺聚合成链状物，由 交联剂甲叉双丙烯酰胺将链与链交联成网状，形 成立体的不溶于水的凝胶。
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特点：分辨能力高，但应用范围小，适用于较小 分子的分析。适于分离 5 bp ~ 500 bp 的 DNA 片段。操作复杂。
核酸分子的染料
溴化乙锭（EB），因具有扁平分子的空间结构， 能插入到 DNA 分子或 RNA 分子的相邻碱基之间， 并在300nm 波长的紫外光照射下发出荧光。
（一） 基本原理： 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无
反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺 凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极 移向正极。根据核酸分子大小不同、构型的差异， 以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中 的不同成分彼此分开。
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电泳迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度。 与电场强度和电泳分子所带的净电荷成正比。 与分子的摩擦系数成反比，摩擦系数是分子大小、 极性及介质粘度的函数。 支持介质：稳定，无反应活性；
第七章 分子生物学研究方法
第一节 重组DNA技术回顾 第二节 DNA基本操作技术 第三节 RNA基本操作技术 第四节 SNP的理论与应用 第五节 基因克隆技术 第六节 蛋白质组与蛋白质组学技术
分子生物学第九章--分子生物学研究方法电子教案精选全文
可编辑修改精选全文完整版•第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。
本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。
电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。
从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。
分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
分子生物学研究方法
分子生物学研究方法
首先，核酸提取与分析是分子生物学的基础。
通过从生物体细胞中提
取核酸，可以获得DNA和RNA的样本，为后续的实验提供原料。
核酸的分
析方法包括凝胶电泳和聚合酶链式反应（PCR）等。
凝胶电泳可以根据核
酸分子的大小和电荷差异进行分离，从而获得目标核酸的纯度和浓度信息。
PCR是一种体外扩增DNA的方法，可以在短时间内从少量的DNA模板扩增
到大量的DNA产物，为后续实验提供更多的材料。
其次，蛋白质的表达与纯化是分子生物学的另一个重要研究方法。
蛋
白质是生物体内功能的执行者，因此研究蛋白质的表达与功能对于揭示生
命活动的机理具有重要意义。
蛋白质的表达通常利用重组DNA技术，将目
标基因克隆到可表达载体中，并转化到细菌或其他表达系统中。
随后，通
过诱导表达、细胞破碎、蛋白质纯化等步骤，最终获得目标蛋白质的产物。
蛋白质的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等多种方法，
可以根据蛋白质的性质和特点选择合适的方法进行纯化。
另外，生物信息学和计算生物学方法也是分子生物学研究的重要手段。
随着DNA测序技术的快速发展，大规模的基因组、转录组和蛋白质组数据
被不断积累，因此需要开发合适的计算方法进行存储、管理和分析这些数据。
生物信息学和计算生物学的研究方法涉及到生物数据库的建立和维护、序列比对、基因和蛋白质结构预测、分子动力学模拟等等。
这些方法可以
帮助研究人员更好地理解和分析分子生物学数据，从而揭示生命活动和疾
病发生发展的机理。
分子生物学研究法.
免疫共沉淀技术 将靶蛋白的抗体连接到固体 基质上，再将可 能与靶蛋 白发生相互作用的待筛选蛋 白加入 反应体系中，用低 离心力沉淀或微膜过滤法 在固体基质和抗体的共同作 用下将蛋白复合 物沉淀到 试管的底部或微膜上。
2019/2/4 31 南京农业大学 生命科学学院
研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引 发与之互补的 单链RNA（ssRNA, single- stranded RNA）的降解。
经过Dicer（一种具有RNAase III活性的核酸 酶）的加工 ，细胞中较长的双链 RNA （ 30 个核苷酸以上）首先被降 解形成21～25个核苷 酸的小分子干扰核糖核酸（siRNA ，short interfering RNA ），并有效定位目标 mRNA。
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南京农业大学 生命科学学院
第三节 蛋白质及RNA相互作用技术
1. 酵母单杂交系统
酵母单杂交系统是上世纪 90年代中发展起来的研究 DNA蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于 DNA 上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核生物中 DNA-蛋白。 将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（ Pmin）的上 游，把报告基因连接到 Pmin下游。将编码待测转录因子 cDNA 与已知酵母转录激活结构域（ AD ）融合表达载体 导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结 合，就能激活 Pmin启动子，使报告基因得到表达。
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南京农业大学 生命科学学院
第三节 蛋白质及RNA相互作用技术
5. RNAi（RNA干涉）技术及其应用
RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解 细胞内同源 mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表 型。RNAi的命名来源于安德鲁· 法尔1998年在《自然》杂 志上的 论文。
第6章 分子生物学研究方法(下)
④具有良好的机械性能
非特异吸附少
4.2 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
（2）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到 固相支持物上。
（3）真空转移法
此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝
胶在上的方式将其放臵在一个真空室上，利用真空作用
将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真 空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或
硝酸纤维素膜上。
各种转移方法的比较：
6.1.2 RNA选择性剪接技术
RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前 体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。可分为：平衡剪 切、 5’ 选择性剪切、 3’ 选择性剪切、外显子遗漏型剪切及 相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基 因是否存在 选择性剪切。 果蝇 Dscam 基 因可 以通过可变 剪接产生38000多 种 可 能 的 mRNA 异构体
Illumina Solexa 测序 Workflow
Illumina Sequencing Technology
有参考基因组序列生物信息分析
• 基因结构优化
• 鉴定基因可变剪接 • 预测新转录本 • SNP 分析 • 基因融合鉴定
5.4.1 RACE 法克隆基因全长 (Rapid Amplification of cDNA Ends)
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
第五章分子生物学研究方法20220313230.pptx
❖跨越天然物种屏障、把来自任何生 物的基因置于毫无亲缘关系的新的 寄主生物细胞之中的能力，是基因 工程技术区别于其他技术的根本特 征。本章将在回顾重组DNA技术史 上主要事件的基础上，讨论DNA操 作技术、基因克隆的常用载体系统 以及基因的分离与鉴定等3个环节。
5·1 重组DNA技术史上的重大事件
❖ 他们还发现，EcoRl酶切产生的任何不 同来源的DNA片段能通过粘性末端之间 碱基互补作用而彼此“粘合”起来。
❖ 此后，大量类似于EroRl但具有独特识 别序列的核酸内切酶被陆续发现。到目 前为止，科学家已经几乎能随心所欲地 把任何DNA分子切割成一系列不连续的 片段，再利用凝胶电冰技术将这些片段 按照分子量大小逐一分开，以供下一步 研究。
❖ DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列 分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的 产生和发展。
❖ 重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和 DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。 这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史 上最重要的事件。限制性核酸内切酶能从特 定碱基序列位点切开DNA。1972，Boyer实 验室发现核酸内切酶EcoRI能特异识别 GAAUC序列，将DNA在这个位点切开产生 具有粘性末端的小片段。
第五章 分子生物学研究方法
❖ 2·琼脂糖凝胶电泳 ❖ 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂
糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成 良好的电泳介质。经过化学修饰的低熔 点琼脂糖，在较低的温度下便会熔化， 常用于DNA片段的制备电泳。
《分子生物学研究法》PPT课件
1 用T4 DNA聚合酶除去PCR产物3’端多余的 核苷酸，成为平端后连接。
2 给平端载体的两个3’端各加上一个T，使 其与3’A突出的PCR产物互补，然后连接。
PCR产物与载体的A-T连接
mRNA
差 别 显 示
利 用
PCR
的
定
点
引物1或引物2的 5’端有不与模板
突
互补的突变。
变
利用PCR的定点突变
在循环温度的设定中，最重要的是退火温度。 退火温度较低可提高扩增效率，但产物的特异性较差； 退火温度较高可提高产物的特异性，但扩增效率较低。
嵌套PCR
( nested PCR)
嵌套PCR主要是为了提 高扩增产物的特异性。
嵌套PCR提高产物特异性的原理
单用第一对引物扩增，得一特异性产物和可能存在的非特异性产物。
循环条件的设定
变性---------→退火----------→链延伸
循环条件举例
循环 首轮循环 中间循环 末轮循环
变性 94℃ 5 min 94℃ 1 min 94℃ 1 min
退火 50℃ 2 min 50℃ 2 min 50℃ 2 min
链延伸 72℃ 3 min 72℃ 3 min 72℃10min
荧光定量PCR
1995年美国PerKin Elmer公司研制成功具有 革 命 性 意 义 的 荧 光 定 量 PCR 技 术 ， 它 融 合 了 PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技 术的高精确定量等优点。荧光定量PCR是直接 探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的 结 果 ， 不 需 要 PCR 后 处 理 或 电 泳 检 测 ， 完 全 闭 管操作，在整个过程中，仅有加入样品的一次开 盖。
【教学课件】第六章 分子生物学研究法下
2021/6/18
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Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切 除)持性：即Cre 在哪一种组织细胞中表达， 靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞； 而Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织 细胞中进行修饰的效率。
基因敲除是为了使某一基因失去其 生理功能，所以一般设计为替换型载 体
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2021/6/18
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ES 细胞的获得： 现在基因敲除一般采用是胚胎干
细胞，最常用的是鼠，而兔，猪， 鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂 合体，因为这类小鼠具有自发突变 形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是 基因敲除的理想实验动物。而其他 遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被 发展应用。
反向遗传学是一条由里及表的认知路线，即 通过DNA重组等技术有目的地、精确定位地 改造改造基因的精细结构以确定这些变化对表 型性状的直接影响。
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利用同源重组构建基c因o敲nt除e动nt物模型的基本步骤
基因载体的构建： 把目的基因和与细胞内靶基因特异
片段同源的DNA 分子都重组到带有 标记基因(如neo 基因，TK 基因等) 的载体上，成为重组载体。
每一种接头都含有标签酶(Tagging Enzyme TE)酶切位点序列(标签酶是 一种Ⅱ类限制酶，它能在距识别位点 约20碱基的位置切割DNA双链)。
接头的结构为引物A/B序列+标签 酶识别位点+锚定酶识别位点。
第六章：分子生物学研究方法(下全文编辑修改
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交
4. 基因定点突变技术
• 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码 的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨 基酸残基 对蛋白质结构功能的影响。
二、基因敲除技术
• 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通 过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行 精确的定点修饰和基因改造。
方法: • 以9~11bp作为标签（tag）＝49＝262144组合 • 串联tag并通过两端接头PCR扩增 • 扩增产物进行测序 • 每个tag通过Genebank或EST数据库进行比对 • 确认tag代表的基因表达情况
2. RNA的选择性剪接从一个 mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。
2.凝胶阻滞试验 ➢ 是用于研究DNA与蛋白质相互作用的一种
特殊的凝胶电泳技术。
➢ 当DNA与蛋白质结合时，在电泳中会受到阻滞， 说明可能与某种特殊蛋白结合了。
3. DNAase足迹试验 ➢ 蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被
DNAase水解，电泳中对应于结合部位没有条带。
• 常用RT-PCR法研究某个基因是否存在选择性剪切。
3.原位杂交技术( In Situ Hybridization，ISH)
• 用标记的核酸探针，在组织、细胞上对核酸进行 定位和相对定量研究的一种手 段。
• 探针标记用同位素或地高辛、生物素荧光标记等。
地
同
高
位
辛
素
标
标
记
记
染色体原位杂交
三、蛋白质与RNA、DNA相互作用
1. 酵母单杂交系统 • 将待测转录因子cDNA与表达载体导入酵母细胞，
该基因产物如 果能够与顺式作用元件相结合，就 能激活启动子，使报告基因得到表达。
6 分子生物学研究方法
噬菌体展示技术
• 噬菌体是细菌病毒的总称，有“吞噬”之意。
• 烈性噬菌体：在溶菌周期，噬菌体将其感染的宿主细胞转变成为噬菌体的
“制造厂”，产生出大量的子代噬菌体颗粒。 • 温和噬菌体：溶源生长周期是指噬菌体DNA被整合到宿主细胞染色体DNA 上，成为它的一个组成部分，感染过程中不产生子代噬菌体颗粒。
后来对RNA的印迹分析称Northern印迹法
对单向电泳后蛋白质的印迹分析称Western印迹法 对双向电泳后蛋白质的印迹分析称Eastern印迹法
蛋白质免疫印迹的基本原理： 将通过PAGE分离的蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上。 然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应。 洗涤去除没有结合的特异性抗体后。 加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去 除非特异性结合的标记抗体。 加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现。
步骤： 用放射性同位素标记待测的DNA片段
探针DNA与细胞提取物共温育，形成DNA-蛋白质复合物
复合物加到非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳 若提取物中不含有与探针DNA作用的蛋白质，则放射性标记出现在凝胶的
底部；否则出现在凝胶的不同位置
步骤示意图
结果
拟南芥转录因子At5g11590与不 同DNA元件有不同的结合能力。
分子生物学研究方法(下)核酸分子杂交技术
增色效应（ 增色效应（二）
• 增色效应可以作为DNA变性的指标 增色效应可以作为DNA DNA变性的指标 • 不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌 不同来源DNA的变化不一， DNA的变化不一 DNA经热变性后 经热变性后， 260nm的吸光度值 DNA经热变性后，其260nm的吸光度值 可增加40%以上，其它不同来源的DNA 可增加40%以上，其它不同来源的DNA 40%以上 溶液的增值范围大多在20 30%之间 20－ 之间。 溶液的增值范围大多在20－30%之间。
DNA变性曲线（二）
6.DNA的复性 6.DNA的复性
• 复性概念： （1）复性概念：指变性 DNA 在适当条 件下， 件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双 螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。 螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。 热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性， 热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性， DNA一般经缓慢冷却后即可复性 此过程称之为“ 退火” annealing）。 此过程称之为“ 退火”（annealing）。
2）DNA的（G+C）含量 DNA的 G+C）
• 在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于 在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于 DNA分子中的 G+C）的含量。 分子中的（ DNA分子中的（G+C）的含量。 • （G+C）含量越高，G-C 碱基对越多，Tm值越 G+C）含量越高， 碱基对越多，Tm值越 高。因G-C碱基对具有3对氢键，而A-T碱基对 碱基对具有3对氢键， 只有2对氢键，DNA中 G+C） 只有2对氢键，DNA中（G+C）含量高显然更能 增强结构的稳定性， 间氢键需比A 增强结构的稳定性，破坏 G-C间氢键需比A-T 氢键付出更多的能量， G+C）含量高的DNA DNA， 氢键付出更多的能量，故（G+C）含量高的DNA， 其变性Tm也高。 Tm也高 其变性Tm也高。
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第六章
分子生物学研究法（下）——基因功能研究技术
基因功能的研究思路主要包括:
1. 基因的亚细胞定位和时空表达谱;
2. 基因在转录水平的调控；
3. 细胞生化水平的功能研究：对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位；
4. gain-of-function & loss-of-function: 分别在细胞和个体水平，做该基因的超表达和敲除，从表型分析该基因的功能。
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究，综合分析。
本章内容
¾基因表达研究技术
¾基因敲除技术
¾蛋白质及RNA相互作用技术¾基因芯片及数据分析
¾利用酵母鉴定靶基因功能¾其他分子生物学技术
6.1 基因表达研究技术
6.1.1 基因表达系列分析技术6.1.2 RNA的选择性剪接技术6.1.3 原位杂交技术
6.1.4 基因定点突变技术
6.1.1 基因表达系列分析技术
基因表达系列分析技术（serial analysis of gene expression，SAGE）是1995年由Velculescu 等建立的技术，在整体水平上对细胞或者组织中的大量转录本同时进行定量分析，而无论其是否为已知基因。
9概念：
以DNA测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术，能直接读出任何一种细胞类型或组织的基因表达信息。
9原理：
根据理论上任何长度超过9～10(49=262144)个碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特异序列（转录本），因此，选择特定的限制性内切酶分离转录产物中这些代表基因特异性9～10个碱基的核苷酸序列并制成标签，将这些序列标签连接、克隆和测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。
8
9Long SAGE技术:
标签来自转录物3’端一段21bp的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。
其原理与ShortSAGE方法类似，只是用了不同的IIS类标签酶（Mme I），并将程序做了相应修改。
6.1.2 RNA选择性剪切
9概念
指用不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。
外显子遗漏
相互排斥剪切
5’选择性剪切
3’选择性剪切
平衡剪切
图6-3 RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切
图6-4果蝇（Drosophila melanogaster）的Dscam基因可以通过可变剪接产生38000多
种可能的mRNA异构体
6.1.3 原位杂交技术
9概念
用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。
9分类
RNA原位杂交技术
染色体原位杂交技术
RNA原位杂交技术
9原理：是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度和离子强度等）可按碱基互补原则退火（annealling）形成双链的过程。
这一杂交过程具有高度的特异性。
9待测的核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞mRNA。
9用于检测的已知核酸片段称之为探针（probe）。
常用的标记物包括放射性标记和非放射性标记物两大类。
负对照，mRNA的同义链，无杂交信号。
正对照，UBQ10杂交信号遍布于整个胚珠。
mRNA的互补链，杂交信
号集中于纤维细胞中。
图6-5 用组织原位杂交技术检测棉花纤维特异基因的表达
荧光原位杂交技术FISH
（fluorescence in situ hybridization）
FISH的是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。
荧光原位杂交
荧光原位杂交显示的着丝粒卫星DNA 荧光原位杂交显示的端粒
6.1.4 定点突变技术
¾概念：
定点突变（site－directed mutagenesis）是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个（些）氨基酸残疾对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、维修表达载体、引入新的酶切位点等。
9类型:
体外定点突变的具体方法有三种：
（1）寡聚核苷酸介导的定点突变；
（2）双引物法定点突变（重叠延伸技术）；（3）大引物诱变法。
以上三种方法虽不同，但原理都一致。
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目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变。
9PCR介导的定点突变方法的优势:
1.突变体回收率高;
2.能用双链DNA作为模板，可在任何位点引
入突变;
3.可在同一试管中完成所有反应;
4.快速简便。
基因表达系列分析技术
外显子遗漏相互排斥剪切
5’选择性剪切3’选择性剪切
平衡剪切
选择性剪切的几种类型
寡核苷酸介导的DNA突变技术
重叠延伸诱变法示意图
图
6.2 基因敲除技术
6.2.1基本原理
经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，
进而找出该基因的编码序列。
现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表
现型，进而推导出该基因的功能。
9概念：
基因敲除技术（gene knockout)又称基因打靶（gene targeting）。
这种技术是通过基因工程的方法将一个结构已知但功能未知的基因去除，或用其他序列相近的基因取代（又称基因敲入），然后从整体观察实验生物，从而推测相应基因的功能。
这种人为地把实验生物某一种有功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。
基因打靶的必备条件
打靶需要两个必备条件：一是子弹，二是靶子。
同样的，基因打靶也需要其必备条件：一是要有将外源基因导入宿主细胞的载体；另一种就是能接受外源基因的受体。
9基因敲除分为：
完全基因敲除：是指通过同源重组法完全消除细胞或者生物个体中的靶基因活性。
条件型基因敲除：又称不完全基因敲除，是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。
噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
1. 完全基因敲除
图6-9用取代型（a）或插入型
（b）载体进行完全基因敲除实验
图6-10正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞
由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率约为10-2～10-5，植物的概率为10-4～10-5，即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞中筛选出真正发生了同源重组的胚胎干细胞，得用多种分子筛选技术验证所获得的确实是目的基因被敲除的细胞系。
2. 条件型基因敲除
①构建条件型基因敲除打靶载体，将正向选择标记neo置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要功能域两侧内含子中插入同向LoxP位点。
②需要消除靶基因活性时，与带有Cre重组酶基因的ES细胞杂交，Cre可把两个LoxP位点间的DNA片段切除，导致靶基因失活。
也可用Cre表达质粒转染靶ES细胞，通过重组将两个LoxP位点间序列删除（包括neo基因）。
图6-11 条件型基因敲除策略
基因敲除技术的应用：
1、研究基因调控和基因功能；
2、建立人类疾病的转基因动物模型，为医
学研究提供材料；
3、改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新
功能，研究发育生物学；
4、治疗遗传病，即基因治疗。
5、改造生物、培育新的生物品种。
6.2.2 高等动物基因敲除技术
真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。
显微注射命中率较高，技术难度相对大些。
电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。
胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。
图6-12模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。