最新21差异蛋白汇总

21差异蛋白

SELDI蛋白质芯片筛选差异蛋白分

子的二级鉴定

摘要

目的探讨以SELDI蛋白质芯片筛选后的细胞差异表达蛋白的分离和鉴定方法及其意义。方法以经体外培养及10JAM褪黑素药物干预的内皮祖细胞差异表达蛋白质为研究对象，分别采用Tricine—SDS—PAGE和双向凝胶电泳方法进行差异蛋自分离及结果比较，以FTICR—MS二级质谱鉴定。结果经Tricine—SDS —PAGE分离后，选取的分子量为53kDa左右的趋势性的差异表达蛋白进行FTICR—MS分析，质谱鉴定为微管蛋白一a3(吻合度评分为87)。经双向凝胶电泳分离后，于凝胶近酸性端、分子量在72—95kD之间区域，选取蛋白表达量较高的一点，质谱鉴定其为人热休克蛋白90一Q(吻合度评分为91)。结论在本文结果中，Tricine—SDS—PAGE对于大致35—70kDa范围的蛋白分离较清晰、重复性好，且样品用量少。2-DE对最低上样量有较严格要求，但它能提供分子量、等电点双重参数来更准确定位所感兴趣蛋自点，且对较大分子量蛋白的分离效果更佳。电喷雾傅立叶变换离子回旋共振高分辨质谱分辨率高且质量稳定性较好。

关键词：SELDI；Tricine—SDS—PAGE；双向凝胶电泳；质谱

SELDI蛋白质芯片技术，即表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surface—enhanced laser desorption／ionization—time of flight—massspectromet巧)，是蛋白质组学研究中的一项新兴技术，在识别特定蛋白质表达物、蛋自质差异分析、测定血清中小分子物质含量方面提供了新的思路与方法。该技术已经逐渐应用与临床，目前已见其应用于传染病、肿瘤等疾病诊断筛选的临床报道【1,2】。本课题组前文‘3，41研究建立了SELDI蛋白质芯片技术检测体外培养细胞蛋白质差异表达方法，发现与传统方法比较，SELDI技术对于5kDa以下的低分子量差异蛋白和低丰度的差异蛋白质的检出效果较佳，而且该技术具有高通量、上

样量低和灵敏度高等优势。但经SELDI技术检出的差异蛋自质仅具有分子量特征，需进一步进行分离和准确鉴定。本研究在前文基础上进一步以内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)细胞培养及褪黑素药物干预为研究对象，探讨以SELDI蛋白质芯片筛选后的细胞差异表达蛋白的进一步分离和鉴定方法及其意义。

1.1研究对象

采用10μM褪黑素作用于培养至第7天并经免疫组化鉴定人脐血来源的EPCs，37℃、5％CO2条件下培养24小时后，经细胞裂解提取的细胞总蛋自(样品于一80。C贮存)，分别采用Tricine—SDS—PAG双向凝胶电泳方法进行分离蛋自及结果比较，采用二级质谱鉴定。

2方法

2.1差异蛋白质电泳方法选择

2.1.1 Tricine—SDS—PAGE分离蛋白

(1)溶液的配制：Tricine—SDS—PAGE的凝胶由不同分子组成的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合液聚合而成。其中浓缩胶由3C丙烯酰胺储存液配成4％的丙烯酰胺溶液聚合而成，夹层胶由3C丙烯酰胺储存液配成10％的丙烯酰胺溶液聚合而成，致密胶由5C丙烯酰胺储存液或6C丙烯酰胺储存液配成16．5％的丙烯酰胺溶液(添加或不添加36．5％尿素)聚合而成。凝胶配方如下表。

丙烯酰胺储存液配制：

(D3C丙烯酰胺储存液：将489丙烯酰胺和1．59甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中至100mL。

②5c丙烯酰胺储存液：用重蒸水溶解479丙烯酰胺和2．59甲叉双丙烯酰胺成100ml溶液。

③6C丙烯酰胺储存液：用重蒸水溶解46．59丙烯酰胺和3．Og甲叉双丙烯酰胺成100ml溶液。

样品缓冲液：样品缓冲液由4％SDS、12％甘油、50mmol／L Tris、2％巯基乙醇(v／v)，及少许溴酚蓝组成，pH6．8。

考马斯亮蓝溶液：考马斯亮蓝G一250 100mg，95％乙醇50mL，磷酸

100mL，加双蒸水定容至1000mL，用Whatman 1号滤纸过滤，4X2保存。

考马斯亮蓝脱色液：甲醇100mL，冰醋酸100mL，纯水定容至1L。Tricine—SDS—PAGE蛋白质电泳溶液：

①正极缓冲液(i0×)：121．149Tris溶于400mL重蒸水，用1．0mol／L HCI调至pH8．9，定容至500mL。

②负极缓冲液(10 X)：将60．559 Tris、89．589 Tricine及59 SDS溶于400mL 重蒸水中，加水至终体积为500mL。

③凝胶缓冲液(3X)：将181．59 Tris、1．59 SDS溶于400mL重蒸水中，用Imol／L HCI滴定至pH8．45，再加水稀释至500mL。

(2)灌胶：灌胶前，各种丙烯酰胺溶液分别加入10]aL过硫酸氨和ilaL TEMED，随即灌胶。先灌下层的致密胶，再覆盖以中间的夹层胶，然后铺浓缩胶。静置以聚合形成三明治式的不连续梯度凝胶。

(3)点样：取10laL蛋白质标准品，10pM药物干预后细胞提取蛋白，煮沸5min 使蛋自质与SDS结合变性，小心点入凝胶的点样孔中。

(4)电泳：内槽加负极电泳缓冲液，外槽加正极电泳缓冲液，形成Trcine—SDS—PAGE电泳系统，20mA恒流电泳3h。考马斯亮兰染色后，用甘油溶液孵育，并用凝胶成像仪成像。

2．1．2双向凝胶电泳分离蛋白

(1)用2D clean—up试剂盒抽提蛋自样品(除杂)

(2)用双向电泳蛋白定量试剂盒测定样品浓度

(3)双向电泳分离样品

I第一向等电聚焦(IEF)

①将上述除杂后的样品，加水化液振荡溶解，放入标准型胶条槽中。

②选用7cm IPG胶条，从酸性端(标“+”端)一侧剥去保护膜，胶面朝下，先将IPG胶条阳极端朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免产生气泡，最后放下IPG胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。