南开大学免疫学讲义-第十四章 免疫标记技术

免疫标记技术免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应；并藉助于荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。

因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。

根据试验中所用标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为免疫荧光技术，放射免疫技术，免疫酶技术，免疫电镜技术，免疫胶体金技术和发光免疫测定。

近年来，随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的进展以及应用现代高新技术建立的仪器分析日趋发展，免疫标记技术也不断完善和更新。

各种新技术和新方法不断涌现，至今已发展成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术。

在医学和其他生物学科的所究领域及临床检验上作中应用十分广泛。

第一节免疫荧光技术免疫荧光分析(Immunofluorescence assay，IFA)始创于40年代韧，1942年Coons等曾次报道用异氰酸荧光素标记抗体．检查小鼠组织切片中的可溶件肺炎球菌多糖抗原，当时内于此种荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。

直至50年代末期，Riggs等(1958)合成性能较为优良的异硫氰酸荧光黄。

Mashall等(1958)对荧光抗体的标记方法又进行改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。

一、基本原理免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。

以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。

然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。

在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。

在实际工作中，由于用荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用，所以—般通称为荧光抗体技术。

二、荧光及荧光素荧光是指—个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止：能量供给，发光亦瞬即停止。

荧光素是—种能吸收激发光的光能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。

目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明及四甲基异硫氰酸罗丹明。

三、荧光抗体染色方法1. 直接法：这是荧光抗体技术最简单和基本的方法。

滴加荧光抗体于待检标本片上，经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。

标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。

此法的优点是简单、特异。

但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。

2. 间接法：根据抗球蛋白试验的原理，用荧光素标记抗球蛋白抗体(简称标记抗抗体) 的方法。

检测过程分为两步：第一次，将待测抗体(第一抗体)加在含有已知抗原的标本片上作用一定时间，洗去末结合的抗体。

第二，滴加标记抗抗体。

如果第一步中的抗原抗体己发生结合，此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗体(一抗)分子结合，形成抗原—抗体—标记抗抗体复合物，并显示特异荧光。

此法的优点是敏感性高于直接法，而且无需制备一种荧光素标记的抗球蛋白抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。

亦可用荧光束标记葡萄球菌A蛋白。

代替标记抗球蛋白抗体用于间接法荧光染色。

且不受第一抗体来源的种局限制，但敏感性低于标记抗抗体法。

间接法有时易产生非特异性荧光，为其缺点。

此法常用于各种自身抗体的检测。

如果第一抗体为已知，间接法也可用于鉴定未知抗原。

第二节放射免疫测定放射免疫测定(Radio immunoassay，RIA)是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法，由于此项技术具有灵敏度高(可检测出毫微克(ng)至微微克(pg)，甚至毫微微克(fg)的超微量物质，特异性强(可分辨结构类似的抗原)、重复性强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化等多个优点。

因此、在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。

一、放射免疫测定(RIA)RIA是1959年Y alow和Berson首先创建的经典放射免疫分析技术，用于血清中胰岛素含量的测定。

30多年来，由于此项技术灵敏、特异、并已制成多种标准试剂盒，使用方便，应用范围十分广泛。

目前国外已成功地应用RIA检测的物质多达300余种，国内研究的被测物质也达百余种，试制的RIA试剂盒已有60余种，是测定各种微量物质不可缺少的手段。

基本原理：RIA是标记抗原和未标记抗原对有限量抗体的竞争性结合或竞争性抑制反应。

在RIA反应系统中，标记抗原(Ag*)、末标记抗原(Ag)和特异性抗体(Ab)三者同时存在时，由于两种抗原具有相同的决定簇，互相竞争结合抗体的能力相同，结果形成Ag*—Ab和Ag—Ab复合物。

当Ag*和Ab的量固定时，二者结合形成免疫复合物就受到Ag含量的制约。

如反应系统中Ag含量高时，对Ab的竞争结合能力就强，Ag—Ab 复合物的形成量就增加，Ag*—Ab复合物则相对减少；反之，当Ag含量低时，对Ab的竞争结合能力弱，Ag*—Ab复合物的形成量即增多。

因此，Ag*—Ab复合物的形成量与Ag含量之间呈一定的负相关函数共系。

二、免疫放射测定(IRMA)1968年Miles和Hales应用同位素标记的抗胰岛素抗体检测牛血清中胰岛素获得成功，为了区别于经典的放射免疫测定(RIA)，他们将其称为免疫放射测定或免疫放射度量分析(IRMA)。

由于在反应系统中使用过量的标记抗体，且无竞争性抑制反应，因此抗体与待测抗原达到结合状态的化学平衡，在2—3h即可完成，较少受到抗体亲和常数的限制，即使单克隆抗体的亲和力较低，也能满足试验要求。

同时一个抗原分子可以结合多个标记抗体分子，使IRMA的灵敏度明显高于RIA。

基本原理：IRMA是待测抗原与过量标记抗体的非竞争综合反应，然后加入固相的抗原免疫吸附剂以结合游离的标记抗体，离心除去沉淀，测定上清液中放射性强度．从而推算出检品中抗原含量。

三、放射受体分析(RRA)受体是存在于细胞膜表面、细胞浆或细胞核内的生物活性物质，其功能是和细胞外的信息分子配体特异性结合，然后将信息转变为生物效应。

受体现已可从细胞或组织个分离、提取，进行定量和定位分析。

放射受体分析或受体的放射配体结合分析，是建立在放射性标记配体与受体之间的结合反应，它是目前对受体分子进行定量和定位分析研究的灵敏、可靠的—项技术。

在药物设计、作用机理、生物效应及疾病的病因探讨，诊断和治疗等方面的应用已有较大常展。

基本原理：放射受体分析的原理与免疫放射测定相似。

应用放射性同位素标记配体，在—定条件下与相应受体结合成配体-受体复合物。

由于二者的结合是表达配体与受体间的生物活性而非免疫活性，因此具有更高的特异性。

放射受体分析可用于测定受体的亲和常数、解离常数、受体结合数以及定位分析等。

第三节胶体金标记技术胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合，已成为继荧光素、放射性同位素和酶之后，在免疫标记技术中较常用的—种非放射性示踪剂。

1971年Faulk和Taylor 首先报道将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。

1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体，建立间接免疫金染色法。

此后，胶体金作为一种新型免疫标记技术发展很快。

1978年，Geobegan等将胶体金标记抗体用于普通光镜下检测B淋巴细脑表面膜免疫球蛋白，建立了光镜水平的免疫金染色(Immunogold staining，IGS)。

1981年Danscher用银显影方法增强金颗粒的可见度，并提高了灵敏度。

1983年，Holgate等又加以改进，将免疫金染色与银显影技术相结合，称为免疫金银染色法(Immunogold silver staining，IGSS)。

由于IGS和IGSS两种方法具有试剂制备简便，特异性强，灵敏度高，应用范围广，并可用于双重和多重标记等优点，被广泛应用于医学和细胞生物学研究领域，是目前免疫组织化学技术中较常用的敏感方法之—。

近年来，胶体金标记技术进—步发展应用于免疫转印、流式细胞术(flow cytometry，FCM)、液相免疫测定、固相斑点金／银染色(dot IGS／IGSS)及斑点金免疫渗滤测定法(dot immunogold filtration assay，DIGFA)等多种标记免疫检测方法。

基本原理：胶休金标记技术(Immunogold labeling technique) 是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术；胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。

利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，胶体金还可与其他多种生物大分子结合。

根据胶体金的—些物理特性，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物所具有的免疫—生物学特性，使其在免疫学、组织学、病理学及细胞生物学标记研究工作中得到广泛应用。

第四节生物素与亲合素标记技术生物素一亲合素系统(biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。

由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。

BAS已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。

一、生物素(biotin，B)生物素广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄(α型)和肝组织(β型)，提取αβ两型的生物活性基本相同，现已可人工合成。

生物素在机体内以辅酶形式参与各种羧化酶反应，故又称为辅酶R或维生素H。

分子量为244．31，分子式为C10H36O3N2S，有两个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与亲合素结合的主要部位；II环为噻唑环，上有一戊酸侧短，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构。

利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素，以适合与各种生物大分子结合的需要。