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21差异蛋白SELDI蛋白质芯片筛选差异蛋白分子的二级鉴定摘要目的探讨以SELDI蛋白质芯片筛选后的细胞差异表达蛋白的分离和鉴定方法及其意义。

方法以经体外培养及10JAM褪黑素药物干预的内皮祖细胞差异表达蛋白质为研究对象，分别采用Tricine—SDS—PAGE和双向凝胶电泳方法进行差异蛋自分离及结果比较，以FTICR—MS二级质谱鉴定。

结果经Tricine—SDS —PAGE分离后，选取的分子量为53kDa左右的趋势性的差异表达蛋白进行FTICR—MS分析，质谱鉴定为微管蛋白一a3(吻合度评分为87)。

经双向凝胶电泳分离后，于凝胶近酸性端、分子量在72—95kD之间区域，选取蛋白表达量较高的一点，质谱鉴定其为人热休克蛋白90一Q(吻合度评分为91)。

结论在本文结果中，Tricine—SDS—PAGE对于大致35—70kDa范围的蛋白分离较清晰、重复性好，且样品用量少。

2-DE对最低上样量有较严格要求，但它能提供分子量、等电点双重参数来更准确定位所感兴趣蛋自点，且对较大分子量蛋白的分离效果更佳。

电喷雾傅立叶变换离子回旋共振高分辨质谱分辨率高且质量稳定性较好。

关键词：SELDI；Tricine—SDS—PAGE；双向凝胶电泳；质谱SELDI蛋白质芯片技术，即表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surface—enhanced laser desorption／ionization—time of flight—massspectromet巧)，是蛋白质组学研究中的一项新兴技术，在识别特定蛋白质表达物、蛋自质差异分析、测定血清中小分子物质含量方面提供了新的思路与方法。

该技术已经逐渐应用与临床，目前已见其应用于传染病、肿瘤等疾病诊断筛选的临床报道【1,2】。

本课题组前文‘3，41研究建立了SELDI蛋白质芯片技术检测体外培养细胞蛋白质差异表达方法，发现与传统方法比较，SELDI技术对于5kDa以下的低分子量差异蛋白和低丰度的差异蛋白质的检出效果较佳，而且该技术具有高通量、上样量低和灵敏度高等优势。

但经SELDI技术检出的差异蛋自质仅具有分子量特征，需进一步进行分离和准确鉴定。

本研究在前文基础上进一步以内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)细胞培养及褪黑素药物干预为研究对象，探讨以SELDI蛋白质芯片筛选后的细胞差异表达蛋白的进一步分离和鉴定方法及其意义。

1.1研究对象采用10μM褪黑素作用于培养至第7天并经免疫组化鉴定人脐血来源的EPCs，37℃、5％CO2条件下培养24小时后，经细胞裂解提取的细胞总蛋自(样品于一80。

C贮存)，分别采用Tricine—SDS—PAG双向凝胶电泳方法进行分离蛋自及结果比较，采用二级质谱鉴定。

2方法2.1差异蛋白质电泳方法选择2.1.1 Tricine—SDS—PAGE分离蛋白(1)溶液的配制：Tricine—SDS—PAGE的凝胶由不同分子组成的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合液聚合而成。

其中浓缩胶由3C丙烯酰胺储存液配成4％的丙烯酰胺溶液聚合而成，夹层胶由3C丙烯酰胺储存液配成10％的丙烯酰胺溶液聚合而成，致密胶由5C丙烯酰胺储存液或6C丙烯酰胺储存液配成16．5％的丙烯酰胺溶液(添加或不添加36．5％尿素)聚合而成。

凝胶配方如下表。

丙烯酰胺储存液配制：(D3C丙烯酰胺储存液：将489丙烯酰胺和1．59甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中至100mL。

②5c丙烯酰胺储存液：用重蒸水溶解479丙烯酰胺和2．59甲叉双丙烯酰胺成100ml溶液。

③6C丙烯酰胺储存液：用重蒸水溶解46．59丙烯酰胺和3．Og甲叉双丙烯酰胺成100ml溶液。

样品缓冲液：样品缓冲液由4％SDS、12％甘油、50mmol／L Tris、2％巯基乙醇(v／v)，及少许溴酚蓝组成，pH6．8。

考马斯亮蓝溶液：考马斯亮蓝G一250 100mg，95％乙醇50mL，磷酸100mL，加双蒸水定容至1000mL，用Whatman 1号滤纸过滤，4X2保存。

考马斯亮蓝脱色液：甲醇100mL，冰醋酸100mL，纯水定容至1L。

Tricine—SDS—PAGE蛋白质电泳溶液：①正极缓冲液(i0×)：121．149Tris溶于400mL重蒸水，用1．0mol／L HCI调至pH8．9，定容至500mL。

②负极缓冲液(10 X)：将60．559 Tris、89．589 Tricine及59 SDS溶于400mL 重蒸水中，加水至终体积为500mL。

③凝胶缓冲液(3X)：将181．59 Tris、1．59 SDS溶于400mL重蒸水中，用Imol／L HCI滴定至pH8．45，再加水稀释至500mL。

(2)灌胶：灌胶前，各种丙烯酰胺溶液分别加入10]aL过硫酸氨和ilaL TEMED，随即灌胶。

先灌下层的致密胶，再覆盖以中间的夹层胶，然后铺浓缩胶。

静置以聚合形成三明治式的不连续梯度凝胶。

(3)点样：取10laL蛋白质标准品，10pM药物干预后细胞提取蛋白，煮沸5min 使蛋自质与SDS结合变性，小心点入凝胶的点样孔中。

(4)电泳：内槽加负极电泳缓冲液，外槽加正极电泳缓冲液，形成Trcine—SDS—PAGE电泳系统，20mA恒流电泳3h。

考马斯亮兰染色后，用甘油溶液孵育，并用凝胶成像仪成像。

2．1．2双向凝胶电泳分离蛋白(1)用2D clean—up试剂盒抽提蛋自样品(除杂)(2)用双向电泳蛋白定量试剂盒测定样品浓度(3)双向电泳分离样品I第一向等电聚焦(IEF)①将上述除杂后的样品，加水化液振荡溶解，放入标准型胶条槽中。

②选用7cm IPG胶条，从酸性端(标“+”端)一侧剥去保护膜，胶面朝下，先将IPG胶条阳极端朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免产生气泡，最后放下IPG胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。

③IPG胶条上覆盖适量Immobiline DryStrip覆盖油，盖上盖子。

将标条槽的尖端背面阳极与IPGphor仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背与IPGphor仪器的阴极平台接触。

④设置IPGphor仪器运行参数：Ettan TM IPGphor II TM Prot#3．File 7cm(20℃，50μA／Strip)Step1 Stp 30V 14hStep2 Stp 200V lhStep3 Stp 500V lhStep4 Grd 1000V lhStep5 Grd 2000V lhStep6 Grd 5000V lhStep7 Stp 5000V 15000(v·h)Step8 Stp 200V 3hStep9 Stp 0V END⑤配制平衡胶条所需溶液：4X分离胶缓冲液(1．5M Tris—HCI，pH8．8和0．4％(w／v}SDS)：45．59Tris和lgSDS溶于200mL去离子水中，用6N HCl调节pH到8．8，最后用去离子水将体积补足到250mL，加入25mg叠氮钠并过滤。

平衡缓冲液(0．05M Tris—HCl，pH8．8，6M尿素，30％(w／v)甘油和2％(W／v}SDS)：1809尿素，1509甘油，109 SDS和16．7mL分离胶缓冲液溶于去离子水中，最终将体积补足到500mL。

溴酚蓝溶液：25mg溴酚蓝溶于10mL分离胶缓冲液中。

⑥IPG胶条的第1次平衡：取出IPG胶条放入玻璃管中，加入使用前加入25mgDTT的2．5mL平衡缓冲液和12．5BL溴酚蓝溶液，用Parafilm封口，在振荡仪上振荡15min，倒掉平衡缓冲液。

IPG胶条的第2次平衡：加入使用前加入100mg碘乙酰胺的2．5mL平衡缓冲液和12．5BL溴酚蓝溶液，用Parafilm 封口，在振荡仪上振荡15min，倒掉平衡缓冲液。

⑦用去离子水润洗IPG胶条1秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上数分钟，以去除多余的平衡缓冲液。

⑧IPG胶条的转移：将IPG胶条放在位于玻璃板之间的凝胶面上，使胶条支持膜贴着其中的一块玻璃板，用一薄尺将IPG胶条轻轻向下推，使整个胶条下部边缘与板胶的上表面完全接触。

确保在IPG胶条与板胶之间以及玻璃板与塑料支持膜间无气泡产生。

⑨加入分子量标准蛋白质：分子量标准蛋白质溶液与等体积的1％琼脂糖溶液混合后，加入到IEF上样滤纸片上，然后用镊子将上样滤纸片放置在IPG胶条末端一侧，与板胶的凝胶表面接触。

⑩用琼脂糖密封液封顶：用少量的密封液(约1一1．5mL)使IPG胶条被完全覆盖住，在此过程中不要产生气泡。

II第二向SDS—PAGE①溶液配制：丙烯酰胺／甲叉双丙烯酰胺溶液(30．8％T，2．6％C)：30％(W／V)丙烯酰胺和0．8％甲叉双丙烯酰胺的水溶液。

将3009丙烯酰胺和89甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离子水将体积补足到1000mL。

分离胶缓冲液(1．5M Tris—HCI，pH8．6和O．4％(w／v)SDS)：90．859 Tris和29 SDS溶于400mL去离子水中，用6N HCI调节pH到8．6，最后用去离子水将体积补足到500mL，加入50mg叠氮钠并过滤。

lO％{w／v)过硫酸铵溶液：ig过硫酸铵溶于10mL去离子水中。

覆盖液(缓冲液饱和的异丁醇)：混合20mL上述分离胶缓冲液和30mL异丁醇，数分钟后去掉异丁醇层。

取代液(50％(v／v)甘油和0．0 1％溴酚蓝水溶液)：混合250mL甘油(100％) 和250mL去离子水，再加入50mg溴酚蓝，搅拌数分钟。

低熔点琼脂糖溶液：含有0．5％(w／v)低熔点琼脂糖的电极缓冲液。

②灌胶：本实验选用分离范围为14—200kD、浓度为10％的SDS分离胶。

其组成为：10％T的均匀胶，2．6％C，0．I％SDS，375mM Tris—HCI，pH8．8。

配制方法是：单体贮存液33．3mL、4X分离胶缓冲液25mL和IO％SDS ImL溶解于40．2mL去离子水中，灌胶前加入TEMED 33ILL和10％过硫酸铵500DL。

按仪器说明书装好灌胶模具，倒入凝胶溶液(本实验制备Imm厚的胶，需凝胶溶液1 0mL)。

灌胶后立即在凝胶上方铺上一层用水饱和的异丁醇覆盖液，以减少凝胶暴露于氧气，形成平展的凝胶上样面。

③电泳：电泳槽中装满电泳缓冲液，打开温控系统，调节温度为12。

C；将平衡好的IPG胶条浸入电极缓冲液中数秒；将IPG胶条小心放置于SDS胶面上，轻压使二者充分结合，上面覆盖2mL热的琼脂糖溶液(75。

C)，使琼脂糖在5min内凝固；将胶盒插入电泳槽中，开始垂直的SDS胶电泳(参数设置：10mA／gelI 5min，之后20mA／gel约5h)当溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳；跑好的胶转移到染色盒里固定，准备染色。