小鼠瘦素LEP试剂盒使用方法
ELISA检测试剂盒操作流程
ELISA检测试剂盒操作流程1.准备实验材料和试剂-检验样本：例如血清、尿液、细胞上清液等。
-ELISA试板：根据样本数量选择96孔或384孔的板。
- 试剂盒：包括标准品、washes缓冲液、检测抗体、底物等。
2.样本处理-对于血清等生物液体样本，可用离心将固体物质沉淀并分离下清液。
-样本需储存或运输途中应避免反复冻融。
3.实验板的板液处理-将实验板从包装中取出，将不需要的孔进行盖膜封闭。
- 根据试剂盒说明书，添加适量的板液（Coating Buffer）到每个孔中，使其充分覆盖孔内壁。
-封闭板液的孔，将实验板在2-8℃下放置静置一夜或在37℃下1-2小时孵育。
4.样本添加-倒掉盘液，用PBS或TBST洗板3次，去除残留物。
-将样本加到每个孔中，根据需要添加正样本、负样本和待测样本。
-注意每个样本的剂量和添加的体积，通过试剂盒说明书和实验设计标准控制。
5.抗体添加-清洗步骤同上，将洗板缓冲液加到孔中，重复3次。
-加入检测抗体，根据试剂盒说明书的建议将其添加到孔中。
-要确保抗体的浓度和添加的体积适宜。
6.洗涤-洗涤步骤同上，用洗涤缓冲液洗板，重复3次。
-每次洗涤时，将洗液完全加满孔，静置1分钟，然后倒出洗液。
-注意洗涤时间和洗涤次数的准确控制，以将非特异性结合物质彻底清除。
7.底物添加-清洗步骤同上，将洗液加到孔中，重复3次。
-加入底物，根据试剂盒说明书的建议将其添加到孔中。
-底物液体应完全覆盖孔底，防止反应过程中氧化。
8.反应停止-根据试剂盒说明书，将反应停止液加入到孔中，停止底物的反应。
-注意反应停止液的体积和浓度，以保证反应的准确停止。
9.色谱分析-用ELISA板读板仪读取各个孔的OD值。
-根据试剂盒说明书和实验设计的标准曲线确定样本中目标物质的含量。
-注意设置适当的控制组和标准曲线来保证测量结果的准确性。
总结：ELISA检测试剂盒的操作流程主要包括实验板处理、样本添加、抗体添加、洗涤、底物添加、反应停止和色谱分析。
小鼠红细胞生成素(EPO)酶联免疫分析试剂盒 说明书
小鼠红细胞生成素（EPO）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用检测范围：1.56ng/ml-100ng/ml特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的小鼠EPO，且与其他相关蛋白无交叉反应。
有效期：6个月预期应用：ELISA法定量测定小鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中EPO 含量。
说明1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗EPO抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗EPO抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。
TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的EPO呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制1.酶联板（Assay plate）：一块（96孔）。
2.标准品（Standard）：2瓶（冻干品）。
3.样品稀释液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。
4.生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5.辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6.生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）7.辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）8.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9.浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
Elabscience 未包被小鼠白介素1β(IL-1β)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书
（本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断！）产品货号：E-UNEL-M0064产品规格：96T*5/96T*15Elabscience®未包被小鼠白介素1β(IL-1β)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书Uncoated Mouse IL-1β(Interleukin 1 Beta) ELISA Kit使用前请仔细阅读说明书。
如果有任何问题，请通过以下方式联系我们：销售部电话************，************技术部电话************具体保质期请见试剂盒外包装标签。
请在保质期内使用试剂盒。
联系时请提供产品批号(见试剂盒标签)，以便我们更高效地为您服务。
用途该试剂盒用于体外定量检测小鼠血清、血浆样本中IL-1β浓度。
试剂盒组成及保存试剂体积以实际发货版说明书为准。
相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取而非直接倒出。
其他所需试剂ELISA辅助组分试剂盒(Ancillary Reagent Kit，货号：E-ELIR-K001)：包含完成96T*5规格ELISA实验的全套辅助试剂。
或有其他实验需求，可单独购买以下辅助试剂产品：或自行配制指标通用性辅助试剂。
(注：下列配方均为各试剂的基础组分，可根据实验需求和实验结果对配方进行优化)●包被液：1xCBS●封闭液：1xPBS，保护性蛋白●洗涤液：3%Tris●样本稀释液：1xPBS, 保护性蛋白●抗体/酶结合物稀释液：1xPBS, 保护性蛋白●终止液：5%硫酸试验所需自备物品1.酶标仪(450 nm波长滤光片)2.高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL3.37℃恒温箱4.双蒸水或去离子水5.吸水纸6.加样槽样品收集方法(具体处理方法可参考官网：/List-detail-241.html) 1.血清：全血样品于室温放置1小时或2-8℃过夜后于2-8℃，1000×g离心20分钟，取上清即可检测。
雷生物小鼠胰岛素ELISA试剂盒使用手册说明书
RayBio® Mouse Insulin ELISA KitCatalog #: ELM-InsulinUser ManualLast revised June 14, 2021Caution:Extraordinarily useful information enclosedISO 13485 Certified3607 Parkway Lane, Suite 100Norcross, GA 30092 Tel: 1-888-494-8555 (Toll Free) or 770-729-2992, Fax:770-206-2393Web: , Email: *******************RayBiotech, Inc.________________________________________RayBio® Mouse Insulin ELISA Kit ProtocolTable of ContentsSection Page # I.Introduction3II.Storage4III.Reagents4IV.Additional Materials Required4V.Reagent Preparation5VI.Assay Procedure6VII.Assay Procedure Summary7VIII.Calculation of ResultsA. Typical DataB. SensitivityC. Spiking & RecoveryD. LinearityE. Reproducibility 8 8 8 9 9 10IX.Specificity10X.Troubleshooting Guide11Please read the entire manual carefully before starting your experimentI. INTRODUCTIONThe RayBio® Mouse Insulin ELISA kit is an in vitro enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative measurement of Mouse Insulin in serum, plasma (Collect plasma using EDTA and Citrate as an anticoagulant. Heparin is not recommended as anticoagulants for use in this assay) and cell culture supernatants. This assay employs an antibody specific for Insulin coated on a 96-well plate. Standards and samples are pipetted into the wells and Insulin present in a sample is bound to the wells by the immobilized antibody. The wells are washed and biotinylated anti-Mouse Insulin antibody is added. After washing away unbound biotinylated antibody, HRP-conjugated streptavidin is pipetted to the wells. The wells are again washed, a TMB substrate solution is added to the wells and color develops in proportion to the amount of Insulin bound. The Stop Solution changes the color from blue to yellow, and the intensity of the color is measured at 450 nm.Need your results faster? Try RayBiotech's SpeedE LISA platform for quantitative detection in just three hours.https:///speedelisa-kits/Short on sample, or need higher sensitivity? Check out the IQELISA™ Immuno-PCR platform. https:///immuno-pcr/II. STORAGEThe entire kit may be stored at -20°C for up to 1 year from the date of shipment. Avoid repeated freeze-thaw cycles. The kit may be stored at 4°C for up to 6 months. For extended storage, it is recommended to store at -80°C. For prepared reagent storage, see table below. III. REAGENTSIV. ADDITIONAL MATERIALS REQUIRED1.Microplate reader capable of measuring absorbance at 450 nm.2.Precision pipettes to deliver 2 µl to 1 ml volumes.3.Adjustable 1-25 ml pipettes for reagent preparation.4.100 ml and 1 liter graduated cylinders.5.Absorbent paper.6.Distilled or deionized water.7.Log-log graph paper or computer and software for ELISA data analysis.8.Tubes to prepare standard or sample dilutions.V. REAGENT PREPARATION1.Bring all reagents and samples to room temperature (18 - 25ºC) before use.2.Assay Diluent B (Item E) should be diluted 5-fold with deionized or distilled water before use.3.Sample dilution: Assay Diluent C (Item L) should be used for dilution of serum, plasma, and cell culture supernatant samples. The suggested dilution for normal serum/plasma is 2 fold. Collect plasma using EDTA and/or Citrate as anticoagulants. Heparin is not recommended as an anticoagulant for use in this assay. Note: Levels of Insulin may vary between different samples. Optimal dilution factors for each sample must be determined by the investigator.4.Preparation of standard: Briefly spin a vial of Item C. Add 400 µl Assay Diluent C (Item L) into Item C vial to prepare a 1,400 µIU/ml standard solution. Dissolve the powder thoroughly by a gentle mix. Add 180 µl Insulin standard (1,400 µIU/ml) from the vial of Item C, into a tube with 450 µl Assay Diluent C to prepare a 400 µIU/ml standard solution. Pipette 250µl Assay Diluent C into each tube. Use the 400 µIU/ml standard solution to produce a dilution series (shown below). Mix each tube thoroughly before the next transfer. Assay Diluent C serves as the zero standard (0 µIU/ml).180 µl250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl250 µlStd1Std2Std3Std4Std5Std6Std7Zero Standard Diluent volume Item C + 400 µl450 µl250 µl250 µl250 µl250 µl250 µl250 µl250 µlConc.1,400 µIU/ml 400 µIU/ml 200 µIU/ml 100 µIU/ml 50 µIU/ml 25 µIU/ml 12.5 µIU/ml 6.25 µIU/ml0 µIU/ml5.If the Wash Concentrate (20X) (Item B) contains visible crystals, warm to roomtemperature and mix gently until dissolved. Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate into deionized or distilled water to yield 400 ml of 1X Wash Buffer.6.Briefly spin the Detection Antibody vial (Item F) before use. Add 100 µl of 1X AssayDiluent B (Item E) into the vial to prepare a detection antibody concentrate. Pipette up and down to mix gently (the concentrate can be stored at 4ºC for 5 days). The detection antibody concentrate should be diluted 80-fold with 1X Assay Diluent B (Item E) andused in step 5 of Part VI Assay Procedure.7.Briefly spin the HRP-Streptavidin concentrate vial (Item G) and pipette up and down tomix gently before use, as precipitates may form during storage. HRP-Streptavidinconcentrate should be diluted 400-fold with 1X Assay Diluent B (Item E).For example: Briefly spin the vial (Item G) and pipette up and down to mix gently. Add30 µl of HRP-Streptavidin concentrate into a tube with 12 ml 1X Assay Diluent B toprepare a 400-fold diluted HRP-Streptavidin solution (don't store the diluted solution for next day use). Mix well.VI. ASSAY PROCEDURE1.Bring all reagents and samples to room temperature (18 - 25ºC) before use. It isrecommended that all standards and samples be run at least in duplicate.bel removable 8-well strips as appropriate for your experiment.3.Add 100 µl of each standard (see Reagent Preparation step 3) and sample intoappropriate wells. Cover wells and incubate for 2.5 hours at room temperature withgentle shaking.4.Discard the solution and wash 4 times with 1X Wash Solution. Wash by filling each wellwith Wash Buffer (300 µl) using a multi-channel Pipette or autowasher. Completeremoval of liquid at each step is essential to good performance. After the last wash,remove any remaining Wash Buffer by aspirating or decanting. Invert the plate and blot it against clean paper towels.5.Add 100 µl of 1X prepared biotinylated antibody (Reagent Preparation step 6) to eachwell. Incubate for 1 hour at room temperature with gentle shaking.6.Discard the solution. Repeat the wash as in step 4.7.Add 100 µl of prepared Streptavidin solution (see Reagent Preparation step 7) to eachwell. Incubate for 45 minutes at room temperature with gentle shaking.8.Discard the solution. Repeat the wash as in step 4.9.Add 100 µl of TMB One-Step Substrate Reagent (Item H) to each well. Incubate for 30minutes at room temperature in the dark with gentle shaking.10.Add 50 µl of Stop Solution (Item I) to each well. Read at 450 nm immediately.VII. ASSAY PROCEDURE SUMMARY1.Prepare all reagents, samples and standards as instructed.2.Add 100 µl standard or sample to each well. Incubate 2.5 hours at room temperature.3.Add 100 µl prepared biotin antibody to each well. Incubate 1 hour at room temperature.4.Add 100 µl prepared Streptavidin solution. Incubate 45 minutes at room temperature.5.Add 100 µl TMB One-Step Substrate Reagent to each well. Incubate 30 minutes atroom temperature.6.Add 50 µl Stop Solution to each well. Read at 450 nm immediately.VIII. CALCULATION OF RESULTSCalculate the mean absorbance for each set of duplicate standards, controls and samples, and subtract the average zero standard optical density. Plot the standard curve on log-log graph paper or using Sigma plot software, with standard concentration on the x-axis and absorbance on the y-axis. Draw the best-fit straight line through the standard points.A. TYPICAL DATAThese standard curves are for demonstration only. A standard curve must be run with each assay.B. SENSITIVITYThe minimum detectable dose of Mouse Insulin was determined to be 5 µIU/ml.Minimum detectable dose is defined as the analyte concentration resulting in an absorbance that is 2 standard deviations higher than that of the blank (diluent buffer).C. SPIKING & RECOVERYRecovery was determined by spiking various levels of Mouse Insulin into the sample types listed below. Mean recoveries are as follows:D. LINEARITYE. REPRODUCIBILITYIntra-Assay CV%: <10%Inter-Assay CV%: <12%IX. SPECIFICITYThis ELISA antibody pair detects mouse, human, rat, porcine and bovine Insulin.X. TROUBLESHOOTING GUIDEProblem Cause SolutionPoor standard curve Inaccurate pipettingImproper standarddilutionCheck pipettesBriefly centrifuge Item C and dissolvethe powder thoroughly by gently mixingLow signal Improper preparation ofstandard and/orbiotinylated antibodyToo brief incubationtimesInadequate reagentvolumes or improperdilutionBriefly spin down vials before opening.Dissolve the powder thoroughly.Ensure sufficient incubation time. Assayprocedure step 3 may be doneovernight at 4°C with gentle shaking(note: may increase overall signalsincluding background).Check pipettes and ensure correctpreparationLarge CV Inaccurate pipettingAir bubbles in wellsCheck pipettesRemove bubbles in wellsHigh background Plate is insufficientlywashedContaminated washbufferReview the manual for proper wash. Ifusing a plate washer, ensure that allports are unobstructed.Make fresh wash bufferLow sensitivity Improper storage of theELISA kitStop solutionStore your standard at <-70ºC afterreconstitution, others at 4ºC. Keepsubstrate solution protected from light.Add stop solution to each well beforereading plateRayBio® ELISA KitsOver 4,000 ELISA kits available, visit /ELISA-Kits for details.This product is for research use only.©2020 RayBiotech, Inc。
全套小鼠 ELISPOT 辅助试剂盒 说明书
全套小鼠ELISPOT辅助试剂盒ALL-IN-ONE Mouse ELISPOT Accessory kit说明书Cat#:2230014产品描述：ELISPOT辅助试剂包括：Magi coating buffer、Blocking stock solution R、Dilution buffer R、Washing buffer、AEC显色液。
方便广大ELISPOT客户的使用。
使用前请对照表(1)检查试剂组成成份，若有任何疑问请与深圳市达科为生物工程有限公司联系。
表(1)ELISPOT辅助试剂盒组成使用说明：1.Magi coating buffer(1×)：即用型，用于未包被PVDF膜的预湿，用时15μL/孔，预湿1分钟，扣去孔内液体即可进行包被。
2.Blocking stock solution R(10×)：封闭缓冲液，用无菌PBS稀释(1:10)即为工作液，用于已包被固相载体上的非特异性结合位点的封闭。
用法：包被完成后，扣去包被液，用无菌PBS洗涤3次(200μL/孔)，以200μL/孔加入封闭缓冲工作液，室温封闭2小时或37°C封闭1小时。
3.Dilution buffer R(10×)：用1×无菌PBS稀释(1:10)即为工作液，用于生物素标记的抗体(Biotinylated antibody，Secondary antibody)及酶联亲和素(Streptavidin-HRP)的稀释。
4.Washing buffer(50×)：洗涤液，用蒸馏水稀释(1:50)即为工作液，用时260μL/孔，每次洗涤以5-7遍。
深圳市达科为生物工程有限公司地址：深圳市坪山区坑梓街道金辉路14号深圳市生物医药创新产业园区1号楼703号5181181/2深圳市达科为生物工程有限公司地址：深圳市坪山区坑梓街道金辉路14号深圳市生物医药创新产业园区1号楼703号518118*************Fax**************E-mail:*************2/25.AEC coloring system ：显色系统，用前按顺序取用AEC dilution 、AEC Solution Ⅰ(20×)、AEC Solutio nⅡ(20×)、AEC Solutio nⅢ(200×)，按照180:10:10:1的比例混合，可参见表(2)。
小鼠IL-10 ELISA试剂盒说明书
小鼠IL-10ELISA试剂盒Mouse IL-10ELISA kitCat#：EMC005尊敬的客户，感谢您选用本公司QuantiCyto®ELISA系列产品。
本产品选用世界著名生产厂家的原料，采用专业体外诊断试剂生产技术制造，仅供科研使用。
本产品可检测血清、血浆、细胞培养上清液、灌洗液、尿液、羊水、腹水、脑脊液、胸腔积液、组织匀浆液等多种类型样本中天然和重组小鼠IL-10浓度，具体适用样本请咨询。
使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分。
如有疑问，请联系欣博盛生物科技有限公司。
Email:**********************，全国服务热线: 4006800892。
QuantiCyto ®EMC005Mouse IL-102试剂盒组成：名称48T 96T 抗体预包被酶标板8×68×12冻干标准品0.5ng /支×2支0.5ng /支×3支标准品&标本通用稀释液12ml×1瓶20ml×1瓶浓缩生物素化抗体1支（规格见标签）1支（规格见标签）生物素化抗体稀释液10ml×1瓶16ml×1瓶浓缩酶结合物1支（规格见标签）1支（规格见标签）酶结合物稀释液10ml×1瓶16ml×1瓶浓缩洗涤液20×25ml×1瓶50ml×1瓶显色底物（TMB ）6ml×1瓶12ml×1瓶反应终止液具腐蚀性6ml×1瓶12ml×1瓶封板胶纸3张6张产品说明书1份1份储存条件：未开封完整试剂盒4℃保存，请在保质期内使用。
已开封试剂盒抗体包被板条未用完的板条放回带拉链铝箔袋，封好口。
4℃条件下可储存1个月左右。
标准品冻干粉-20℃可储存6个月左右。
稀释后的标准品使用后请丢弃。
浓缩生物素化抗体浓缩液4℃可储存1个月左右，稀释后即用即弃。
四正柏生物 小鼠IL-6 ELISA试剂盒说明书
REV20190712仅供研究，不用于临床诊断。
客服热线: 400-7060-959﹡技术支持邮箱: **************公司官网: 目录简介 ........................................................................................................................................................... - 3 -检测原理 ................................................................................................................................................... - 3 -试剂盒组分 ............................................................................................................................................... - 4 -储存条件 ................................................................................................................................................... - 5 -其他实验材料(不提供，但可协助购买) : ............................................................................................. - 5 -注意事项 ................................................................................................................................................... - 5 -样本收集处理及保存方法 ....................................................................................................................... - 6 -试剂准备 ................................................................................................................................................... - 6 -操作步骤 ................................................................................................................................................... - 8 -操作流程图 ............................................................................................................................................... - 8 -操作要点提示 ........................................................................................................................................... - 9 -结果判断 ................................................................................................................................................... - 9 -结果重复性 ............................................................................................................................................. - 10 -灵敏度 ..................................................................................................................................................... - 10 -特异性 ..................................................................................................................................................... - 10 -参考文献 ................................................................................................................................................. - 10 -该产品由北京四正柏生物科技有限公司研制。
大鼠瘦素(LEP)化学发光试剂盒说明书
大鼠瘦素(LEP)化学发光试剂盒使用说明书产品编号：U0084r本试剂盒仅供体外研究使用!预期应用化学发光法定量测定大鼠血清、血浆、组织匀浆、细胞培养物上清或其它相关生物液体中瘦素(LEP)含量。
实验原理本试剂盒应用竞争化学发光免疫分析法测定标本中LEP水平。
用纯化的特异抗体包被微孔板，制成固相抗体，实验时往微孔中先后加入LEP标准品或受检标本和生物素标记LEP，使之与固相抗体反应。
如受检标本中无抗原，则生物素标记抗原能顺利地与固相抗体结合。
如受检标本中含有抗原，则与生物素标记抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了生物素标记抗原与固相载体结合的机会，使生物素标记抗原与固相载体的结合量减少。
洗涤，依次加入HRP标记的亲和素、反应底物鲁米诺，在HRP催化下辐射出最大发射波长为425nm 的化学发光，发光值和样品中的LEP含量呈反向相关。
用微孔板化学发光分析仪测定发光度（RLU.S-1.PW-1），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制1. 酶联板：一块（96孔）2. 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1.0ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为5000 pg/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成2500 pg/mL，1250 pg/mL，625 pg/mL，312 pg/mL，156 pg/mL，78 pg/mL，其原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/mL，临用前15分钟内配制。
如配制2500 pg/mL标准品：取0.50 ml (不要少于0.50 ml ) 5000 pg/mL的上述标准品加入含有0.50 ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3. 样品稀释液：1×20ml。
4. 检测稀释液A：1×10ml。
5. 检测稀释液B：1×10ml。
6. 检测溶液A：1×60μl（1:100）临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（50μl/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。
小鼠干扰素(IFN-)酶联免疫分析试剂盒 说明书
小鼠γ干扰素（IFN-γ）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用检测范围：15.6pg/ml-1000pg/ml最低检测限：3.9pg/ml特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的小鼠IFN-γ，且与其他相关蛋白无交叉反应。
有效期：6个月预期应用：ELISA法定量测定小鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中IFN-γ含量。
说明1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
概述干扰素（IFN）是1957年被发现的。
它是一类分泌性蛋白，具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。
根据产生干扰素细胞来源不同、理化性质和生物学活性的差异，可分为α-1b 型干扰素、β-干扰素和γ干扰素。
γ干扰素（IFN-γ）也叫Ⅱ型IFN，主要由活化T细胞产生，活化NK细胞也可产生IFN-γ。
IFN-γ的生物学作用有较严格的种属特异性，其生物学作用有：（1）诱导单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞、星状细胞等MHCⅡ类抗原的表达，使其参与抗原提呈和特异性免疫的识别过程。
此外，IFN-γ可上调内皮细胞ICAM-1（CD54）表达，促进巨噬细胞FcγR表达，协同诱导TNF并促进巨噬细胞杀伤病原微生物。
（2）促进LPS体外刺激小鼠B细胞分泌IgG2a，降低IgG1、IgG2b、IgG3和IgE的产生；抑制由IL-4诱导的小鼠B细胞增殖，IgG1和IgE产生以及FcεRⅡ表达；促进SAC诱导的人B细胞的增殖。
（3）协同IL-2诱导LAK活性，促进T细胞IL-2R表达。
（4）诱导急性期蛋白合成，诱导髓样细胞分化。
实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗IFN-γ抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗IFN-γ抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。
乳酸脱氢酶测定试剂盒(乳酸底物法)产品技术要求lepu
乳酸脱氢酶测定试剂盒（乳酸底物法）适用范围：用于体外定量测定人血清中乳酸脱氢酶的活性。
分说明1.1 规格试剂1:3×60 mL，试剂2:1×45 mL；试剂1:1×60 mL，试剂2:1×20 mL；试剂1:1×60 mL，试剂2:1×12 mL；试剂1:2×60 mL，试剂2:2×15 mL；试剂1:1×40 mL，试剂2:1×10 mL；试剂1:1×4L，试剂2:1×1L；试剂1:1×16L，试剂2:1×4L。
1.2主要组成成分试剂1主要组分：试剂2主要组分：2.1 净含量应不低于试剂瓶标示装量。
2.2 外观试剂1：无色或淡黄色透明溶液；试剂2：无色或淡黄色透明溶液。
外包装完好、无破损，标签完好、字迹清晰。
2.3 试剂空白2.3.1 试剂空白吸光度在37℃、340nm波长、1cm光径条件下，试剂空白吸光度应不大于0.50。
2.3.2 试剂空白吸光度变化率在37℃、340nm波长、1cm光径条件下，用生理盐水作为样品加入试剂测试时，试剂空白吸光度变化率(△A/min)应不大于0.002。
2.4 分析灵敏度测试300U/L的被测物时，吸光度变化率（ΔA/min）应不低于0.0085。
2.5 准确度用参考物质（GBW09177）对试剂（盒）进行测试，相对偏差应不超过±10%。
2.6 重复性用血清样品或质控样品重复测试所得结果的重复性（变异系数，CV）应不大于5%。
2.7 线性2.7.1 在[25,750]U/L区间内，线性相关系数r应不小于0.990；2.7.2 [25,100）U/L区间内，线性绝对偏差应不超过±10U/L；[101,750]U/L区间内，线性相对偏差应不超过±10%。
2.8 批间差试剂（盒）批间相对极差应不大于10％。
小鼠酶联免疫检测试剂盒,小鼠粒细胞集落刺激因子(G-CSF)酶联分析检测ELISA试剂盒使用说明书
小鼠酶联免疫检测试剂盒,小鼠粒细胞集落刺激因子（G-CSF）酶联分析检测ELISA试剂盒使用说明书国内权威的科研试剂供应商，乔羽生物专业经营进口分装和原装、国产的Elisa试剂盒，品质保证，技术严格，无效果退款退货。
Elisa kit规格：48孔配置/96孔配置标准品稀释液：1.5ml×1瓶酶标试剂：3 ml×1瓶（48）/6 ml×1瓶（96）本试剂仅供研究使用标本：血清或血浆上海乔羽生物专业供应：使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本组织因子途径抑制物（G-CSF）含量。
试验原理：G-CSF试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知G-CSF浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。
先将G-CSF和生物素标记的抗体同时温育。
洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。
再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。
产生颜色。
颜色的深浅和样品中G-CSF的浓度呈比例关系。
试剂盒内容及其配制试剂盒成份（2-8℃保存）96孔配置48孔配置配制96/48小鼠份酶标板1块板（96T）半块板（48T）即用型塑料膜板盖1块半块即用型标准品：80ng/ml 1瓶（0.6ml）1瓶（0.3ml）按说明书进行稀稀空白对照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）即用型标准品稀释缓冲液1瓶（5ml）1瓶（2.5ml）即用型生物素标记的抗G-CSF抗体1瓶（6ml）1瓶（3.0ml）即用型亲和链酶素-HRP 1瓶（10ml）1瓶（5.0ml）即用型洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）按说明书进行稀释底物A 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型底物B 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型终止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型标本稀释液1瓶（12ml）1瓶（6.0ml）即用型自备材料1．蒸馏水。
2．加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
ELISA检测试剂盒使用指南
ELISA检测试剂盒使用指南ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测体内特定抗原或抗体的存在和浓度。
ELISA检测试剂盒是用于进行ELISA实验的组合套装，包括抗体或抗原、酶标记物、底物、缓冲液等。
本文将介绍ELISA检测试剂盒的使用指南，以帮助用户顺利进行ELISA实验。
1.准备实验材料：-ELISA检测试剂盒：根据实验需要选择适当的ELISA检测试剂盒，确保其在储存和运输过程中无损坏。
-样本：准备需要检测的样本，如血清、尿液、组织提取物等。
确保样本的质量和浓度满足实验要求。
-微孔板：根据试剂盒的要求选择合适的微孔板，同时注意其质量有无污染。
-基本实验设备：如计量器、洗板机、显微镜等。
2.实验步骤：-取出储存在4℃的试剂，确保其达到室温（一般为20-25℃），再根据实验步骤进行下一步操作。
-预处理样本：根据试剂盒的说明书，进行样本的预处理，包括稀释、纯化、稳定化等步骤。
-加样：将样本按照试剂盒要求的体积加入微孔板中，通常每个孔需要加入100-200μL的样品。
-洗板：使用洗板机或手工操作，将孔中的杂质洗净。
洗板时应注意洗涤缓冲液的使用浓度和洗涤次数。
-加入特异性抗体：根据试剂盒的说明书，将稀释好的特异性抗体加入各孔中，确保操作的准确性和每孔的稀释倍数。
-洗板：重复第4步的操作，将未结合的抗体洗净。
-加入酶标记物：根据试剂盒的说明书，将稀释好的酶标记物加入各孔中，确保加入的量准确无误。
-洗板：重复第4步的操作，将未结合的酶标记物洗净。
-加入底物：将稀释好的底物加入各孔中，使其与酶标记物反应，生成可视化的颜色。
-终止反应：根据试剂盒的要求，在一定的反应时间后，加入终止剂停止反应。
终止剂的选择需符合试剂盒的要求。
-检测结果：使用酶标仪或目视观察检测孔中的颜色变化，通过测量吸光度或颜色强度来确定样本中目标物的浓度。
3.数据分析：-计算样本的结果：根据试剂盒的说明书，根据吸光度或颜色强度测量结果，计算样本中目标物的浓度。
ELISA 检测试剂盒 说明书
本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断小鼠小鼠（（MouseMouse））肿瘤坏死因子可溶性受体肿瘤坏死因子可溶性受体ⅠⅠ（TNFsR-TNFsR-ⅠⅠ）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被肿瘤坏死因子可溶性受体Ⅰ（TNFsR-Ⅰ）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子可溶性受体Ⅰ（TNFsR-Ⅰ）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用前充分摇匀。
ELISA检测试剂盒使用指南
ELISA检测试剂盒使用指南ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测病原体、抗体或其他分子的存在和浓度。
它具有高灵敏度、高特异性、易操作和较低成本的优势，被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和免疫学领域。
本篇文章将介绍ELISA检测试剂盒的使用指南，包括实验准备、试剂的使用步骤和结果解读。
一、实验准备1.阅读检测项目的说明书：在使用试剂盒前，仔细阅读说明书，了解试剂的使用方法、灵敏度和特异性等关键信息。
2.样本准备：根据实验要求，准备样本。
如果需要检测血清中的抗体水平，可以采集血液样本，离心分离血清；如果需要检测细胞培养上清中的分子，将上清收集，并使其清晰，避免细胞或杂质的污染。
3.样本预处理：根据实验需求，对样本进行必要的预处理。
例如，可以通过加热、稀释、酶解等方式来处理样本，以改变样本组分和浓度。
4.准备品质控制样品：制备阳性和阴性控制样品，用于评估试剂盒和实验操作的稳定性和准确性。
5.实验器材准备：准备所需实验器材，如酶标板、移液器、微孔板洗涤仪等。
确保器材的干净和完整，并按照说明书要求对其进行预处理。
二、试剂使用步骤1.试剂准备：根据说明书要求，将试剂从冰箱中取出，并在室温下放置一段时间使其恢复到室温。
确保试剂瓶盖紧闭，并避免暴露在直接阳光下。
2.实验操作：按照说明书的要求，将试剂加入到酶标板中，并根据实验设计进行标准曲线的设置。
标准曲线用于测量未知样品的数量，并计算出浓度。
3.孵育：根据试剂盒的要求，将酶标板放入孵育箱中进行孵育。
孵育温度和时间应根据实验要求进行调整。
4.洗涤：使用洗涤缓冲液对酶标板上的不特异性结合物进行洗涤。
洗涤过程应准确控制洗涤孔板次数和洗涤液的体积。
5.补液：在洗涤完成后，加入辣根过氧化物酶标况稀释液，促进酶标物与特异性结合物的反应。
6.孵育：根据试剂盒的要求，将酶标板放入孵育箱中进行二次孵育。
7.反应停止：根据试剂盒的要求，加入相应的停止液，停止酶反应。
ELISA试剂盒说明书……IFN-γ
(IFN-γγ)酶联免疫分析（ELISA）小鼠γ干扰素(IFN-试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，组织及相关液体样本中γ干扰素(IFN-γ)含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠γ干扰素(IFN-γ)水平。
用纯化的小鼠γ干扰素(IFN-γ)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入γ干扰素(IFN-γ)，再与HRP标记的羊抗鼠抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的γ干扰素(IFN-γ)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中小鼠γ干扰素(IFN-γ)浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：1800ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
小鼠苯丙氨酸(LPA)ELISA试剂盒使用说明书本
小鼠苯丙氨酸(LPA)ELISA试剂盒使用说明书本本试剂仅供研究使用标本：血清或血浆本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中α半乳糖基抗体(LPA)的含量。
试验原理：LPA试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知LPA浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。
先将LPA和生物素标记的抗体同时温育。
小鼠苯丙氨酸洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。
再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。
产生颜色。
颜色的深浅和样品中LPA的浓度呈比例关系。
试剂盒组成：自备材料蒸馏水。
加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
振荡器及磁力搅拌器等。
安全性避免直接接触终止液和底物A、B。
一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
操作注意事项试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。
稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
不用的其它试剂应包装好或盖好。
不同批号的试剂不要混用。
保质前使用。
使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
使用干净的塑料容器配置洗涤液。
使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
底物A应挥发，避免长时间打开盖子。
底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。
避免用手接触，有毒。
实验完成后应立即读取OD值。
加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
样品收集、处理及保存方法血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。
使用不含热原和内毒素的试管。
收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
瘦素介导气道上皮细胞调控肥胖相关的气道高反应
㊃论著㊃D O I :10.3760/c m a .j .i s s n .1673-436X.2014.23.007基金项目:湖南省科技厅科研重点项目(2012F J 4375);湖南省高校创新平台开放基金(14K 108);中南大学青年教师助推项目(2012Q N Z T 111)作者单位:410008长沙,中南大学湘雅医院呼吸内科(秦岭㊁胡成平);410013长沙,中南大学湘雅三医院普外科(宋智);410008长沙,中南大学湘雅二医院病理科(文赛兰)通信作者:胡成平,E m a i l :h u c h e n g p28@126.c o m 瘦素介导气道上皮细胞调控肥胖相关的气道高反应秦岭 宋智 文赛兰 胡成平ʌ摘要ɔ 目的 肥胖增加了支气管哮喘(简称哮喘)发病的危险,但具体机制不明确㊂本研究通过观察肥胖小鼠血清瘦素浓度和气道激发试验后肺功能的变化以及瘦素对人支气管上皮细胞(H B E C s )的促炎作用来明确瘦素在肥胖相关的气道高反应中的作用㊂方法 ①健康雌性B a l b /c 小鼠20只,随机分为对照组(喂予基础饲料)和肥胖组(喂予高脂高糖食物)㊂30d 后记录小鼠的体质量和增长率,乙酰甲胆碱激发后检测各组小鼠激发前后的潮气量(T V )㊁气道阻力(A R )与肺顺应性(C d y n )㊂E L I S A 测定血清瘦素水平㊂②将重组人瘦素(r h L E P )作用于H B E C s ,分别为对照组㊁0.2m g /L ㊁0.5m g /L ㊁1m g /L 干预组,24h 后E L I S A 检测上清液中I L -6和I L -8的浓度,R e a l t i m e -P C R 观察H B E C s 中核因子κB (N F -κB )和细胞黏附分子-1(I C AM -1)m R N A 的表达㊂结果 ①高脂高糖食物喂养后,肥胖组小鼠体质量㊁体质量增长率和血清瘦素浓度均明显高于对照组㊂肺功能测定显示:激发前,肥胖组的A R 大于对照组㊂乙酰甲胆碱激发后,肥胖组A R 的水平和升高幅度都明显大于对照组㊂T V 和C y d n 在各组之间以及激发前后差异均无统计学意义㊂②r h L E P 作用于H B E C s 后,r h L E P 干预组细胞上清液内I L -6和I L -8水平以及细胞内I C AM -1表达均明显高于对照组㊂N F -κB 的表达与对照组差异无明显统计学意义㊂结论 瘦素可能是通过促进H B E C s 释放炎性因子和对炎性细胞的募集作用在肥胖相关的气道高反应中起作用㊂ʌ关键词ɔ 瘦素;肥胖;支气管上皮细胞;气道高反应O b e s i t y r e l a t e d -a i r w a y h y p e r r e s p o n s i v e n e s sw a sr e g u l a t e db y l e p t i n m e d i a t e da i r w a y e p i t h e l i a lc e l l s Q i n L i n g *,S o n g Z h i ,W e nS a i l a n ,H uC h e n g p i n g .*R e s p i r a t o r y D e p a r t m e n t ,X i a n g y a H o s pi t a l ,C e n t r a l S o u t hU n i v e r s i t y ,C h a n gs h a 410008,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :H uC h e n g p i n g ,E m a i l :h u c h e n g p28@126.c o m ʌA b s t r a c t ɔ O b je c t i v e C l i n i c a ls t u d i e sf o u n dt h a to b e s i t y i n c r e a s e dt h er i s ko fa s t h m a ,b u ti t s m e c h a n i s mr e m a i n su n c l e a r .I n t h i s s t u d y ,w ee x p l o r e dt h e l e v e l o f s e r u ml e p t i na n d p u l m o n a r y fu n c t i o n b e f o r e /a f t e r p r o v o c a t i o nt e s t i no b e s i t y m i c ea n d p r o -i n f l a mm a t o r y r o l eo fa i r w a y e p i t h e l i a l c e l l su n d e r l e p t i nt r e a t m e n t ,i no r d e rt oc l a r i f y t h er o l eo fl e p t i ni n o b e s i t y r e l a t e d -a i r w a y h y p e r r e s p o n s i v e n e s s .M e t h o d s ①T w e n t y f e m a l eB a l b /c m i c ea r er a n d o m l y d i v i d e di n t o2g r o u p s :c o n t r o l g r o u p fe d w i t h n o r m a lf o o d s ,F a t t y -d i e tG r o u p f e dw i t hh igh f a t t y a n d hi g h s u g a r f o o d s .A f t e r 30d a y s ,t h e a n i m a l s ,w h o s e b o d y w e i g h t s a n d t h e i r g r o w i n g r a t ew e r e r e c o r d e d ,w e r e a r o u s e dw i t hm e t h a c h o l i n e (M c h )a n d t h e n t e s t e d f o r a i r w a y r e s i s t a n c e (A R ),t i d a l v o l u m e (T V )a n dd y n a m i c c o m p l i a n c e (C y d n ).B l o o dw a s h a r v e s t e d f o r d e t e r m i n i n g l e v e l s o f l e p t i nb y E L I S A.②H u m a nb r o n c h i a l e p i t h e l i a l c e l l l i n e (H B E C s )w e r e t r e a t e db y r e c o m b i n a n t h u m a n l e p t i n (r h L E P )a t v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s (0.2m g /L ,0.5m g /La n d1m g /L ).A f t e r 24h ,h u m a nI L -6,I L -8c o n c e n t r a t i o n s i ns u p e r n a t a n t s f r o m H B E C sw e r ed e t e r m i n e du s i n g E L I S A k i t s a n de x p r e s s i o no fN F -κBa n dI C AM -1m R N Ai n H B E C sw e r e q u a n t i f i e db y r e a l -t i m eP C R.R e s u l t s ①A f t e r f e e d i n g w i t hh i g hf a t t y a n dh i g hs u g a r f o o d s ,t h ew e i g h t ,i t s g r o w t hr a t ea n dt h e l e v e lo fs e r u m l e p t i n i no b e s e m i c e w e r es i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt h o s ei n C o n t r o l .T h et e s to f p u l m o n a r y fu n c t i o n ㊃3871㊃国际呼吸杂志2014年12月第34卷第23期 I n t JR e s pi r ,D e c e m b e r 2014,V o l .34,N o .23s h o w e d t h a t,i no b e s e g r o u p,R Lb e f o r ea n da f t e r s t i m u l a t i o na n d i t se l e v a t e de x t e n tw a sa l l g r e a t e r t h a n t h o s e i n c o n t r o l.T h e r ew a s n o o b v i o u s d i f f e r e n c e o f T Va n dC y d n b e t w e e n t w o g r o u p s.②A f t e r s t i m u l a t e d b y r h L E P,t h e l e v e l s o f I L-6a n dI L-8i ns u p e r n a t a n t sa n dI C AM-1e x p r e s s i o n f r o m H B E C sw e r eh i g h e r t h a n c o n t r o l.B u tN F-κBe x p r e s s i o nw a sn o t c h a n g e d.C o n c l u s i o n s L e p t i n m a yp l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n o b e s i t y r e l a t e da i r w a y h y p e r r e s p o n s i v e n e s st h r o u g h p r o m o t i n g H B E C sr e c r u i ti n f l a mm a t o r y c e l l sa n d r e l e a s e c y t o k i n e s.ʌK e y w o r d sɔ L e p t i n;O b e s i t y;B r o n c h i a l e p i t h e l i a l c e l l s;A i r w a y h y p e r r e s p o n s i v e n e s s支气管哮喘(简称哮喘)与肥胖都是全球关注的公共卫生疾病㊂目前有临床流行病学资料提示肥胖与哮喘发病存在着潜在联系㊂研究数据显示肥胖可增加哮喘发病的风险[1],以及使普通哮喘转化为难以控制的另一表型[2]㊂然而,另一部分学者认为两种疾病毫无关联[3]㊂虽然肥胖是否导致哮喘易感性增加至今不明确,但是阐述清楚两者之间的联系对临床上的指导治疗尤为重要㊂目前大部分前瞻性研究提出肥胖是哮喘发病的风险因子之一,它可使哮喘的发病风险提高1~3倍[1,4-5]㊂现有研究认为瘦素可能在解释肥胖与哮喘的关联中发挥重要作用㊂瘦素是O b基因的表达产物,它的血清浓度在肥胖人群中较正常人升高并且具有重要的免疫调节功能㊂瘦素与某些长链螺旋状的细胞因子具有结构同源性,例如I L-6;它还可以调节T 细胞的增殖与活化,募集和活化单核细胞和巨噬细胞,以及促进血管生成[6]㊂近年来,气道上皮已不再仅仅被认为是沟通机体内外环境的物理屏障,它还是机体抵抗外源性抗原入侵的第一道免疫防御系统㊂上皮细胞针对抗原的免疫反应包括递呈抗原给淋巴细胞以及释放细胞因子至黏膜下层并启动炎性反应㊂气道上皮的结构和功能缺陷可导致哮喘易感性增加,这有可能是哮喘发病的启动环节[7]㊂因此,在本实验中,我们建立肥胖小鼠模型并检测小鼠的体质量和血清瘦素的变化,通过观察模型小鼠经乙酰胆碱激发后的气道阻力(A R)㊁肺顺应性(C d y n)和潮气量(T V)的变化探寻肥胖与气道高反应的潜在联系㊂同时,体外观察瘦素致人支气管上皮细胞(h u m a n b r o n c h i a l e p i t h e l i a lc e l l sl i n e,H B E C s)内细胞黏附分子1 (I C AM-1)㊁核因子κB(N F-κB)的表达和释放炎性因子I L-6㊁I L-8的变化㊂1材料与方法1.1实验动物及模型制备健康㊁雌性(雌鼠对瘦素的反应较敏感,且血清瘦素浓度较雄鼠高,更容易测得[8])B a l b/c小鼠20只,体质量19~21g(购自中南大学动物学部)㊂20只小鼠随机分为2组,分别为正常组:喂予普通饲料;肥胖组:喂予高脂高糖食物(10%猪油, 10%鸡蛋,5%白糖,75%基础饲料)㊂每日早晚2次喂食(昼夜比12ʒ12),记录每天食物摄入量,共饲养30d㊂每10天称重一次㊂1.2标本的收集与处理饲养满30d,自由饮水,禁食12h后,经10%水合氯醛腹腔内注射麻醉,气管插管检测A R和C d y n;心脏取血后分离血清E L I S A法检测瘦素浓度(试剂盒购自于美国R&D 生物科技公司)㊂1.3肺功能测定腹腔麻醉后,给实验动物行气管切开,接D H X-75B小动物呼吸机(成都仪器厂制造)和小动物有创肺功能仪(B u x c o公司)㊂以乙酰甲胆碱(m e t h a c h o l i n e,M c h)(S i g m a公司)雾化作为激发物,依次检测0.39μg/L㊁0.78μg/L㊁1.56μg/L㊁3.12μg/L4个递增浓度的M c h引起大鼠A R㊁C d y n以及T V的变化㊂前一个浓度M c h刺激后A R或C d y n发生变化,待变化恢复到刺激前的基础值左右或恢复到某一稳定状态后再做下一个浓度M c h的刺激㊂1.4细胞培养与干预永生化H B E C s由中南大学基础医学院生理学系提供㊂细胞株在完全培养基(D M E M+10%胎牛血清+青㊁链霉素各100U/m l)以及C O2培养箱(C O25%,空气95%,湿度80%,温度37ħ)中培养㊂待细胞生长至80%融合时,用无血清培基处理细胞12h使细胞生长同步化㊂之后用人重组瘦素(r h L E P,购自P r o S p e c公司)以3种不同浓度(0.2m g/L,0.5m g/L以及1m g/L)加入新鲜培养基中干预细胞24h,分别收集细胞和上清液完成后续实验㊂1.5细胞因子检测经r h L E P处理后,收集H B E C s的上清液,E L I S A法测定上清液中细胞因子I L-6和I L-8的水平,E L I S A试剂盒均购自于美国R&D公司㊂1.6R e a l-t i m e P C R检测N F-κB和I C AM-1 m R N A的表达收获经r h L E P干预后的H B E C s, T r i z o l(I n v i t r o g e n,U S A)法提取细胞R N A㊂先用㊃4871㊃国际呼吸杂志2014年12月第34卷第23期I n t JR e s p i r,D e c e m b e r2014,V o l.34,N o.23随机引物将R N A 反转录成c D N A (逆转录试剂盒购自于上海闪晶生物公司),目标m R N A 的表达情况由r e a l -t i m eP C R 试剂盒以及F T C2000序列检测系统(C a n a d a )检测完成㊂从G e n e B a n k 中调出N F -κB 和I C AM -1m R N A 序列,采用p r i m e r E x pr e s s 5.0软件根据引物设计原则和要求,进行计算机辅助设计㊂设立β-a c t i n 为内对照(表1)㊂表1 R e a l t i m e -P C R 检测中的设计引物列表引物序列产物长度(b p)人N F -κB 上游5ᶄ-A G G A G A T G G A C C T C A G C G T G -3ᶄ下游5ᶄ-C T C C A C C A T T T T C T T C C T C T T C -3ᶄ264人I C AM -1上游5ᶄ-G C C C A T C G G G G A A T C A G T -3ᶄ下游5ᶄ-C A T T A T G A C T G C G G C T G C T A C -3ᶄ163人β-a c t i n上游5ᶄ-T G A C G T G G A C A T C C G C A A A G -3ᶄ下游5ᶄ-C T G G A A G G T G G A C A G C G A G G -3ᶄ205注:N F -κB :核因子κB ;I C AM -1:细胞黏附分子-1表2 2组小鼠的体质量及其增长率和血清瘦素水平(x -ʃs)组别只数体质量(g )造模前造模后增长率(%)血清瘦素(μg /L )对照组1020.78ʃ1.5230.08ʃ2.1044.48ʃ3.8340.18ʃ12.02肥胖组1020.39ʃ1.7634.10ʃ3.50a64.50ʃ7.89a53.61ʃ15.15aF 值-6.8165.4714.876P 值-<0.026<0.0390.048注:与正常对照组相比,a P <0.051.7 统计与分析 实验数据以x -ʃs 表示,运用S P S S 统计软件对结果进行分析,组间比较采用方差分析,两两比较采用独立样本t 检验㊂P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结果2.1 肥胖小鼠的体质量及其增长率以及血清瘦素水平 20只小鼠随机分为2组:分别为对照组和肥胖模型组,肥胖模型组给予高脂高糖食物喂养㊂实验前各组小鼠的平均体质量十分接近,经高脂高糖食物喂养30d 后,2组小鼠的体质量均有不同程度的增长,结果显示肥胖组小鼠的体质量及其增长率要明显高于对照组,同时肥胖组小鼠的血清瘦素浓度也明显高于对照组(表2)㊂2.2 肥胖小鼠的肺功能变化 经4个递增浓度的M c h 逐步刺激之后,B u x c o 小动物肺功能仪测定正常小鼠和肥胖小鼠气道阻力(R I )㊁C y d n 以及T V 的变化㊂结果显示,与基线值相比较,经M c h 激发后各组的A R 值均有不同程度的增加(图1A ),但肥胖小鼠的A R 增加幅度要明显高于对照组(P <0.05)㊂设定2组小鼠的基础A R 均为0;0.39μg /L M c h 激发后,对照组小鼠的A R 增加0.043ʃ0.05,肥胖组小鼠的A R 增加0.55ʃ0.101,增加幅度明显高于对照组(F =1.96,P =0.001);0.78μg/L M c h 激发后,对照组小鼠的A R 增加0.118ʃ0.148,肥胖组小鼠的A R 增加1.051ʃ0.432,增加幅度明显高于对照组(F =4.492,P =0.024);1.56μg /L M c h 激发后,对照组小鼠的A R 增加0.621ʃ0.403,肥胖组小鼠的A R 增加1.376ʃ0.324,增加幅度明显高于对照组(F =0.049,P =0.065);3.12μg /L M c h 激发后,对照组小鼠的A R 增加0.695ʃ0.289,肥胖组小鼠的A R 增加1.734ʃ0.114,增加幅度明显高于对照组(F =3.373,P =0.004)㊂经M c h 激发后,正常组与肥胖组的C yd n 均较基础值有所下降(图1B )㊂相比对照组,肥胖小鼠的C yd n 值下降较明显,但差异无统计学意义㊂同样,M c h 激发后,2组小鼠的T V 均有所下降(图1C ),但2组小鼠的T V 下降差异率无统计学意义㊂注:与正常对照组相比,a P <0.05图1A 经乙酰甲胆碱激发后各组小鼠的气道阻力上升比值(x -ʃs ,n =1)图1B 经乙酰甲胆碱激发后各组小鼠的肺顺应性下降比值(x -ʃs ,n =10)㊃5871㊃国际呼吸杂志2014年12月第34卷第23期 I n t JR e s pi r ,D e c e m b e r 2014,V o l .34,N o .23图1C经乙酰甲胆碱激发后各组小鼠的潮气量下降比值(x-ʃs,n=10)2.3瘦素作用后人支气管上皮细胞的免疫功能变化分别用0.2m g/L㊁0.5m g/L以及1m g/L的重组人瘦素(r h L E P)干预人支气管上皮细胞后, E L I S A检测细胞分泌I L-6和I L-8的变化,以及荧光定量P C R检测细胞中N F-κB和I C AM-1的m R N A表达变化㊂结果显示,对照组细胞上清液中I L-6的浓度为(353.37ʃ93.94)n g/L㊂3种不同浓度的r h L E P分别干预后,上皮细胞分泌I L-6的水平分别是(594.64ʃ91.68)n g/L㊁(553.66.37ʃ119.61)n g/L㊁(573.07ʃ93.22)n g/L,均较对照组明显增高(F=4.340,P=0.006;F=3.121,P= 0.018;F=4.026,P=0.011)㊂对照组上皮细胞上清液中I L-8的浓度是349.55ʃ73.79,在0.2m g/L 和0.5m g/L的r h L E P干预后,上皮细胞分泌I L-8的水平分别是572.20ʃ90.42㊁475.88ʃ106.96,均较对照组增高(F=4.801,P=0.006;F=2.320, P=0.048),而最高浓度1m g/L的瘦素干预后,上皮细胞分泌I L-8的水平为412.38ʃ127.59,反而较对照组差异无统计学意义(P>0.05)(图2A)㊂图中可见,上皮细胞分泌I L-6和I L-8的水平并没有随着r h L E P干预浓度的增高而逐渐提高㊂荧光定量P C R的结果显示,对照组细胞内N F-κB和I C AM-1的m R N A表达的相对比值分别是0.105ʃ0.026㊁0.103ʃ0.007㊂3种不同浓度的r h L E P干预后,上皮细胞内N F-κB m R N A的表达相对比值分别是0.096ʃ0.014㊁0.070ʃ0.016㊁0.084ʃ0.020,均较对照组差异无统计学意义(P> 0.05),但在0.5m g/L和1m g/L的r h L E P干预下,细胞内I C AM-1的m R N A相对表达比值为0.136ʃ0.018㊁0.170ʃ0.030,较对照组显著增强(F=5.012,P=0.011;F=4.901,P=0.021),在0.2m g/Lr h L E P干预下,I C AM-1的m R N A相对表达比值为0.082ʃ0.004,较对照组差异无统计学意义(P>0.05)(图2B)㊂注:r h L E P:重组人瘦素;H B E C s:人支气管上皮细胞;与正常对照组相比,a P<0.05,b P<0.05图2A r h L E P干预对H B E C s分泌I L-6和I L-8的影响(x-ʃs,n=5)注:r h L E P:重组人瘦素;H B E C:支气管上皮细胞;I C AM-1:细胞黏附分子-1;与正常对照组相比,a P<0.05图2B r h L E P干预对H B E C表达N F-κB和I C AM-1的影响(x-ʃs,n=5)3讨论目前国际上肥胖小鼠的模型尚无公认的确定标准,本研究通过喂养高脂高糖食物建立肥胖小鼠动物模型㊂喂养前,正常组和肥胖组小鼠的平均体质量十分接近,经过30d的高脂高糖饲料规律喂养,称量发现肥胖组小鼠的体质量及体质量增长率均明显高于对照组,证明了本实验成功构建了肥胖小鼠模型,至少相对于对照组,肥胖组小鼠是明显超重的㊂研究中测定激发后的小鼠肺功能变化,结果显示经M c h激发后,肥胖小鼠的气道阻力升高较正常组明显,提示肥胖小鼠的气道高反应更严重㊂气道高反应性是哮喘的主要特征和主要诊断依据之一,这提示肥胖组小鼠更容易惧患哮喘㊂动物实验结果符合当前的流行病学调查,即肥胖是哮喘发生的风险因子,可使哮喘发生的几率提高1.1~3倍㊂并且越高体质量指数与哮喘发生的关系愈发密切[1]㊂但肥胖导致哮喘易感的机制目前未能明确,根据前人研究的总结,肥胖导致哮喘易感主要与解剖结构改变的物理因素和体内微环境改变的化学因素有关㊂㊃6871㊃国际呼吸杂志2014年12月第34卷第23期I n t JR e s p i r,D e c e m b e r2014,V o l.34,N o.23首先从物理因素分析,肥胖引致肺脏的生理解剖均发生变化,可以降低C y d n,并使肺容量和气道直径减小,影响通气血流比值,进而可潜在性的加强气道阻塞和气道高反应[4]㊂同时肥胖由于脂肪的挤压使胸廓扩张受限,气流减小,F E V1和F V C降低㊂气道直径减小可导致支气管平滑肌的功能改变,反过来改变肌动蛋白-肌球蛋白-横桥周期,引起气道阻塞和气道高反应[9]㊂但G o l d等认为肥胖者的肺膨胀受限和气道内径缩小可能并不导致气道高反应,他们[10]证实即使在开胸状态下加上呼气末正压,使限制性通气障碍改善情况下,肥胖小鼠的气道高反应性仍然存在㊂这说明了化学因素即机体微环境改变可能是肥胖致哮喘易感的更重要因素,肥胖者由于体内蓄积有过多的脂肪组织,机体始终处于一种系统性的前炎性状态㊂脂肪组织分泌重要的脂肪因子,具有免疫调节功能,有些具有前炎性效应,造成肥胖者体内的系统性炎性状态[11-12]㊂特别是脂肪组织分泌的瘦素在炎症中起到了至关重要的作用㊂近期的研究都认为联系肥胖与哮喘的关键是瘦素㊂本研究中也观察到,肥胖小鼠的气道阻力值和血清瘦素水平均增高,因此猜测瘦素可能是引发气道炎症的关键因子㊂80%以上的肥胖者都伴随有机体瘦素水平的增高㊂通过回顾以往的文献,初步猜测肥胖人群体内高瘦素水平可能是哮喘发病的影响因素之一[13]㊂已有动物水平的研究观察到瘦素可以引发气道高反应: C a nöz等报道指出瘦素可促进臭氧或卵蛋白攻击后小鼠的气道高反应发生[14]㊂国内也有研究[15]发现,内㊁外源性瘦素升高的大鼠肺组织表现为更为严重的炎症细胞的浸润,而且浸润程度与瘦素浓度呈正相关㊂但是目前仍未能破解瘦素致哮喘易感的难题,特别是缺乏瘦素引起气道炎症改变的微观证据和体外研究㊂瘦素是一种促炎因子,在应激状态下会产生增多,增多的瘦素又反过来刺激单核和巨噬细胞产生炎性反应因子,如肿瘤坏死因子α㊁I L-6和γ干扰素,从而放大炎性反应㊂瘦素还可以引起中性粒细胞趋化因子及活性氧簇的释放[16-17]㊂瘦素受体分布于全身许多组织和细胞,在小鼠和人的肺泡及支气管上皮细胞表面,肺组织内被激活的淋巴细胞和肥大细胞表面均有瘦素受体的表达[18]㊂因此,我们认为瘦素可以作用于呼吸道重要的功能细胞-支气管上皮细胞,刺激其分泌炎性因子和趋化因子,从而诱发气道炎症㊂支气管上皮细胞与哮喘的关系十分密切, 上皮缺陷假说 认为上皮细胞结构和功能的异常将导致哮喘易感性增加,有可能成为哮喘发病的启动环节㊂当受到变应原㊁病毒刺激或物理损伤的时候,气道上皮通过分泌细胞因子㊁生长因子㊁干扰素和集落刺激因子等物质来促进炎症反应和启动免疫应答[19]㊂在哮喘的发病过程中,支气管上皮细胞会分泌大量的I C AM-1㊁I L-6㊁I L-8,同时增强炎症相关转录因子N F-κB的表达,形成气道的免疫炎症微环境,导致气道高反应发生㊂本研究将3种不同浓度梯度的重组人瘦素作用于人支气管上皮细胞株,结果显示瘦素可以刺激上皮细胞分泌I L-6和I L-8,但I L-8的分泌在中低瘦素浓度作用下更为增强,同时瘦素可以刺激I C AM-1m R N A的表达,以中高浓度的瘦素作用更为明显㊂这表明了肥胖患者的高瘦素水平可能通过支气管上皮细胞诱导气道炎症和气道高反应㊂但瘦素对上皮细胞内N F-κB的表达无明显影响,这可能与瘦素作用的信号转导通路与N F-κB不同有关㊂而J A K-S T A T途径是介导瘦素信号传递的主要通路㊂瘦素的调节功能主要是瘦素受体通过J A K-S T A T途径,引发胞内级联反应,最终通过改变核内相关基因的转录来实现的[20]㊂综上所述,本实验研究主要发现肥胖小鼠的气道反应性较正常小鼠增高,同时瘦素可以刺激支气管上皮细胞分泌I L-6和I L-8,同时增强I C AM-1 m R N A的表达㊂为探寻肥胖与哮喘发生的潜在机制提供研究线索㊂参考文献[1] K i mS H,S u t h e r l a n dE R,G e l f a n dE W.I s t h e r e a l i n kb e t w e e no b e s i t y a n d a s t h m a[J]?A l l e r g y A s t h m aI mm u n o l R e s,2014,6:189-195.[2] A l a níz-F l o r e s A,C a n s e c o-R a y m u n d o M d e l R,G r a n a d o s-Góm e z A,e ta l.A s s o c i a t i o n b e t w e e n o b e s i t y a n d a s t h m as e v e r i t y i n c h i l d 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r2014,V o l.34,N o.23。
什么是瘦素(Leptin)?
什么是瘦素(Leptin)？
佚名
【期刊名称】《中国优生与遗传杂志》
【年(卷),期】2003(0)S1
【总页数】1页(P141-141)
【关键词】Lepti;瘦素;SA方法;肥胖基因;脉冲式分泌;表达数;脂肪组织;调节因子;岛素;脂肪细胞
【正文语种】中文
【中图分类】R341
【相关文献】
1.瘦素(leptin)对猪脂肪细胞FTO基因mRNA表达的影响 [J], 李永能;黄英;杨明华;孔令富;毕保良;潘洪彬;高士争;赵素梅
2.瘦素(Leptin)受体基因敲除小鼠繁育及子代小鼠基因型鉴定 [J], 季爱兵;严亮;彭文书;刘聪;龚婉莹;王桥美
3.冠心病患者血浆瘦素（Leptin）和血清cTnI CNP水平检测的临床意义 [J], 辜彦
4.瘦素（Leptin）与肥胖病的研究进展 [J], 郭欣奕;廉添添;许园园;张浙
5.甘肃高山细毛羊瘦素基因Leptin第3外显子多态性与生长速度相关性分析 [J], 刘秀;安清明;胡江;王继卿;李少斌;罗玉柱
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小鼠瘦素LEP试剂盒使用方法
小鼠瘦素(LEP)试剂盒使用方法检测范围：96T30pg/ml-800pg/ml使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中瘦素(LEP)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠瘦素(LEP)水平。
用纯化的小鼠瘦素(LEP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入瘦素(LEP)，再与HRP标记的瘦素(LEP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的瘦素(LEP)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠瘦素(LEP)浓度。
试剂盒组成1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7 终止液6ml×1瓶2 酶标试剂6ml×1瓶8 标准品（1600pg/ml）0.5ml×1瓶3 酶标包被板12孔×8条9 标准品稀释液 1.5ml×1瓶4 样品稀释液6ml×1瓶10 说明书1份5 显色剂A液6ml×1瓶11 封板膜2张6 显色剂B液6ml×1/瓶12 密封袋1个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
800pg/ml 5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液400pg/ml 4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液200pg/ml 3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液100pg/ml 2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液50pg/ml 1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
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小鼠瘦素(LEP)试剂盒使用方法
检测范围：96T
30pg/ml-800pg/ml
使用目的：
本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中瘦素(LEP)含量。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠瘦素(LEP)水平。
用纯化的小鼠瘦素(LEP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入瘦素(LEP)，再与HRP标记的瘦素(LEP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的瘦素(LEP)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠瘦素(LEP)浓度。
试剂盒组成
1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7 终止液6ml×1瓶
2 酶标试剂6ml×1瓶8 标准品（1600pg/ml）0.5ml×1瓶
3 酶标包被板12孔×8条9 标准品稀释液 1.5ml×1瓶
4 样品稀释液6ml×1瓶10 说明书1份
5 显色剂A液6ml×1瓶11 封板膜2张
6 显色剂B液6ml×1/瓶12 密封袋1个
标本要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀
释。
800pg/ml 5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液
400pg/ml 4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液
200pg/ml 3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液
100pg/ml 2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液
50pg/ml 1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
15分钟.
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止
液后15分钟以内进行。
操作程序总结：
计算
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
保存条件及有效期
1．试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月。