生化分析仪检测原理.
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临床生化检验反应原理
及报告审核
检验科
黄小虎
全自动生化分析仪
生化分析仪
特点
自动化
机械化的仪器 设备模仿 代替手工操作
优点
提高了工作 效率 减少了主观 误差
亮点
灵敏 准确 快速 标准化
生化分析仪分类
1 按结构原理分
管道连续流动式 分立式——常用 离心式 干片式——急诊 常用
2 按测定速度分
小型 中型 大型 超大型（模块式）
A c L
或
A
1% E1 cm L
检测方法
1.终点法 2.固定时间法 3.连续监测法
终点法
终点分析法是基于反应达到平衡时反应产物的吸收光 谱特征及其对光吸收强度的大小，对物质进行定量的一类 分析方法。反应混合物进行一定时间反应后，达到平衡终 点，即在显色反应处于稳定阶段时，监测其颜色对光的吸 收强度，以此计算待测物浓度。 终点时间的确认： 一、根据时间-吸光度曲线 如 :Trinder （偶联终点比色法）反应测尿酸，反应曲 线上3-5分钟时其A趋向稳定,故可将5分钟作为反应终点。 二、根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定 如:溴甲酚绿法测血清白蛋白
分光光度计组成
光源
样品池
滤光器
记录装置
检测器
单色器
光吸收曲线
Байду номын сангаас
溶液对不同波长光的吸收程度，通常用光吸收曲线来描述。
在分光光度法中 , 以吸光度为纵坐标, 以 波长为横坐标作图可得 光吸收曲线。 浓度不同的同种 溶液, 在该种曲线中其 最大吸收波长相同，相 应的吸光度大小则不同， 同一波长下摩尔吸数相 同。
3
按自动化程度分 半自动
全自动
2004 중점 사업 분야
生化分析仪主要构成
样品转盘 试剂仓 取样装置
加样系统
数据处理系统
构成
光源 比色杯 单色器 检测器
比色系统
供排水系统
基本原理
临床生化分析仪最常使用的是——分光光度法 分光光度法——是通过测定被测物质在特定波 长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质 进行定性和定量分析的方法。
分 类
终点法：
一点终点法 二点终点法 免疫比浊法 双波长法
一点终点法
一点终点法——在时间-吸光度曲线上吸光 度不再改变时，选择一个时间点测定吸光 度值。
通常在反应终点附近连续读两个吸光度， 求出两点的平均值，并根据两点的差值判 断反应是否达到平衡。
一点终点法的设置：
以 R和 S混合之前的空气空白、水空白或试剂空白 的吸光度值为测定计算基点，以反应达到平衡的 吸光度读数减去空白读数，校准曲线通过零点且 成直线，对于反应速度比较快的实验多用。 多见于单试剂项目，如：总蛋白，白蛋白等。
讨
论：
1.Lamber-Beer定律的适用条件（前提）: 入射光为单色光 溶液是均匀，无散射溶液 2.该定律适用于固体、液体和气体样品 3.在同一波长下，各组分吸光度具有加和性，如果 溶液中同时存在两种或两种以上的吸光性物质 ,则测得的该溶液的吸光度等于溶液中各吸光性 物质吸光度的总和，即： A（a+b+c）＝Aa＋Ab＋Ac 应用：多组分测定
肌酐在一系列酶的作用下生成H2O2，H2O2和4-氨基氨 替比林反应生成红色醌类物质，在540nm处有吸收峰。
Mg反应曲线
在碱性溶液中，Mg与二甲苯胺蓝形成重氮盐类的紫色复合物， Mg2+浓度可由二甲苯胺蓝吸光度的下降，通过光度测定法来测定。
免疫比浊法
通过物质对光的散射或透射来测定物质含量的 方法： 散射比浊：特定蛋白分析仪 透射比浊：自动生化分析仪 通常作两点终点法分析，多采用多点校准。 应用：用 Ab 测定 Ag （主要为微量蛋白： IG 、 C 、 APOA1/B 、 ASO 、 RF 、 CRP 等），要求 Ab 过量，此 时 Ag-Ab复合物的生成量随Ag的增加而递增，光散/ 透射强度与抗原量成正比。
定量分析方法
(1) 标准曲线法
(2) 标准溶液对比法 (3) 吸光系数法
标准曲线法——最经典方法
前提： A= K*BC
固定仪器和固定条件
过程：
配置标准溶液系列 → 分别 测定 A → 得C~A曲线 样品 → 测定A样 → 查得C样
标准溶液对比法
在相同的条件下，配制浓度为 C cs的标准溶液和浓度为cx的样 品溶液，在最大吸收波长处， 分别测定二者的吸光度值为As、 Ax ，依据朗伯-比尔定律得: C
As=Kbcs
s
Ax=Kbcx 则: cx = cs*Ax /As
CX i
吸光系数法
吸光系数法又称绝对法，是直接利用朗伯 - 比尔定律的数 学表达式A＝Kbc进行计算的定量分析方法。在手册中查出 1% , 并 待测物质在最大吸收波长max 处的吸光系数 或 E1 cm 在相同条件下测量样品溶液的吸光度A，则其浓度为：
Lambert-Beer（朗伯-比尔）定律
当一束平行单色光通过均匀的非 散射样品时，样品对光的吸光度 与样品的浓度及厚度成正比
A=kcb
A---吸光度 k---吸光系数 c---溶液浓度 b---液层厚度
吸光系数
定义：吸光物质在单位浓度及单位厚度时测 得的吸光度。 K值的大小取决于吸光物质的性质、入射光 波长、溶液温度和溶剂性质等，与溶液浓度 大小和液层厚度无关。但K值大小因溶液浓 度所采用的单位的不同而异。
第一点吸光度值由样本本身或第一试剂与样品的 非特异性反应有关，相当于样品空白，可有效的 消除样品自身的吸光度，如溶血，黄疸，脂血等 的干扰。
A
( 吸 光 度 ）
两点终点
An
样本空白
Am
R2
（体积校正因子）
k0
=
S+R1 S+R1+R2
T
S+R1 计算公式
（时间）
C=(An-K0*Am)*K
CRE反应曲线
免疫比浊法
优点： 方法简便 结果准确
可用于自动化仪器检测
缺点：抗体用量大 达平衡时间长
双波长法
消除样品中对测定有干扰的物质的影响； 在试样中含有两个组分a和b时，若要测定组分b,组分a有 干扰，应设法消除组分a的吸收干扰。首先选择待测组分b 的最大吸收波长 λ 1 作为测量波长，然后用作图的方法选 择参比波长λ 2 ，使组分a在这两个波长处的吸光度相等。
一点终点法反应曲线
A
( 吸 光 度 ）
Am
S+R
计算公式：
2018/11/5
T
（时间）
C=(Am-Ab)*K
21
TP反应曲线
蛋白质+Cu2+→Cu-蛋白质络合物
550nm处吸收峰
二点终点法
第二试剂加入以前，选择某一点读取吸光度 Am， 经过一定时间后反应达终点后测第二个吸光度值 An,利用两吸光度之差计算结果。
及报告审核
检验科
黄小虎
全自动生化分析仪
生化分析仪
特点
自动化
机械化的仪器 设备模仿 代替手工操作
优点
提高了工作 效率 减少了主观 误差
亮点
灵敏 准确 快速 标准化
生化分析仪分类
1 按结构原理分
管道连续流动式 分立式——常用 离心式 干片式——急诊 常用
2 按测定速度分
小型 中型 大型 超大型（模块式）
A c L
或
A
1% E1 cm L
检测方法
1.终点法 2.固定时间法 3.连续监测法
终点法
终点分析法是基于反应达到平衡时反应产物的吸收光 谱特征及其对光吸收强度的大小，对物质进行定量的一类 分析方法。反应混合物进行一定时间反应后，达到平衡终 点，即在显色反应处于稳定阶段时，监测其颜色对光的吸 收强度，以此计算待测物浓度。 终点时间的确认： 一、根据时间-吸光度曲线 如 :Trinder （偶联终点比色法）反应测尿酸，反应曲 线上3-5分钟时其A趋向稳定,故可将5分钟作为反应终点。 二、根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定 如:溴甲酚绿法测血清白蛋白
分光光度计组成
光源
样品池
滤光器
记录装置
检测器
单色器
光吸收曲线
Байду номын сангаас
溶液对不同波长光的吸收程度，通常用光吸收曲线来描述。
在分光光度法中 , 以吸光度为纵坐标, 以 波长为横坐标作图可得 光吸收曲线。 浓度不同的同种 溶液, 在该种曲线中其 最大吸收波长相同，相 应的吸光度大小则不同， 同一波长下摩尔吸数相 同。
3
按自动化程度分 半自动
全自动
2004 중점 사업 분야
生化分析仪主要构成
样品转盘 试剂仓 取样装置
加样系统
数据处理系统
构成
光源 比色杯 单色器 检测器
比色系统
供排水系统
基本原理
临床生化分析仪最常使用的是——分光光度法 分光光度法——是通过测定被测物质在特定波 长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质 进行定性和定量分析的方法。
分 类
终点法：
一点终点法 二点终点法 免疫比浊法 双波长法
一点终点法
一点终点法——在时间-吸光度曲线上吸光 度不再改变时，选择一个时间点测定吸光 度值。
通常在反应终点附近连续读两个吸光度， 求出两点的平均值，并根据两点的差值判 断反应是否达到平衡。
一点终点法的设置：
以 R和 S混合之前的空气空白、水空白或试剂空白 的吸光度值为测定计算基点，以反应达到平衡的 吸光度读数减去空白读数，校准曲线通过零点且 成直线，对于反应速度比较快的实验多用。 多见于单试剂项目，如：总蛋白，白蛋白等。
讨
论：
1.Lamber-Beer定律的适用条件（前提）: 入射光为单色光 溶液是均匀，无散射溶液 2.该定律适用于固体、液体和气体样品 3.在同一波长下，各组分吸光度具有加和性，如果 溶液中同时存在两种或两种以上的吸光性物质 ,则测得的该溶液的吸光度等于溶液中各吸光性 物质吸光度的总和，即： A（a+b+c）＝Aa＋Ab＋Ac 应用：多组分测定
肌酐在一系列酶的作用下生成H2O2，H2O2和4-氨基氨 替比林反应生成红色醌类物质，在540nm处有吸收峰。
Mg反应曲线
在碱性溶液中，Mg与二甲苯胺蓝形成重氮盐类的紫色复合物， Mg2+浓度可由二甲苯胺蓝吸光度的下降，通过光度测定法来测定。
免疫比浊法
通过物质对光的散射或透射来测定物质含量的 方法： 散射比浊：特定蛋白分析仪 透射比浊：自动生化分析仪 通常作两点终点法分析，多采用多点校准。 应用：用 Ab 测定 Ag （主要为微量蛋白： IG 、 C 、 APOA1/B 、 ASO 、 RF 、 CRP 等），要求 Ab 过量，此 时 Ag-Ab复合物的生成量随Ag的增加而递增，光散/ 透射强度与抗原量成正比。
定量分析方法
(1) 标准曲线法
(2) 标准溶液对比法 (3) 吸光系数法
标准曲线法——最经典方法
前提： A= K*BC
固定仪器和固定条件
过程：
配置标准溶液系列 → 分别 测定 A → 得C~A曲线 样品 → 测定A样 → 查得C样
标准溶液对比法
在相同的条件下，配制浓度为 C cs的标准溶液和浓度为cx的样 品溶液，在最大吸收波长处， 分别测定二者的吸光度值为As、 Ax ，依据朗伯-比尔定律得: C
As=Kbcs
s
Ax=Kbcx 则: cx = cs*Ax /As
CX i
吸光系数法
吸光系数法又称绝对法，是直接利用朗伯 - 比尔定律的数 学表达式A＝Kbc进行计算的定量分析方法。在手册中查出 1% , 并 待测物质在最大吸收波长max 处的吸光系数 或 E1 cm 在相同条件下测量样品溶液的吸光度A，则其浓度为：
Lambert-Beer（朗伯-比尔）定律
当一束平行单色光通过均匀的非 散射样品时，样品对光的吸光度 与样品的浓度及厚度成正比
A=kcb
A---吸光度 k---吸光系数 c---溶液浓度 b---液层厚度
吸光系数
定义：吸光物质在单位浓度及单位厚度时测 得的吸光度。 K值的大小取决于吸光物质的性质、入射光 波长、溶液温度和溶剂性质等，与溶液浓度 大小和液层厚度无关。但K值大小因溶液浓 度所采用的单位的不同而异。
第一点吸光度值由样本本身或第一试剂与样品的 非特异性反应有关，相当于样品空白，可有效的 消除样品自身的吸光度，如溶血，黄疸，脂血等 的干扰。
A
( 吸 光 度 ）
两点终点
An
样本空白
Am
R2
（体积校正因子）
k0
=
S+R1 S+R1+R2
T
S+R1 计算公式
（时间）
C=(An-K0*Am)*K
CRE反应曲线
免疫比浊法
优点： 方法简便 结果准确
可用于自动化仪器检测
缺点：抗体用量大 达平衡时间长
双波长法
消除样品中对测定有干扰的物质的影响； 在试样中含有两个组分a和b时，若要测定组分b,组分a有 干扰，应设法消除组分a的吸收干扰。首先选择待测组分b 的最大吸收波长 λ 1 作为测量波长，然后用作图的方法选 择参比波长λ 2 ，使组分a在这两个波长处的吸光度相等。
一点终点法反应曲线
A
( 吸 光 度 ）
Am
S+R
计算公式：
2018/11/5
T
（时间）
C=(Am-Ab)*K
21
TP反应曲线
蛋白质+Cu2+→Cu-蛋白质络合物
550nm处吸收峰
二点终点法
第二试剂加入以前，选择某一点读取吸光度 Am， 经过一定时间后反应达终点后测第二个吸光度值 An,利用两吸光度之差计算结果。