发光细菌

发光细菌的分类
• 明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）可在牛马的死尸和肉中繁 殖；它侵入人体则会产 生发光尿。
发光细菌的发光原理
• 一般来讲，在所有的生物发光细菌系统中，分子态的氧是直接或间接地 参与其生物化学反应的。 • 在细菌发光体中，分子态的氧氧化FMNH (还原态的黄素单核苷酸)和长 链脂肪醛，在这些反应中生成的能量不是用来质子梯度的建立、渗透反 应以及ATP的合成，而是直接以光的形式释放出来。 • 在这个反应模式中共有3种酶参与，分别为FMN还原酶，荧光素酶和脂肪 酸还原酶。
测定水域(水体)的毒性
• 众所周知，水体环境 污染是破坏水域生态 平衡的重要因素，由 于水体中的污染物比 较复杂，难以用单一 的理化指标来表示其 污染程度。1997年吴 伟等人以明亮发光杆 菌作为指示物，对渔业水域污染物的急性毒性进行 了监测，同时研究了pH值、温度对试验结果的影响。
发光细菌检测的优缺点
发光细菌的发光原理
• 在这些特殊的氧化反应过程中能够产生自由能，这些自由能能够 使最后的产物处于激发态，从而能够产生光子。 • 发光细菌生长初期发光很弱，对数生长中期发光强度达到高峰， 稳定期时发光强度下降。
发光细菌法简介
发光细菌检测原理
• 发光细菌法是利用灵敏 的光电测量系统测定毒 物对发光细菌发光强度 的影响。 • 发光细菌含有荧光素、 荧光酶、ATP等发光要 素，在有氧条件下通过 细胞内生化反应而产生微弱荧光。当细胞活性升高， 处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增 强。
发光细菌法
• 一、发光细菌简介
1.发光细菌的分类 2.发光细菌的发光原理
• 二、发光细菌法简介
1.发光细菌检测原理 2.发光细菌检测方法 仪器与材料 测定步骤 3.发光细菌法的应用
测定工业废水的毒性 测定水域(水体)的毒性
• 三、发光细菌检测的优缺点
发光细菌简介
发光细菌是一类能 够进行生物发光的 细菌。虽 多种多样，有一百 几十种，但生理特 性却非常 相似。
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优点： 由于发光细菌具有生长迅速、周 期短、测试费用低、同高等动物有着类似 的理化特性和酶作用过程，使其具有因快 速、简便、费用低廉、灵敏度高的特点， 能在短时间内得到可靠的毒性资料的优点， 因此被较多地用于毒性检测 。
发光细菌检测原理
• 发光细菌在毒物作用下， 细胞活性下降，ATP含量 水平下降，导致发光细菌 发光强度的降低。 • 实验显示，毒物浓度与菌 体发光强度呈线性负相关关系，因而，可以根据 发光细菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光度 表征毒物所在环境的急性毒性。 • 毒物的毒性可以用EC50表示，即发光细菌发光强 度降低50 时毒物的浓度。
发光细菌检测方法
Ⅰ 仪器与材料
1. 仪器：SHG--1型生物化学发光测量仪或Microtox 2055型毒物分析系 统 2. 培养基: 液体培养基：酵母膏5g，胰蛋白胨5g，NaCl40g，Na2HPO45g， KH2PO41g，甘油3g，蒸馏水1000ml，pH6．5。 固体培养基： 上述液体培养基成份加2%琼脂即可。 3. 稀释用磷酸缓冲液： Na2HPO45g ， KH2PO41g ，NaCI30g，蒸馏水 100ml，pH6.5。 4. 水样浓缩：作某化学物质的试验只需配制一定浓度的溶液即可，进行 水样中有毒有害物质的试验则需事先进行水样中毒害物的吸附，洗脱 和浓缩。 取一定体积水样V升(视水质而定)，用大孔树脂O D系列事先分别经甲 醇、乙腈、丙酮回流8小时后保存于甲醇中)，用重蒸乙醚洗脱，浓缩 至残渣，用lml重蒸过的二甲亚砜溶解之。 1ml＝lV升水样 0.1ml＝0.1V升水样
发光细菌检测方法
Ⅱ 测定步骤
1. 菌体活化：装置为0.5ml干燥菌剂，开封后注入2~3ml冷的稀释液，在旋 转混合器上振荡2～3分钟，20oC衡5 ～ 10分钟，使其活化，待发光稳定 后即为活化菌悬浮液，置4oC备用(活化后一天可用)。 2. 菌液处理：吸取不同体积(视水质而定)二甲亚砜水样浓缩液，分别在试管 中用无菌蒸馏水稀至lml，加入lml缓冲液，然后再加入0．1ml菌悬浮液， 摇匀，在一定温度下(20±1oC) 反应10min。 3. 并同时以二甲亚砜作对照试验。 4. 用SAG-I型发光测量仪测定光强度。 5. 活菌计数。在测定光强度的同时用上述加有菌悬浮液的稀释液稀释涂布 营养平板，23oC培养12 ～ 16小时，计算活菌数。 6. 结果计算：相对抑光率=对照管光强－样品管光强／对照管光强×100% 细菌死亡率＝对照活菌数—样品组活菌数／对照组合菌×100％ 对于单一化学物质当达到抑光率为50％时的浓度用EC50表示，目前已有 大量的有机物测得了其EC50值 对于水样试验结果只能用水样体积表示， EC50即表示抑光率为EC50时所 相对应的水样体积。
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• 近年来，水污染问题在稳步增长，与此同时也开发出了 许多灵敏、有效的环境监测方法，这些方法可以划分为 两类：分析技术和生物监测。
•分析技术常常用于废水常规指标的 测试，但不能反应水质毒性的大小。 •传统的生物监测以水蚤、藻类或鱼 类等为受试对象，虽然能反映毒物 对生物的直接影响，但是这些方法 的最大缺点是实验周期长，实验比 较繁琐。 •针对传统生物毒性检测方法的不足， 研究和开发了新型生物毒性监测技 术——发光细菌法。
发光细菌检测的应用
• 发光细菌法应用领域 很广泛，不仅可以被 用来测定工业废水和 水域（水体）的毒性， 还可用于测定土壤的毒性、微生物诱变剂和致 癌剂的毒性、噬菌作用、抗菌素和血清的杀菌 活性以及化合物毒性的初筛等。
测定工业废水的毒性
• 光合细菌法测定废水的 综合毒性，国外在20世 纪70年代末和80年代做 过大量的这方面的研究。 • Bolich根据采用发光细菌 方法和采用鱼类、蚤类测 定工业废水的急性毒性的 试验结果，提出了三个毒性比较方法标准 ]：① 有毒／无毒；② 百分数等级；③对数等级。 • 国内的赵毅红采用百分数等级标准对造纸废水进 行了研究，其结果为制浆废水对发光细菌有较强 的抑制作用，其毒性等级为Ⅱ级，而漂白废水多 为I或Ⅱ级