糖尿病大鼠尿nephrin 的检测及意义(一)

糖尿病大鼠尿nephrin 的检测及意义(一)

【摘要】目的：建立糖尿病大鼠模型，探讨糖尿病大鼠尿中nephrin的检测、动态变化及意义。方法：SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素制成糖尿病模型，正常对照组注射等量枸橼酸缓冲液，动态检测各组大鼠24h尿微量白蛋白及肾功能，以Western-Blot方法动态检测尿中nephrin。结果：正常大鼠尿中无nephrin排泄，而糖尿病大鼠尿中可检测出nephrin，诱模早期（2周）即可出现，随着病程的延长，nephrin逐渐增多，8周达高峰后，nephrin的排泄又逐渐减少。结论：糖尿病肾病早期nephrin即可从尿中排泄，尿nephrin可作为糖尿病肾病的早期诊断指标之一，还将有助于监测、判断糖尿病肾病的病程进展。

【关键词】糖尿病肾病；大鼠；微量白蛋白;尿nephrin

〔Abstract〕Objective:Diabeticratswereinducedtoexplorethedetectionofurinarynephrinindiabeticrats,itsdyna micchangesandclinicalsignificance.Methods：SDratsweredividedinto2groups.Diabeticratsmodelwereinducedbysingleintraperitonealinjectionof streptozocin(STZ),whilethoseofnormalcontrolgroupwereinjectedwithequaldosageofcitricacidbuffe rsolution.Twentyfourhoursurinarymicroalbuminandrenalfunctionwereambulatorilymonitored,and UrinaryNephrinwasmeasuredwithWestern-Blot.Results：Thetestshowedthatnourinarynephrinwerefoundinnormalcontrolgroup,butitwasdectetedoutindia beticratsgroup,anddiscoveredattheearlystage(2weeksafterSTZinjection).Withtheextensionofcours e,urinarynephringraduallyincreased,andthengraduallydecreasedafterreachingitspeakbyweek8.Co nclusion：Thenephrincouldbeexcretedoutfromurineattheearlystageofdiabeticnephropathy.Urinarynephrinc ouldnotonlyberegardedasaspecificindexfortheearlydiagnosisofdiabeticnephropathy,butalsobeben ificialtoclinicalmonitoringandevaluatingthedegreesoftheDN.

〔Keywords〕diabeticnephropathy;rats;microalbumin;urinarynephrin

糖尿病肾病(diabetesnephropathy，DN)是糖尿病微血管病变之一，是终末期肾衰的重要原因，早期诊断和治疗可延缓其发展。DN起病隐匿，早期诊断困难，目前公认的诊断早期DN的指标是尿微量白蛋白，但也仅使DN诊断提早到依据Mogensen建议的Ⅲ期。部分糖尿病患者当发现微量白蛋白尿时，肾脏的结构损害已很明显〔1〕。因此不能单以尿微量白蛋白的出现来判断早期DN。

蛋白尿的发生与肾小球滤过屏障密切相关，nephrin是新近发现由足细胞表达、特异定位于肾小球足细胞裂孔隔膜的蛋白分子，参与肾小球滤过屏障的形成并维持其正常功能〔2〕。研究表明，实验性糖尿病模型及人类蛋白尿相关的肾小球疾病均有nephrin表达的改变，且nephrin可从尿中排泄〔3〕。而尿中nephrin排泄量增加是否可敏感反映糖尿病早期肾脏损害，目前国内尚未有报道。本文对糖尿病大鼠尿蛋白排泄率(AER)及尿液nephrin进行动态观察，旨在探讨尿nephrin在DN中的变化规律及其对早期DN的诊断意义。

1对象与方法

1.1实验动物及分组

雄性SD大鼠76只，体质量230～280g，购自江苏大学医学院实验动物中心，血糖正常。试验期间，室温控制在18～20℃，湿度48%，12小时交替照明，大鼠自由饮水进食，保持垫料干燥。实验共分对照组（n=36），糖尿病组（n=40）。对照组0周处死6只，再与糖尿病组随机分为2，4，6，8和12周5个亚组，分别于DM诱模后2，4，6，8和12周处死。

1.2糖尿病模型的建立

所有大鼠适应性喂养1周，随机取40只，禁食12h后，空腹状态下，链脲佐菌素（STZ）按55mg/kg一次性腹腔注射制备糖尿病模型，STZ临用前用枸橼酸钠缓冲液(0.1mmol/L,pH4.2)

配制。24h后大鼠血糖开始升高，72h后剪尾采血测血糖，持续高于16.7mmol/L为DM模型建立成功〔4,5〕。DM模型建成后，每周测血糖一次，不符合标准者弃去。共有36只造模成功，其中有3只死亡。正常对照组仅注射等量枸橼酸钠缓冲液(0.1mmol/L)。全部大鼠自由饮食。

1.3标本留取

实验初，处死6只大鼠作为正常对照，并分别于注射STZ后2，4，6，8，12周末，对照组、糖尿病组随机取大鼠各6只，分别放入代谢笼中收集24h尿液，计尿液总量后离心(2000r/min,10min)，取上清液10ml，-20℃冰箱保存待测。予0.3%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔麻醉下，剪尾采血测血糖，腹部正中切口，心脏采血5ml，分离血清，用于生化指标测定。

1.4指标观察和测定方法

1.4.1生化指标检测采用免疫比浊法测定24h尿微量白蛋白；采用全自动生化分析仪检测血尿素氮（BUN）、血肌酐、尿肌酐，按公式Ccr=〔尿肌酐浓度（μmol/L）×每分钟尿量（ml/min）〕/〔血浆肌酐浓度（μmol/L）·体质量（kg）〕计算血清肌酐清除率。

1.4.2蛋白质印迹杂交取大鼠24h尿液离心后的上清液。每1ml尿液样品置透析袋中用聚乙二醇8000高渗浓缩至100μl标本。组内大鼠各取等体积离心浓缩尿液混合，将各组大鼠等体积尿混合液经12%SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维膜上，用封闭蛋白干粉封闭后，分别加入一抗（兔抗鼠nephrin，1∶200稀释，购自Sigma公司）过夜，然后加相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG（武汉博士德公司）进行孵育，显色后，用凝胶成像及分析系统分析蛋白显色的光密度值（D）。

1.5统计学处理

计量资料以x±s表示,采用SPSS10.0统计软件进行分析,组间资料两两比较采用t检验。