枯草芽孢杆菌的分离纯化教学教材
产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离
实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离一、教学目标及基本要求1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法二、实验原理枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。
枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。
由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。
但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。
例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。
又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。
1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。
由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。
2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。
利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。
根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。
3. 枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。
有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。
菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。
在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。
菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。
4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。
枯草芽孢杆菌的培养、筛选分离和鉴别
03
枯草芽孢杆菌的筛选分离
枯草芽孢杆菌的分离纯化
制样品稀释液
取得土壤样g，放入盛 1 有99ml的无菌水锥形
瓶中，充分振荡。
培养
用移液枪将各个浓度梯度的一 3 定量稀释液接种到开始时制作 好的培养基上，用无菌刮铲涂 匀。37℃下倒置培养24小时。
加热筛选能形成芽孢的 细菌
在超净工作台中，将装有锥形瓶 2 的菌悬液加塞、包扎、摇匀后放
3
高压灭菌：将分装包扎的培养基放入 高压蒸汽灭菌锅中进行高压蒸汽霉菌， 用0.075MPa灭菌30分钟。（使用高 压蒸汽灭菌锅要注意放完冷气。灭菌 结束后等到气压降到“0”时才能打 开放气阀。）
培养基 制备
2
精确称取蔗糖30g、磷酸二氢钾4.5g、 硫酸铵2.5g、蛋白胨10g、碳酸钙 2g、酵母膏5g和琼脂20g，然后在 1000ml水中充分溶解。
道中的游离氧，造成肠道
2
低氧，促进有益厌氧菌生
长，间接抑制其它致病菌
生长。
4.
枯草芽孢杆菌菌体自身合成α -
4
淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤
维素酶等酶类，在消化道中与
动物体(人体)内的消化酶类一
同发挥作用。
3.
3
刺激动物(人体)免疫器官
的生长发育，激活T、B
淋巴细胞，提高免疫球
蛋白和抗体水平，增强
细胞免疫和体液免疫功
能，提高群体免疫力。
生物科学 进入人体，能100%到达大小肠，抑
制致病菌，促进有益厌氧菌生长，并产生 乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑 制其它致病菌生长。提高免疫球蛋白和抗 体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能， 提高群体免疫力。合成α -淀粉酶、蛋白酶、 脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与 动物体(人体)内的消化酶类一同发挥作用。
枯草芽孢杆菌SH7抑菌蛋白的分离纯化及对烟草青枯病菌的抑制作用
生 素和 抗菌 蛋 白［５ 国 内对 Ｂ ｃｌ ｓ ｕ ｔｉ 及其 代 ４］ －。 ａ ｉｕ ｂｉｓ ｌ ｓ ｌ
验 防 效较好 ，并初 步证 明 了该菌 产生 的拮抗 物质 为 蛋 白类 物质 。本 实验 对 Ｓ Ｈ７菌 株产 生 的拮 抗蛋 白
进 行 分 离 纯 化 ， 并 初 步 研 究 了 该 抑 菌 蛋 白对
Ｉ ｏ ａ ｉｎ Ｐｕ ｉｃ ｔ ｎ ａ ｄ Ａｎ ａ ｏｎｓ ｏ ｘ ｒ ｃ ｌ ｌ ｒＰｒ ｔ ｉ ｓ ｌｔ ， ｒ ｉａ ｉ ｎ ｔ ｇ ｉ ｍ ｆＥ ｔａ ｅ ｌ ａ ｏ ｅ ｎ ｏ ｆ ｏ ｕ
ｆ ｍ ｃｌ ｓ ｓ ｂ ｉｓ Ｓｔ ｉ ｒ Ｏ Ｂａ ｉｕ ｕ ｔｉ ｒ ｎ ＳＨ７ ｌ ｌ ａ
中国烟草科学
２ １ ，３ １：１．５ ０ ０ １（ ） ３１
ｌ ３
枯 草 芽孢 杆 菌 Ｓ Ｈ７抑 菌 蛋 白的 分 离纯 化
及 对 烟 草 青枯 病 菌 的抑 制作 用
张秀玉，孔凡 玉 ，王 静 ，张成省 ，李佰 乐
（ 国家烟草专卖 局烟 草病 虫害监测 与综合 治理重 点开放实验室，中国农业科 学院烟草研 究所 ，青 岛 ２ ６０ ） ６ １１
Ｋｅ ｗｏｒ ： ｃｌ ｓｓ ｂｉ ｓ ｐｏｅｎ ｐ ｒｆ ａｉｎ ａ ｔБайду номын сангаас ｎｓ ａｔｖｔ ｙ ｄｓ Ｂａ ｉｕ ｕ ｔｉ； ｒ ｔｉ ； ｕ ｉ ｔ ； ｎａ ｏ ｍ ｃｉｉ ｌ ｌ ｉ ｃ ｏ ｉ ｙ
枯草芽孢杆菌实验报告
微生物技术综合实验年级：13级生物工程（专升本）班级：学号：姓名：徐红贞指导老师：刘凤霞教授日期：二零一三十月五号目录1实验目的及原理 (1)1.1实验目的 (1)1.2实验原理 (1)2实验材料 (1)2.1实验仪器 (1)2.2实验试剂 (1)2.3培养基 (2)2.3.1 生长培养基 (2)2.3.2鉴定培养基 (2)2.3.3摇瓶培养基 (2)3试验方法 (2)3.1仪器的准备 (2)3.2培养基的配置 (2)3.3初步筛选及鉴定 (2)3.3.1采集土样 (3)3.3.2富集培养 (3)3.3.3稀释分离、纯化 (3)3.3.4初筛 (3)3.4复筛及鉴定 (4)3.4.1革兰染色 (4)3.5酶活力的测定 (4)3.5.1摇瓶培养 (4)3.5.2酶液稀释 (4)3.5.3酶液测定 (4)4结果分析 (5)4.1平板涂布分离 (5)4.2平板划线分离 (5)4.3初筛 (5)4.4复筛 (5)4.5摇瓶培养 (6)4.6酶活力测定 (6)5参考资料 (7)6附录 (8)微生物上游技术综合实验枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定1.实验目的及原理1.1实验目的（1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。
（2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。
（3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。
（4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。
（5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。
1.2实验原理选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。
将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。
枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法
枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，具有重要的应用价值，被广泛应用于农业生产中的抗病、增产、改善土壤等方面。
因此，对枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法进行研究具有重要意义。
以下将介绍枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法。
一、枯草芽孢杆菌分离方法：1. 样品采集：根据研究需要，选择合适的样品，如土壤、植物组织、水等。
采集样品时要注意避免外源性污染，尽量避免使用过多的抗生素。
2. 样品处理：将采集到的样品进行处理，如土壤样品需要经过悬浮液稀释法进行样品制备，植物组织需要进行消毒处理等。
3. 分离培养基选择：根据枯草芽孢杆菌的生长特性，选择合适的分离培养基。
通常可以选用液体培养基（如TSA、LB培养基）或固体培养基（如TSA、PDA培养基）。
固体培养基还可以添加适当的抑菌剂来抑制其他细菌的生长。
4. 分离培养：将样品制备好后，均匀涂布在选择的培养基上，然后进行培养。
液体培养基需要在适当的温度和速度下进行摇床培养，固体培养基需要静置培养。
培养时间一般为24-48小时。
5. 子培养：在培养基上出现孤立的菌落后，用离心管吸取菌落，再划线接种到新的培养基上，进行连续传代培养。
一般选择形态特征明显、菌落形状规则的菌落进行子培养。
6. 纯化：通过连续传代培养，最终获得纯种的枯草芽孢杆菌。
纯化的细菌可以通过形态观察、生理生化特性检测等方法进行初步鉴定。
二、枯草芽孢杆菌鉴定方法：1. 形态观察：观察菌落形态、色素、菌体形态等。
枯草芽孢杆菌的菌落通常呈乳白色或灰白色，形状为圆形或不规则形。
2. 胞内酶活性检测：通过检测枯草芽孢杆菌的胞内酶活性来鉴定，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等。
常用方法为利用不同培养基的酶基质进行相关酶活性检测。
3. 生理生化特性检测：包括对枯草芽孢杆菌的耐温、耐酸碱性、氧化还原反应等生理生化特性的检测。
4. 分子生物学鉴定方法：利用分子生物学方法，如PCR、16S rRNA基因测序等来鉴定枯草芽孢杆菌。
枯草芽孢杆菌的分离纯化和初步鉴定方案
枯草芽孢杆菌的分离纯化和初步鉴定方案3班第3组周三15:30-17:00周四08:30-09:50组长：刘晨阳组员：吕宛容，韩晴，董春燕，邢爽，高倩倩，薛琳琳，邵宇婷，吴子侥枯草芽孢杆菌的分离纯化和初步鉴定一、目的要求1、掌握分离、纯化枯草芽胞杆菌的方法。
2、掌握如何鉴别所得菌是否为枯草芽胞杆菌的方法。
二、实验原理芽孢杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。
单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽胞0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽胞形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。
其分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。
由于其能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。
但是许多芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。
例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。
又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。
芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。
其菌落变化很大，芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。
在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。
菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。
芽孢杆菌能产生芽孢，芽孢具有较强的抗高温能力在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性，因而得到芽孢菌属，经过进一步的分离纯化及生理生化鉴定得到芽孢杆菌。
枯草芽孢杆菌的分离及筛选教学文案
枯草芽孢杆菌的分离及筛选微生物设计性实验枯草芽孢杆菌的分离及筛选1 实验目的掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。
了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。
根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。
2 实验原理枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
需氧菌。
有的菌株是α -淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。
广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。
选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。
利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。
然后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。
再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。
3 实验材料3.1 选择培养基本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。
配方：牛肉膏 5.0g蛋白胨 10.0g氯化钠 5.0g可溶性淀粉 10.0g琼脂 20g蒸馏水 1000ml调整 pH 至 7.2配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。
3.2 溶液或试剂牛肉膏 1.25g蛋白胨 2.5g氯化钠 1.25g可溶性淀粉 2.5g琼脂 5g碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克，100毫升0.01NHCL。
3.4 仪器或其他用品平板培养皿10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。
从土壤中分离纯化枯草芽孢杆菌论文
从土壤中分离纯化枯草芽孢杆菌论文陈翰梁羽吴玉芳陆艺中摘要：芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性，因而得到芽孢菌属，经过进一步的分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。
许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀粉水解成无色糊精等小分子物质或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。
关键词：芽孢杆菌淀粉酶无色糊精麦芽糖掌握芽孢杆菌属常见种的分离、鉴定方法和技术。
将土壤样品中分离的芽孢杆菌属未知种鉴定到属。
枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。
单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
需氧菌。
可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。
广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。
许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀粉水解成无色糊精等小分子物质或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。
1材料与方法1.1试验材料土壤提取液1.1.2培养基牛肉膏5克蛋白胨10克氯化钠5克可溶性淀粉2克琼脂15-20克蒸馏水1000毫升1000毫升121℃灭菌20min1.1.3主要试剂蔗糖、葡萄糖、淀粉、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂1.1.4仪器设备显微镜培养皿试管三角瓶烧杯移液管涂布棒载玻片接种环接种针试管架灭菌锅培养箱1.2操作步骤菌种的分离和纯化（1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带回实验室分离。
（2）平板的制备：溶化三角瓶中的牛肉汤蛋白胨培养基，以每皿20ml 左右倒6个平板。
（3）稀释分离法：称取肥土5g放入含有45ml水的三角瓶中，摇动片刻，然后将此瓶用小火加热至悬浊液沸腾，维持30min。
实验题目枯草芽孢杆菌的分离
实验题目枯草芽孢杆菌的分离、纯化和鉴定一、实验目的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）广泛存在于土壤、植物根际体表等，其好氧、嗜温，极易分离与培养。
由于枯草芽孢杆菌生长快，具有广谱抗菌活性和很强的抗逆能力，并且对人畜无毒，不污染环境，因此已作为一种理想的生防菌广泛应用于多种植物病害的防治且备受关注。
本实验通过温度筛选法和选择性培养基筛选法分离枯草芽孢杆菌，并针对其生理生化特征进行纯化和鉴定及16S rDNA基因序列进行分析。
二、实验原理枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。
单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆倒柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
需氧菌。
可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。
广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。
枯草芽孢杆菌的分离方法：（1）温度筛选法：枯草芽孢杆菌能产生芽孢，在孢子状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60°C高温，在120°C温度下能存活20分钟，利用枯草芽孢杆菌的这一特性，可利用高温水浴使不能产生芽孢的细菌失去活性，得到芽孢菌属，经过进一步的分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。
（2）选择性培养基筛选法：枯草芽孢杆菌培养基的组分是由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、碳酸钙等5种原料构成,将5种原料作为枯草芽孢杆菌培养有影响的因素,通过试验数理统计的直观和理论分析,对其配方进行优化，当培养基的配方为无水葡萄糖3.50g/L、蛋白胨0.83g/L、酵母膏0.50g/L、磷酸二氢钾0.35g/L和碳酸钙0.25g/L,温度(34±2)℃时,培养16h即可达到生长峰值。
《枯草芽孢杆菌》课件
未来发展方向与挑战
未来研究需要深入挖掘枯草芽孢杆菌 的生物活性物质及其作用机制，为其 在医药、农业和环保等领域的应用提 供理论支持。
枯草芽孢杆菌在食品和饲料添加剂领 域的应用前景广阔，但需要加强对其 安全性评价和质量控制的研究。
针对枯草芽孢杆菌的发酵工艺和大规 模生产技术需要进行优化，以提高其 产量和生物活性物质的稳定性。
总结词
枯草芽孢杆菌的培养方法与条 件对其生长和代谢具有重要影
响。
温度
枯草芽孢杆菌的最适生长温度为 30-37℃，过高或过低的温度均 会影响其生长。
湿度
保持培养环境的相对湿度在适 宜范围内，以防止培养基干燥 或过度湿润。
氧气
根据需要选择有氧或厌氧培养 ，枯草芽孢杆菌既能在有氧环 境下生长，也能在厌氧条件下
06 枯草芽孢杆菌的研究进展 与展望
研究现状与趋势
枯草芽孢杆菌是土壤和植物微生态中的重要成员，具有多种生物活性，如抗菌、抗 肿瘤、免疫调节等。
目前，枯草芽孢杆菌的研究主要集中在基因组学、蛋白质组学和代谢组学等方面， 旨在揭示其生物活性机制和潜在应用价值。
随着测序技术和生物信息学的不断发展，枯草芽孢杆菌的全基因组测序已经完成， 为其功能基因组学研究奠定了基础。
培养基的选择与制备
01
02
03
总结词
培养基是枯草芽孢杆菌生 长的必要条件，选择合适 的培养基对于其分离和培 养至关重要。
成分
培养基通常包含碳源、氮 源、无机盐、维生素等， 根据枯草芽孢杆菌的生长 需求进行选择和配比。
制备方法
按照配方比例称取各成分， 溶解、调节pH值后进行灭 菌处理，备用。
培养方法与条件控制
应用
枯草芽孢杆菌在农业、工业和医学等 领域有广泛应用，如生物肥料、生物 防治、生物降解等。
微生物综合实验 枯草芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌的分离、提纯摘要枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。
单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
需氧菌。
可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。
广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。
关键词枯草芽孢杆菌提纯无菌培养一、实验目的1、学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。
2、学习和掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。
3、锻炼培养学生综合应用微生物实验方法的能力。
4、培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。
二、实验原理芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常为圆形或椭圆形。
枯草培养法是利用枯草杆菌产生芽孢这一性质。
因为芽孢对不良环境有较强的抗性。
所以枯草在煮沸过程中，不含芽孢的细菌被杀死，而含有芽孢的枯草杆菌能够生存下来，在适宜的条件下进行繁殖生长。
芽孢染色法是利用同一种细菌的芽孢和菌体对不同染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行着色，因芽孢壁厚，透性低，着色脱色均较困难，而使芽孢和菌体呈不同的颜色便于区分。
因此芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿，在加热的条件下进行，因孔雀绿与菌体结合较差，所以易被水冲洗掉，而芽孢中的孔雀绿却难溶出，水洗后，再用一种呈红色的碱性染料加以复染，结果，菌体为红色，芽孢为绿色。
三、实验器材1、培养基淀粉培养基2、材料：枯草3、器材：显微镜、三角烧瓶、温箱、酒精灯、棉塞、接种环、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、无菌培养皿、涂布器等。
4、流程：倒平板→制备枯草稀释液→涂布→培养→初筛→复筛四、实验步骤1、土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采取的土壤放入纸袋带回实验室。
枯草芽孢杆菌分离、培养、纯化
一、菌种提取（1）制备样品稀释溶液称取样品10g，放入盛有90ml无菌水并带入玻璃珠的三角烧瓶，振动约20min，使土样与水分混合，将细胞分散。
用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释度的土壤溶液。
（2）涂布用无菌吸管分别由10-4，10-5，10-6三管土壤稀释液中各取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基。
（3）培养置于37℃温室培养箱，培养24h，固体培养基组成：蒸馏水1L,葡萄糖20g,蛋白胨15g,氯化钠5g,牛肉膏0.5g,琼脂20g二、菌种分离用接菌针挑取单个菌落，接菌到固体培养基。
培养24h。
固体培养基组成同上。
三、菌株生化鉴定1. 革兰氏染色（1）制片取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。
（2）初染滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。
（3）媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
（4）脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。
*革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约20-30s。
（5）复染用番红染液复染约2min，水洗。
（6）镜检干燥后，用油镜观察。
菌体被染成蓝紫色是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。
2. 芽孢染色：改良的Schaeffer-Fulton氏染色法（1）制备菌悬液：加1—2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2—3环的菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。
将大肠杆菌和枯草杆菌分离纯化的方法
将大肠杆菌和枯草杆菌分离纯化的方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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白牦牛肠道枯草芽孢杆菌的分离纯化及安全性试验研究
１ ． １ ． １ 实验 茵 无 菌 采 集 健 康 待屠 宰 白牦 牛直 肠 粪便 ， 由本 院微生 物实 验室分 离纯 化 。 １ ． １ ． ２ 实验 动物 １ ８ －２ ５ ｇ清 洁级 昆 明系小 白鼠 ， 购 白兰 州生 物制 品所 实验动 物 中心 。 １ ． １ ． ３ 主要 试 剂 用 于初 次 分 离 的 普 通 琼 脂 培 养 基、 营 养 肉汤 培养 基 、 ＭＲ Ｓ选 择 培养 基 及 革 兰 氏染 色 液 中所需 的试 剂均 为分 析纯 。 １ ． １ ． ４ 仪 器设 备 电子 天 平 、 全 自动 高 压 灭 兰 氏染色 ， 显 微镜 下 观察 细 菌
的形态 。
动 物机 体提 供多 种维 生素 、 消化 酶 等 营养 物质 ， 作 为 益 生菌 开发 的潜 力很 大 。本研 究通 过分 离 培 养及 生
化 试验 确定 白牦 牛肠 道 中存在 有 益 菌—— 枯 草芽 孢 杆菌（ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ ） ， 且通 过 小 鼠安 全 试 验证 明该 菌是 安全 的 ， 以期 为 白牦 牛 益 生菌 制 剂 研 制 奠 定 基
鼠１ ２ ０只 ， 随机 分 为 ６组 、 雌雄 各 半 ， 第 １、 Ⅱ、 Ⅲ组 分别 以 ０ ． １ ｍＬ ／ 只、 ０ ． ２ ５ ｍＬ ／ 只、 ０ ． ５ ｍＬ ／ 只（ 每 毫 升 约含 ２ ０ ０亿 个 细 菌 ） 腹 腔 注射 枯 草 芽 孢 杆 菌 培 养
液； 第Ⅳ、 Ｖ、 Ⅵ组 分 别 以 ０ ． １ ｍＬ ／ 只、 ０ ． ２ ｍＬ ／ 只、
孢 杆菌 能形 成 内生胞 子 ， 有 很强 的抗 逆 性 ， 而且 能 为
的菌落 ， 多次 纯化 培养 后挑 取单 个 菌 落接 种 于 ＭＲＳ 平 板培 养基 及 营 养 肉 汤 培 养 基 中 ， 于 ３ Ｏ℃ 培 养 ２ ４ ｈ Ｅ 。 ］ 。筛选 出可 疑 枯 草 芽孢 杆 菌单 个 纯 菌 落 ， 挑 取
枯草芽孢杆菌的分离试验优质课件
微生物设计性实验 第六组
1实验目的 2实验原理
3.2 溶液或试剂 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 可溶性淀粉 琼 脂 碘 碘原液 碘化钾 可溶性淀粉 磷酸 氢二钠 柠檬酸 氯化钴 重酪酸钾
0.01NHCL
3.3 仪器或设备 平板培养皿 试管 三角瓶 烧杯 称 量纸 高压蒸汽灭菌锅 干燥箱 无 菌吸管 无菌培养皿 酒精灯 接种 钩 滴管
4 初筛 观察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黄色，将这样的菌
种单个菌落分别挑取少许细胞接种到培养基上，置于30度 的培养箱中培养，若发现有杂菌，需要再进行分离纯化。 （若果不能用肉眼更好的观察，可以对其进行革兰氏染色 ，在显微镜下观察，与标准菌种比较）
2 方法步骤
6 纯化并保存
7 结果分析
1 分离到枯草芽孢杆菌菌的株数 2 枯草芽孢杆菌产酶活性大小及形态观 察鉴定结果。
2 涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔、4、5三管土壤稀释液中 各吸取0.2ml，小心的滴在对应的平板培养基表面中央位置 。
用无菌涂布器涂布，均匀分布，在室温下静置5—10分钟，使 菌液浸入培养基。
3培养 将淀粉培养基平板倒置于30摄氏度的培养箱中培养 1-3 d
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PH 6.5，每管分装4—5ml，0.06MPa（8lbf/in2）30min灭菌
•
步骤：
•
将芽孢杆菌测试菌接种于上述培养液中，一般于30摄氏度培
养4天，取培养液（约2ml）和等量的40%NAOH相混合，加少量
肌酸（约0.5—1mg），充分振荡，2—5min后如培养液呈红色，
即为试验阳性。
•
四 淀粉水解
•
发酵过程中采用单因素试验方法,考察
不同培养温度(26、28、30、32、34、
36℃)、培养时间(26、32、38、44、50、
80h)、接种量 (1%、2%、3%、5%、10%)、
初始pH值(5、6、7、8、9)、培养基(Landy
培养基、Landy修饰培养基Ⅰ、 Landy修饰
培养基Ⅱ、LB培养基、无机盐培养基)对脂
肉膏蛋白胨培养基平板上，用涂布棒均匀 涂布，并将培养基倒置于37℃恒温培养1-2 天。
• （4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分 别挑取单菌落中部分菌体，在牛肉膏蛋白 胨培养基上划线纯化。（菌体应呈杆状， 具芽孢，宽度一致；菌落颜色、形状、质 地、透明度等均一致）
生理生化鉴定
• 一 过氧化氢酶测定 将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，
肽类抗生素产量的影响。
• 结果表明,最佳培养条件为Landy培养基, 初始pH7·0,接种量3%,发酵培养温度30℃, 发酵时间38h。
脂肽类抗生素的提取——酸沉淀法
• 培养结束后,7000r/min离心10min,取上 清，加 HCl调节pH为5·0、4·5、4·0、3·5、 3·0、2·5、2·0,7000r/min离心10min,收集 沉淀。将沉淀在60℃ 的烘箱中干燥18h,称 重即为脂肽类抗生素粗提物的干重。比较 不同pH条件下沉淀的干重,以确定完全沉淀 脂肽类抗生素所需的最佳pH值。
板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀 粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。
• 经生理生化鉴定，确定是芽孢杆菌属纯 种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨 斜面上，置37℃培养1-转接至LB平板上,37℃培 养24h,用接种环取活化菌种,接种于 100mlLB液体培养基,30℃、200r/min培养 24h作为种子菌。
脂肽类抗生素的HPLC定量检测
•
将脂肽类抗生素粗提物过Sephadex
LH-20层析柱，每管收集液分别经真空干燥
后,加入0·2ml乙醇溶解。对每管乙醇溶液进
行平板抑菌试验,试验真菌为油菜菌核病菌,
将具有抑菌活性的收集液合并在一起,用离
心浓缩仪浓缩至完全干燥,即为脂肽类抗生
素的干重。
讨论
• 枯草芽孢杆菌脂肽类抗生素在防治植物 病害上具有广阔的应用前景,但由于其产量 不高使其应用受到限制，通过研究枯草芽 孢杆菌的发酵技术和对其进行遗传改造可 以提高脂肽类抗生素产量。
分离步骤
• （1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的 肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带 回实验室分离。
• （2）平板的制备：溶化三角瓶中的牛肉汤 蛋白胨培养基，以每皿20ml左右倒6个平板。
• （3）稀释分离法：称取土壤5g放入含有 45ml水的三角瓶中，摇动片刻，然后将此 瓶用小火加热至悬浊液沸腾，维持15min。 而后静止5min，吸取上层液0.1ml加入到含 有4.5ml无菌水的试管中，制成1:100浓度的 悬液，然后吸取土壤悬浊液0.2ml滴加到牛
•
三、乙酰甲基甲醇实验
•
原理：有些芽孢杆菌发酵葡萄糖产酸，并将产生的酸进一步转化
为中性化合物，如乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性环境中可
被氧气成二乙酰，后者与蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生
成红色化合物，即表示试验阳性。若在培养基中加入少量肌酸以
补充胍基，可加速反应。
•
培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml。调节
• 枯草芽孢杆菌在自然生长和发酵培养 产生的脂肽类抗生素具有很强的抗真菌、 病毒、肿瘤、支原体活性，在防治植物病 害上具有广阔的应用前景。
分离原理
• 芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不 会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细 菌会失去活性，因而得到芽孢菌属，经过 进一步的分离及生理生化鉴定得到枯草芽 孢杆菌。
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• 原理：许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀 粉水解，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。
• 培养基：在肉汤琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装 于三角瓶。0.1MPa(15lbf/in2)20min灭菌备用。
• 步骤：
将培养基做成平板，凝固后取菌种点种于平板上
（每皿点种2点），一般于30摄氏度培养2—4天，形 成菌落后，在平板上滴加碘液，以铺满菌落为度，平
枯草芽孢杆菌的分离纯化
目录
• 菌种简介 • 分离步骤 • 生理生化鉴定 • 发酵条件的优化 • 脂肽类抗生素的提取——酸沉淀法 • 脂肽类抗生素的HPLC定量检测 • 讨论
菌种简介
• 无荚膜，周生鞭毛，革兰氏阳性菌，有 芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微 黄色，需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及 淀粉，分解色氨酸形成吲哚。广泛分布在 土壤及腐败的有机物中。
培养1—2天。取一载玻片，在上面加一滴 3—10%的过氧化氢，挑取一环菌苔，在过 氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出 现为阳性，无气泡者为阴性。
• 二 需氧性试验
• 原理：不同种类的芽孢杆菌对氧气的需求 性常有差异，因此本实验可作为鉴定芽孢 杆菌的一个较重要指标。
• 操作步骤：菌液穿刺接种到上述培养基中， 一般于培养3—7天观察结果。若芽孢杆菌 在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿着穿刺线 上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌