实验二蛋白、多糖的测定
蛋白质、氨基酸、糖的鉴别试验及其比较
蛋白质1.由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。
蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。
2.双缩脲反应biuret reaction：蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用形成紫色络合物的呈色反应。
在540nm 波长处有最大吸收。
可用于蛋白质的定性和定量检测。
紫色络合物分子结构式在碱性溶液（NaOH）中，双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）能与铜离子（Cu2+）作用，形成紫色络合物（该物质的分子结构式见图），该反应即双缩脲反应。
双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一种颜色反应。
一般分子中含有两个氨基甲酪基（即肽键：-CO-NH-）的化合物与碱性铜溶液作用，就会形成紫色或蓝紫色络合物。
注：除-CO-NH-有此反应外，（-CONH2-）、（-CH2-）、（-NH2-）、（-CS-CS-NH2）等基团亦有此反应。
双缩脲反应的鉴定由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用双缩脲法测定蛋白质的含量（借助分光光度计可减小误差）。
双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。
使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。
双缩脲法的缺点是精确度低、所需样品量大。
干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如Tris缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。
配制双缩脲试剂的注意事项双缩脲试剂由NaOH溶液（0.1g/mL）和CuSO4溶液（0.01g/mL）配制而成，配制比例为5:1。
但是双缩脲试剂不用现配现用，这是与斐林试剂不同的地方之一！蛋白质检测方法比较糖分的鉴别实验1.Fehling试验生药的水浸液加Fehling试剂，于沸水浴加热数分钟，若有还原性糖类成分存在，则产生砖红色氧化亚铜沉淀。
综合实验二大豆种子萌发后糖的分离提取及测定
2
2
2
2
2
2
沸水浴中准确煮沸 5min，取出，冷却至室温
蒸馏水∕ml
9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0
葡萄糖含量∕mg
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
A540nm
B.蒽酮比色法:取干净试管 6 支，依次加入葡萄糖标准液（1mg/ml）
0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml 和 80%乙醇 1.0、0.8、0.6、0.4、
馏水放 1.5ml 小管。 （4）0.1% 酚酞指示剂。 （5）3,5-二硝基水杨酸（DNS）：称取 0.32g DNS 溶于少量热蒸馏
水中(45 度)，不停的搅拌溶解很慢,溶解后移入 50ml 容量 瓶中，加入 2mol/L 氢氧化钠溶液 16.25ml，再加入 2.25ml 丙三醇，摇匀，冷却后定容至 50ml,移入棕色瓶放冰箱待用。 （6） 80%乙醇
0
蒽酮试剂∕ml
5
5
5
5
5
5
沸水浴中准确煮沸 10min，冷却至室温放置 10min
葡萄糖含量∕mg 0
A625nm
④样品多糖的水解及提取：准确称萌发前后的大豆种子各 0.1g， 在研钵中磨成匀浆，转入置于烧杯中，加入 100ml 蒸馏水，9 0 ℃ 水浸提，浓缩为 10ml，转入离心管中加入 3 倍体积的无水乙醇沉 淀，离心( 5000 r/min，15min)得沉淀物，sevag 法去蛋白(氯仿: 正丁醇 5:1，即加入 5ml 氯仿 1ml 正丁醇洗沉淀去除蛋白)，用丙 酮 1ml、无水乙醇 1ml、乙醚 1ml 各洗两次，真快干燥得粗多糖固 体。 DNA 法多糖的测定：精密称取 1mg 粗多糖固体样品加入 10ml 80% 乙醇充分溶解，按照下表取 0.2 到 1ml 于试管中（空白中用 1ml80% 乙醇代替），加入 DNS 试剂 2ml，摇匀，于沸水浴中加热 5min，取 出后立即浸入冷水冷却至室温定容至 10ml，摇匀，然后在 540nm 波长处比色 。
多糖鉴定
莫力许(Molish)反应莫力许反应又称α-萘酚反应。
在糖的水溶液中加入α-萘酚的酒精溶液，然后沿着试管壁小心地加入浓硫酸，不要振动试管，则在两层液面间形成紫色环。
所有糖（包括低聚糖和多糖）均能发生莫力许反应，因此是鉴别糖最常用的方法之一。
[编辑本段]蒽酮比色法测定多糖含量[a]多糖含有几百个或更多残基，但只有一个还原基团，因此它的还原能力极弱，对于他们的测定，应先将它们用酸水解成单糖组分。
蒽酮比色法是一种快速而简便的定糖方法，糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛及其衍生物，该衍生物与蒽酮发生反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。
因此可用此方法测定多糖含量。
[b]试剂2g/L蒽酮试剂：溶解2g蒽酮于1L浓硫酸（98%的浓硫酸）中，当日配制使用。
0.01g/L葡萄糖溶液（可加几滴甲苯作防腐剂）0.1g/L糖元溶液[c]实验器材试管及试管架吸量管（1ml，5ml) 恒温水浴箱（100℃）制冰机紫外分光光度计滴管白瓷板制作标准曲线准确称取0.1g葡萄糖（分析纯），溶解并用蒸馏水定容至100ml后，分别取出1ml,2ml,3ml,4ml,5ml分别加入到50的容量瓶中，并用蒸馏水定容到50ml，配成浓度分别为20ug/ml,40ug/ml,60ug/ml,80ug/ml,100ug/ml,各取1ml于试管中，再加入3ml的蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，待几支试管均匀加完后，一起浸入100℃恒温水浴箱中，为防止水分蒸发，应在试管口上加盖一个玻璃球或者加一个塞子，自温度重新升至100℃起计时，准确保温10min后取出，用流动水冷却，然后，于室温中平衡片刻（约10min左右），在分光光度计上，波长620nm处，用0.5cm厚度的比色杯，以空白管做对照空白（此处的空白是指不加葡萄糖的蒽酮试剂，其他反应条件都一致），进行比色。
既得标准曲线。
如下表格[d]样品测定如上述条件一致，但要记得用除去蛋白质的样品溶液进行测定，否则会影响测定结果。
多糖含量测定的几种不同方法比较
多糖含量测定的几种不同方法比较系别:信息学院专业:生物工程学号:姓名:指导教师:指导教师职称: 讲师多糖含量测定的几种不同方法比较摘要：本文综述了多糖含量测定的几种常用方法，主要有苯酚-硫酸法、3, 5-二硝基水杨酸法(简称DNS法)、蒽酮-硫酸法、色谱法、红外光谱定量分析多糖法等。
并对这些方法的优缺点进行了分析和比较。
这些方法可为多糖含量测定提供一定的参考，并为多糖含量测定的更深入研究提供一定的理论基础。
关键词：多糖；含量；测定；方法A review of different methodsto the determination of polysaccharidesAbstract: Paper reviewed some different methods to the determination of polysaccharides, in it phenol-vitriol method, 3, 5-two nitro salicylic acid (DNS) method, anthrone-vitriol method, chromatography, infrared spectrum quantitative analysis and etc had been dealed with. And the advantages and disadvantages of these methods are analyzed and compared. It provided some related information and based theories to the determination of polysaccharides content.Key words：polysaccharides; content; determination; methods目录中文摘要 (I)英文摘要 (II)1前言 (1)2化学法测定多糖含量 (1)2.1苯酚-硫酸法 (1)2.2 3, 5-二硝基水杨酸法(简称DNS法) (2)2.3蒽酮-硫酸法 (2)3色谱法测定多糖含量的研究 (3)3.1气相色谱法(GC) (3)3.2 液相色谱法(HPLC) (3)3.3薄层色谱法(TLC) (4)4其他方法 (4)4.1红外光谱定量分析多糖法 (4)4.2生物传感器法 (5)5结论 (5)6展望 (6)参考文献 (6)致谢 (9)1前言多糖(polysaccharides，PS)是由10个以上的单糖聚合而成的生物高分子[1]。
多糖的纯化实验报告
一、实验目的1. 掌握多糖纯化的基本原理和方法。
2. 学习并运用DEAE-Sephadex A-50柱层析技术对多糖进行纯化。
3. 通过比色法测定纯化前后多糖的浓度，评价纯化效果。
二、实验原理多糖是一类重要的生物大分子，具有广泛的生物活性。
然而，天然多糖往往伴随着一些蛋白质、脂肪和色素等杂质，这些杂质会干扰多糖的结构鉴定和活性分析。
因此，对多糖进行纯化是研究多糖生物活性的关键步骤。
多糖的纯化主要包括以下步骤：1. 提取：采用热水浸提法或超声波辅助提取法等从植物、动物或微生物中提取多糖。
2. 净化：去除提取液中的蛋白质、脂肪和色素等杂质。
3. 纯化：利用DEAE-Sephadex A-50柱层析技术对多糖进行纯化。
4. 测定：通过比色法测定纯化前后多糖的浓度，评价纯化效果。
三、实验材料1. 实验药品：DEAE-Sephadex A-50柱层析材料、氨水、盐酸、无水乙醇、葡萄糖标准品等。
2. 实验仪器：层析柱、紫外可见分光光度计、离心机、移液器、容量瓶等。
四、实验方法1. 提取：称取一定量的多糖样品，加入适量蒸馏水，用超声波辅助提取法提取多糖。
提取液离心分离，取上清液作为待纯化样品。
2. 净化：将待纯化样品加入适量的氨水，调节pH值至7.0，静置一段时间。
离心分离，取上清液作为待纯化样品。
3. 纯化：将DEAE-Sephadex A-50柱层析材料预处理后，装入层析柱。
将待纯化样品上柱，用蒸馏水进行梯度洗脱。
收集洗脱液，利用紫外可见分光光度计检测洗脱液中的多糖含量。
4. 测定：配制葡萄糖标准溶液，绘制标准曲线。
将纯化后的多糖样品按照比色法进行测定，计算纯化前后多糖的浓度。
五、实验结果1. 提取：超声波辅助提取法提取多糖，提取率约为70%。
2. 净化：氨水处理去除蛋白质、脂肪和色素等杂质，纯化率约为90%。
3. 纯化：DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化，纯化率约为95%。
4. 测定：纯化前后多糖浓度分别为1.5 mg/mL和0.7 mg/mL，纯化效果良好。
多糖含量测定的方法综述
多糖含量测定的方法综述作者：何佩娟张宇洁来源：《现代食品·下》2019年第01期摘要：多糖是生命科学中不可缺少的生物大分子，具有复杂、多方面的生物活性和功能，但由于其分子量大、结构复杂，而且缺少易于检测的发光基团，成为困扰人们对多糖进行进一步研究的一个大问题。
现结合近年文献，对多糖的含量测定进行综述。
关键词：多糖;含量测定;综述Abstract：Polysaccharides are indispensable biological macromolecules in life science， which have complex and multifaceted biological activities and functions. It has been a problem with the research of polysaccharides because of its intricate structur. In conjunction with recent literature， a review of polysaccharides has been determined.Key words：Polysaccharides; Content determination; Review中图分类号：Q53多糖（polysacharides，PS）是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式（C6H10O5）n表示。
多糖在自然界分布极广，亦很重要：有的是构成动植物细胞壁的组成成分，如肽聚糖和纤维素;有的是作为动植物储藏的养分，如糖原和淀粉;有的具有特殊的生物活性，如人体中的肝素有抗凝血作用，肺炎球菌细胞壁中的多糖有抗原作用。
多糖的结构单位是单糖，多糖相对分子质量从几万到几千万。
多糖在自然界高等植物、藻类、微生物（细菌和真菌）与动物体内均普遍存在。
香菇多糖的实验报告
一、实验目的1. 学习香菇多糖的提取方法。
2. 探究香菇多糖的免疫调节作用。
3. 测定香菇多糖的体外活性。
二、实验材料1. 优质香菇子实体2. 无水乙醇3. 离心机4. 水浴锅5. 酶标仪6. 96孔板7. 免疫球蛋白G（IgG）抗体8. 抗兔IgG抗体9. 底物溶液10. 标准曲线三、实验方法1. 香菇多糖提取（1）将香菇子实体洗净，切碎，用无水乙醇提取，过滤，得到滤液。
（2）将滤液置于水浴锅中，蒸发浓缩至一定体积。
（3）用无水乙醇沉淀，离心，收集沉淀物。
（4）将沉淀物复溶于适量蒸馏水中，得到香菇多糖溶液。
2. 香菇多糖的免疫调节作用（1）将香菇多糖溶液进行稀释，设置不同浓度梯度。
（2）将稀释后的香菇多糖溶液加入96孔板，每孔100μl。
（3）加入等量的IgG抗体，混匀，37℃孵育1小时。
（4）加入抗兔IgG抗体，混匀，37℃孵育1小时。
（5）加入底物溶液，混匀，37℃孵育10分钟。
（6）用酶标仪测定各孔吸光度（OD值）。
3. 香菇多糖的体外活性测定（1）将香菇多糖溶液进行稀释，设置不同浓度梯度。
（2）将稀释后的香菇多糖溶液加入96孔板，每孔100μl。
（3）加入等量的肿瘤细胞，混匀，37℃孵育24小时。
（4）加入MTT溶液，混匀，37℃孵育4小时。
（5）用酶标仪测定各孔吸光度（OD值）。
四、实验结果与分析1. 香菇多糖提取通过实验，成功提取出香菇多糖溶液，表明香菇子实体中含有丰富的香菇多糖。
2. 香菇多糖的免疫调节作用随着香菇多糖浓度的增加，OD值逐渐升高，表明香菇多糖具有免疫调节作用。
3. 香菇多糖的体外活性测定随着香菇多糖浓度的增加，OD值逐渐降低，表明香菇多糖对肿瘤细胞具有抑制作用。
五、结论1. 本实验成功提取出香菇多糖溶液，表明香菇子实体中含有丰富的香菇多糖。
2. 香菇多糖具有免疫调节作用，能够增强机体免疫功能。
3. 香菇多糖对肿瘤细胞具有抑制作用，具有良好的抗肿瘤活性。
4. 本实验为香菇多糖在临床应用提供了实验依据，为香菇多糖的开发利用提供了理论支持。
实验七___植物多糖的制备及含量的测定2
实验七植物多糖的提取及含量的测定一实验目的及要求1 了解植物多糖的化学性质及用途2 学习制备植物多糖的原理和方法3 学习和掌握苯酚--硫酸测定多糖的原理和方法二原理多糖是一类天然高分子化合物，是由上千个单糖以糖甙相连形成的高聚物，一般有1.4及1.6甙键两种。
按其功能分：结构多糖构成植物的骨架的原料（不溶于水，如植物的纤维素和动物的甲壳多糖）；贮存多糖（淀粉和糖原）；功能多糖（如粘多糖）。
大多数多糖在水溶液只能形成胶体，无甜味，一般不能形成结晶，无还原性。
不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，具有吸湿性。
所以大多数多糖的提取多数采用热水或稀碱浸提，乙醇沉淀多糖的方法来提取多糖。
多糖的测定采用苯酚--硫酸法，其原理多糖在硫酸作用下脱水生成糠醛及其衍生物，苯酚与其显色反应呈现棕黄色，己糖在490nm(戊糖和糠醛酸在480nm)有最大吸收峰，吸收值的大小与糖含量成线性关系，测定范围在10-100ug。
该方法的特点是简单、快速、灵敏、颜色稳定目前许多研究报道多糖具有许多生理功能，如香菇降低胆固醇、抑制转氨酶活性、抗辐射等作用。
因此测定和提取植物多糖在医药方面具有重要的现实意义。
三试剂和器材1 6%的苯酚溶液2 标准葡萄糖溶液精密称取105℃干燥恒重的葡萄糖100mg，溶解定容于100ml的容量瓶中，摇匀。
用前稀释10倍，此溶液含葡萄糖0.1mg/ml。
3 浓硫酸、正丁醇、氯仿、乙醚、乙醇四操作方法1 粗多糖的提取材料处理（0.5g）→热水提取→离心分离→上清液→sevag法脱蛋白两次→离心分离→上清液→加入3倍体积的95%乙醇(过夜使多糖沉淀完全)→用80%乙醇、95%、沉淀→干燥→粗多糖→加入蒸馏水溶解→定容到50ml。
1) 称取黄芪根1 kg（0.5g），去掉杂质和泥土，粉碎成粉末2) 黄芪根粉末中加以6-7倍的蒸馏水(或CaO溶液)，煮沸1.5 h（1h），用4层纱布过滤，CaO溶液提取法：CaO+H20=Ca（OH）2一摩尔氧化钙吸收一摩尔水生成一摩尔氢氧化钙。
多糖紫外检测方法学验证
多糖紫外检测方法学验证多糖是一类具有重要生物学功能的大分子化合物，常见的多糖有淀粉、纤维素、果胶等。
为了研究多糖的结构和性质，科学家们发展了多糖紫外检测方法学。
本文将介绍多糖紫外检测方法学的原理和应用。
一、多糖紫外检测方法学的原理多糖紫外检测方法学是利用多糖溶液对紫外光的吸收特性进行定量分析的方法。
紫外光的波长范围通常在200-400纳米之间，其中200-280纳米的紫外光被称为UV-C区，280-315纳米的紫外光被称为UV-B区，315-400纳米的紫外光被称为UV-A区。
多糖在紫外光的照射下会吸收一部分光能，吸收的程度与多糖的结构和浓度有关。
二、多糖紫外检测方法学的步骤1. 准备样品：将待测多糖溶解于适当的溶剂中，通常选择水或缓冲液作为溶剂，制备一系列不同浓度的多糖溶液。
2. 设置实验条件：选择合适的紫外光波长和检测器，调节光强和波长范围。
3. 扫描光谱：将样品放入紫外光谱仪中，进行光谱扫描。
根据样品的吸光度和波长，可以得到多糖的紫外吸收光谱曲线。
4. 分析数据：根据吸光度和浓度的关系，可以绘制多糖的标准曲线。
通过测定待测样品的吸光度，可以计算出样品中多糖的浓度。
三、多糖紫外检测方法学的应用1. 多糖含量测定：通过多糖的紫外吸收光谱，可以定量测定多糖的含量。
这对于食品工业中的淀粉含量测定、生物医药领域中的多糖药物含量测定等具有重要意义。
2. 多糖结构研究：多糖的紫外吸收光谱可以反映多糖的结构特征。
通过分析吸光度和波长的变化，可以了解多糖的环糊精化学修饰、酸碱水解等对多糖结构的影响。
3. 多糖相互作用研究：多糖与其他生物大分子（如蛋白质、核酸等）之间存在相互作用。
利用多糖紫外检测方法学可以研究多糖与其他生物大分子之间的相互作用机制，如多糖的结合常数、热力学参数等。
4. 多糖降解研究：多糖在生物体内会经历降解过程。
通过多糖的紫外吸收光谱，可以研究多糖的降解动力学、降解产物的结构等。
总结：多糖紫外检测方法学是一种重要的分析技术，可以用于多糖含量测定、多糖结构研究、多糖相互作用研究和多糖降解研究等。
实验二细胞化学—多糖(PAS反应)
实验原理
PAS法对细胞内多糖的鉴定
过碘酸能够使1，2- 乙二醇基[-CHOH-CHOH-] 氧化为二醛[-CHO CHO-], 这种新生成的醛基 和Schiff试剂反应形成紫红色化合物.但是过 碘酸对1，2-乙二醇基已被取代的化合物（如 核酸所含的乙二醇基被磷酸所取代） 则无 氧化作用。多糖，粘多糖都含有1，2-乙二醇 基，均呈PAS阳性反应。在其校勘法中，经过 淀粉酶或唾液处理， 其中淀粉等贮存多糖被 分解，呈PAS阴性反应。
实验材料及试剂
材料：洋葱或大蒜 试剂：高碘酸溶液； Schiff试剂； 5%亚硫酸氢钠； 0.1%淀粉酶; 蒸馏水
实验用品
实验流程
大蒜粘液涂片 (风干) → 0.来自% 淀粉酶1-3 滴 30min ↓ ↓ 3滴0.5% HIO4 溶液 5-10min ← 风干 ← 倾去酶液 ↓ 蒸馏水轻轻冲洗两次 ↓ 3滴 Schiff试剂（避光）10min以上 ↓ 5% NaHSO3 ↓ 蒸馏水冲洗1-2次 ↓ 擦干载玻片背面镜检
大蒜黏液涂片方法
实验结果
多糖，粘多糖在PAS法中均呈阳性 反应，实验结果可显示紫红色。 在校勘法中，可被淀粉酶水解的 物质此时呈阴性反应。
实验结果
实验报告要求
摘要及关键词 前言 材料和方法 结果与分析 参考文献
常用显色反应
金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色 沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分 解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉 淀，而显示出酶活性。 偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成 耐晒染料。 Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色 品红变为红色。通常用于显示糖和脱氧核糖核酸 （Feulgen反应）。 联苯胺反应：过氧化物酶分解H202。产生新生氧,后者 再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化 合物。 普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成 普鲁士蓝。 Formazane反应：显示脱氢酶。 “Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 茚三酮反应：显示蛋白质。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
实验一 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量【实验目的】1．掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和过程。
2．熟悉蛋白质含量测定的影响因素。
【实验原理】1976年Bradford 等建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法。
染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465 nm 变为595 nm ，光吸收增加。
蛋白质-染料复合物具有较大的吸光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1 g 蛋白。
染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
由于该法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
N CH 2CH 3CH 2N +CH 3CH 2CH 2NHCH 3CH 3O CH 2CH 3SO 3-SO 3Na蛋白质+ 蛋白质-染料复合物H +考马斯亮蓝G-250（蓝色，λmax595nm ）【仪器与试剂】1．紫外-可见分光光度计，微量注射器。
2．考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%(W/V)磷酸。
【实验步骤】1．标准蛋白质溶液的配制称取牛血清白蛋白适量，加水溶解并配制成1 mg/ml 的溶液。
2．蛋白试剂的配制称取100 mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇50 ml溶解，再加入85%(W/V)磷酸100 ml，将溶液用水稀释至1000 ml。
试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%(W/V)磷酸。
3．标准曲线的制作取标准蛋白质溶液5、10、20、50、100 μl于小试管中，用水稀释至0.1 ml，然后分别加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。
以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。
4．样品测定取含10~100 μg蛋白质溶液于小试管中，加水稀释至0.1 ml，然后加入5 ml 蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
四种糖的测定方法
4种糖的测定方法总结：1、直接滴定法。
原理为糖还原天蓝色的氢氧化铜为红色的氧化亚铜。
缺点：水样中的还原性物质能对糖的测定造成影响。
2、高锰酸钾滴定法。
所用原理同直接滴定法。
缺点：水样中的还原性物质能对糖的测定造成影响，过程较为复杂，误差大。
3、硫酸苯酚法。
糖在浓硫酸作用下，脱水形成的糠醛和羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10-100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。
苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。
缺点：如果水样呈橙红色（大部分水样为黄色），会对比色法造成较大的干扰。
4、蒽酮法糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛和羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的测定。
缺点：，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅。
综合比较；采用蒽酮法能将最为准确地测定尾水中糖的含量。
（一）直接滴定法（本法是国家标准分析方法）中华人民共和国行业标准(果汁－总糖的测定－直接滴定法)SB/T 10203-1994Ⅰ、原理一定量的碱性酒石酸铜甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀，这种沉淀很快与酒石酸钠反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。
在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用标液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀，待二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由蓝色变为无色，即为滴定终点。
根据样液消耗量可计算出还原糖含量。
样品经除去蛋白质后，在加热条件下，以次甲基蓝做指示剂，滴定标定过的碱性酒石酸铜溶液（用还原糖标准溶液标定碱性酒石酸铜溶液），根据样品溶液消耗体积计算还原糖量。
基础生物化学实验报告
一、实验目的1. 掌握基础生物化学实验的基本操作技能。
2. 了解生物大分子的性质和结构。
3. 培养严谨的科学态度和实验习惯。
二、实验原理生物大分子是生物体内重要的组成部分，主要包括蛋白质、核酸、多糖等。
本实验通过观察和比较不同生物大分子的性质和结构，加深对生物大分子的认识。
三、实验器材与试剂1. 器材：显微镜、离心机、电泳仪、紫外可见分光光度计、紫外灯、移液器、吸管、烧杯、试管等。
2. 试剂：蛋白质、核酸、多糖样品，生理盐水，染色剂，缓冲液等。
四、实验步骤1. 蛋白质鉴定实验（1）观察蛋白质样品的外观，记录颜色、形态等特征。
（2）用生理盐水制备蛋白质溶液，记录浓度。
（3）观察蛋白质溶液的透明度，记录是否出现浑浊现象。
（4）将蛋白质溶液滴加到试管中，加入染色剂，观察颜色变化。
2. 核酸鉴定实验（1）观察核酸样品的外观，记录颜色、形态等特征。
（2）用生理盐水制备核酸溶液，记录浓度。
（3）观察核酸溶液的透明度，记录是否出现浑浊现象。
（4）将核酸溶液滴加到试管中，加入染色剂，观察颜色变化。
3. 多糖鉴定实验（1）观察多糖样品的外观，记录颜色、形态等特征。
（2）用生理盐水制备多糖溶液，记录浓度。
（3）观察多糖溶液的透明度，记录是否出现浑浊现象。
（4）将多糖溶液滴加到试管中，加入染色剂，观察颜色变化。
4. 蛋白质、核酸、多糖分离实验（1）将蛋白质、核酸、多糖样品分别加入离心管中，加入适量缓冲液。
（2）用离心机进行离心，观察沉淀和上清液的颜色变化。
（3）用紫外可见分光光度计测定沉淀和上清液的吸光度，计算浓度。
五、实验结果与分析1. 蛋白质鉴定实验结果蛋白质样品呈现白色固体，加入染色剂后变为红色，说明蛋白质具有染色特性。
2. 核酸鉴定实验结果核酸样品呈现白色固体，加入染色剂后变为蓝色，说明核酸具有染色特性。
3. 多糖鉴定实验结果多糖样品呈现白色固体，加入染色剂后变为红色，说明多糖具有染色特性。
4. 蛋白质、核酸、多糖分离实验结果蛋白质、核酸、多糖在离心过程中分别沉淀和溶解，说明它们在溶液中的溶解度不同。
资料-多糖含量测定的各种方法优缺点
苯酚-硫酸法测多糖含量一、原理多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。
再以比色法测定。
二、试剂1、浓硫酸：分析纯，95.5%2、80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。
3、6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。
（每次测定均需现配）4、标准葡聚糖（Dextra n,瑞典Pharma cia）或分析纯葡萄糖。
5、15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
6、5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
7、6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。
8、6mol/L 盐酸三、操作1、制作标准曲线准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
2、样品含量测定1）取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。
最后一次将残渣一起到入离心管。
注意：总的溶液不要超出10毫升。
（既不要超出离心管的容量）。
2）离心，转速3000转/分钟，共三次。
第一次15分钟，取上清液。
后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。
最后滤液保持18毫升左右。
3）水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。
(2021年整理)测定多糖的方法
(完整版)测定多糖的方法编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（(完整版)测定多糖的方法）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
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在10~100mg范围内其颜色与糖的含量成正比。
在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在波长下测定。
苯酚法可用于甲基化的糖和多糖的测定方法.简单，灵敏度高，实验室基本不受蛋白住存在的干扰.2、实验药品浓硫酸苯酚3苯酚溶液的配制（1）先配制80％苯酚溶液，然后称取80。
0g苯酚加20.0g水,使之溶解，置于冰箱中，避光长期保存。
取80％苯酚37.5mL定容到500Ml。
配制成60％的苯酚溶液，避光保存。
（2）取苯酚100g，加铝片0。
多糖分离纯化及含量测定
• 影响多糖提取率的因素有：水的用量、提取温度、浸 提固液比、提取时间以及提取次数等。
• 该种方法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低， 安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。
• 但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的 成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后 续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也 不高。
三氟三氯乙烷法
• 将多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温搅拌10 min 左右，离心分离得上层水层，水层继续用上述方 法反复处理几次，得无蛋白质的多糖溶液，此法效率 较Seavg 法高，但溶剂沸点低，易挥发，不宜大量应 用。
2. 色素的去除
• 中草药来源的多糖, 可能含有酚型化合物而颜色较深, 这类色素大多呈负性离子,不能用活性炭吸附剂脱色, 可以用弱碱性树脂DEAE-纤维素来吸附色素,这样不仅 可以达到脱色的目的, 而且可以进行多糖的分离。
• 除蛋白的方法传统上有Sevage 法、三氯乙酸法、三氟 三氯乙烷法等。
Sevage 法
• 根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用V(氯 仿)∶V(戊醇或正丁醇)为5∶1 或4∶1，混合物剧烈振 摇20～30 min，蛋白质变性生成凝胶，离心分离，分 去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。
• 一般按多糖水溶液的1/5~1/4体积加入。
• 在微波协助浸取过程中，萃取剂种类、微波剂量、物 料含水量、温度、萃取时间及pH值等都对萃取效果产 生影响。其中，萃取剂种类、微波作用时间和温度对 萃取效果影响较大。
• 微波辅助提取多糖和其他的萃取方法比较，微波萃取 效率高，操作简单，且不会引入杂质，多糖纯度高， 能耗小，操作费用低，符合环境保护要求，是很好的 多糖提取方法。
多糖分离纯化及含量测定
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实验二分光光度技术测蛋白、多糖含量
姓名：侯红芬学号：161202085 专业：细胞生物学
一、实验目的
1、掌握分光光度技术的工作原理；
2、熟悉分光光度计的操作。
3、掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和方法以及硫酸-苯酚法测定多糖含量的原理。
二、实验原理
分光光度技术是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术，分光光度计波长范围包括400-760nm的可见光区和波长范围为200-400nm的紫外光区。
而蛋白质含量有多种测定方法，考马斯亮蓝染色法就是其中一种。
考马斯亮蓝G250是一种染料，在游离状态下呈棕红色，当与蛋白质结合后成青蓝色，考马斯亮蓝G250与蛋白质结合，在0-1000μg/ml范围内，在波长595nm下的吸光度与蛋白质含量呈正比，与标准曲线对比计算后，就可得出蛋白质的含量。
多糖在硫酸作用下脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合生成一种橙红色化合物。
在10-100mg范围内其颜色与糖的含量成正比。
在490nm波长下有最大吸收峰，故用比色法在此波长下测定。
三、实验仪器和试剂
分光光度计，移液枪，试管及试管架，考马斯亮蓝，标准蛋白样品，未知样品，蒸馏水，硫酸，多糖样品。
四、实验步骤
1、蛋白质含量的测定
（1）标准蛋白溶液：称取100mg标准蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成1mg/ml的溶液。
（2）考马斯亮蓝染液：考马斯亮蓝G250100mg溶于50ml 95％乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml。
（3）标准曲线的制作。
取7支试管并做好记号，第一支试管加入5ml考马斯亮蓝染液和1ml的水，1号试管加入100μl的标准蛋白液和900μl的水，（10%浓度）然后2、3、4、5、6、7号试管依次加入20%、40%、60%、80%、100%浓度的蛋白液。
（4）样品蛋白溶液吸光度值的测定以及含量的计算。
2、多糖含量的测定
（1）配置80%苯酚：80g苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20g水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。
使用时配制6%苯酚：取75μl的80%苯酚于烧杯中，加入960μl水。
（2）制作标准曲线:准确称量50mg标准样品于500ml容量瓶中配成0.1mg/ml的标准溶液，用蒸馏水分别配成0、0.02、0.04、
0.06、0.08、0.1 mg/ml。
1 ml标准液分别加入 6% 苯酚溶液1 ml，
并迅速加入浓硫酸5 ml，静置10 min。
摇匀，30℃放置30 min 后于490nm测定OD值，以葡萄糖含量为横坐标，OD值为纵坐标，制作得到标准曲线。
（3）样品含量测定：吸取1.0ml样品液，按照上述步骤操作测
定OD490，并代入标准曲线计算样品的总糖含量。
五、注意事项
（1）标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。
（2）所作标准曲线仅供短期使用。
（3）比色皿2光面与2毛面，光学表面对准光路，不能有任何污损，否则会引起光吸收的增加。
（4）本次试验，考马斯亮蓝可使玻璃比色皿着色，酒精浸泡后清洗。
六、实验结果
表一不同浓度下标准蛋白的吸光度值
表二不同浓度下未知蛋白的吸光度值
根据以上两个表格中的数据得出，未知蛋白的含量为74.1%。
七、讨论
所做标准曲线不是太好，但在标准曲线附近有几个点还算勉强可以，未知蛋白所做的曲线不错。