酵母发酵力测定试验步骤

酵母发酵力的测定
一、目的
通过测定酵母发酵力，筛选发酵力强的酵母。

二、实验原理
酵母在微酸性糖液中起发酵作用，其中的糖逐渐减少，乙醇及CO
2
则依比例
而增大，CO
2
是气体，除溶解于醪中者外，都跑向外面，所以测定酵母的发酵力，或测糖液比重的减小，或测糖的减少，或乙醇的增加，或称培器为减轻量，以
CO
2的失去多少，或用NaOH等固定CO
2
然后称其量，或将培养器密闭，由其中压
力的增大，而定发酵的强弱等。

本实验采用乙醇浓度增大、CO
2
含量、糖的减少、培养器的减轻四个方面测定其发酵力强弱。

三、实验材料
1．菌种：本公司实验室分离所得。

2．试剂：葡萄糖、果糖、蔗糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、蛋白胨、酵母浸膏、菲林试剂、碳酸氢钠。

3．器具：大三角瓶、小三角瓶、胶塞、玻璃管、1ml移液管、10ml移液管、天平、酒精计、温度计、蒸馏器、培养箱。

4．培养基
四、方法步骤
1．从斜面菌种接种到小三角瓶（100ml培养基）28℃培养24h；
2．摇匀小三角瓶菌种，吸取10ml接种到大三角（1000ml），装好CO
2
收集装置，称重，记录其重量，置28℃培养，每天称重一次，直到重量减少量小于0.5g；
3．发酵结束后，通过测量排水量测定CO
2
含量；
4．取一定量的发酵醪液，测定其残糖量，以测定其发酵力；
5．取100ml发酵醪液，加100ml水蒸馏出100ml溶液，用酒精计测定其乙醇含量。

（注：如果用酒精计不能测出，则改用重铬酸比色法或气相色谱法）
重铬酸比色法所需试剂如下：
（1）0.1％（v/v）标准乙醇溶液；（2）2％重铬酸钾溶液；（3）浓硫酸；铬酸比色法
酒精糟中微量乙醇的测定
酒精糟中乙醇的含量是蒸馏时的一个重要指标。

但酒精糟中乙醇含量甚微，不宜采用酒精计测量，需用比色法测定，比色法测定乙醇其浓度下限可达
0.02％。

1、原理
酒精糟中残余乙醇的测定采用蒸馏法，蒸出的乙醇用重铬酸钾氧化为乙酸，而六价铬被还原为三价铬，以比色法测定。

3CH3CH2OH+2K2CrO7+8H2SO4=3CH3COOH+2Cr2(SO4)3+2K2SO4+1 1H2O
2、试剂
（1）0.1％（v/v）标准乙醇溶液
（2）2％重铬酸钾溶液
（3）浓硫酸
3、测定步骤
（1）标准系列管的制备
在10毫升比色管中，按下列加入各溶液
各管中加1毫升重铬酸钾溶液，5毫升浓硫酸，摇匀。

于沸水浴中加热10分钟，取出冷却。

（2）试样管的制备
称取100克酒精，放入500毫升圆底烧瓶中，加200毫升水，蒸馏，用100毫升容量瓶正确接收馏出液100毫升，摇匀。

取5毫升馏出液，放入10毫升比色管中，加1毫升2％重铬酸钾溶液，5毫升浓硫酸，摇匀，与标准系列管一起于沸水浴中加热10分钟，取出冷却。

（3）目视比色
将试样管与标准系列管比较色泽，求得酒精糟中乙醇含量：
乙醇（毫升/100克）＝V×0.001×100/5
式中V－试样管与标准系列管色泽相当的标准管中标准乙醇溶液的体积（毫升）
0.001－标准乙醇溶液的体积（毫升/毫升）
5－所取馏出液的体积（毫升）
100－馏出液的总体积（毫升）
（4）分光光度计法
在600纳米波长下测光密度，绘制标准曲线，从标准曲线上求得试样管光密度所对应的0.1％的标准乙醇溶液的体积(V)，按目视比色法测定。

酵母菌常用培养基
（1）菌体生产培养基：葡萄糖150g，硫酸镁0.1g，酵母膏15g，硫酸铵5g，磷酸二氢钾8g，硫酸亚铁0.1g，加水至1000ml，pH4.1~4.5；
（2）菌体补料培养基：葡萄糖500g，硫酸镁10g，酵母膏15g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾15g，硫酸亚铁0.2g，加水至1000ml，pH4.1~4.5；
（3）发酵培养基：葡萄糖600g，硫酸镁4g，酵母膏6g，硫酸铵6g，磷酸二氢钾2g，加水至1000ml，pH4.1~4.5；
（4）YEPD培养基(用于酵母原生质体融合)：酵母浸膏10g, 蛋白胨20g,葡萄糖20g,蒸馏水1000mL, pH6.0,115℃湿热灭菌20min。

（5）芽汁琼脂培麦养基
成分：优质大麦或小麦，蒸馏水，碘液。

制法：取优质大麦或小麦若干，浸泡6~12h，置于深约2cm的木盘上摊平，上盖纱布，每日早、中、晚各淋水一次，麦根伸长至麦粒两倍时，停止发芽晾干或烘干。

称取300g麦芽磨碎，加1000mL水，38℃保温2h，再升温至45℃，30min，再提高到50℃，30min，再升至60℃，糖化1~1.5h。

取糖化液少许，加碘液1~2滴，如不为蓝色，说明糖化完毕，用文火煮半小时，四层纱布过滤。

如滤液不清，可用一个鸡蛋清加水约20mL调匀，打至起沫，
倒入糖化液中搅拌煮沸再过滤，即可得澄清麦芽汁。

用波美计检测糖化液浓度，加水稀释至10倍，调pH5~6，用于酵母菌培养；稀释至5~6倍，调pH7.2，可用于培养细菌，121℃灭菌20min。

（6）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）
成分：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖（或蔗糖）20g，琼脂20g，水1000mL。

制法：pH值自然。

将马铃薯去皮、洗净、切成小块，称取200g加入1000mL 蒸馏水，煮沸20min，用纱布过滤，滤液补足水至1000mL，再加入糖和琼脂，溶化后分装，121℃灭菌20min。

另外，用少量乙醇溶解0.1g氯霉素，加入1000mL 培养基中，分装灭菌后可用于食品中霉菌和酵母菌计数、分离。

（7）米曲汁培养基
制法：取150g大米于1000ml三角瓶中，用水洗三次，沥干，加入水150g，常压蒸熟，待米饭冷却到28~35℃时，接种适量（参考用量：一支斜面）糖化力强的根霉种，培养46~48h，接水（水温70℃以上）300ml，静置4h以上，用纱布过滤，即制成米曲汁。

根据培养条件，调节pH值及其他元素，即可。

一般用于培养酵母和霉菌。

（例如：培养霉菌及酵母，pH值一般调至4.5~5.0，同时需加入0.1%磷酸二氢钾及0.05%的硫酸镁）
还原糖的测定：菲林试剂法
1.原理：菲林试剂由甲液、乙液组成，甲液为硫酸铜溶液，乙液为酒石酸钾钠和氢氧化钠溶液。

两液分别贮存，使用时等体积混合。

甲液、乙液一经混合，先生成氢氧化铜沉淀，进一步与酒石酸钾钠反应，是沉淀溶解生成酒石酸钾钠铜络合物，络合物中的二价铜是氧化剂，使还原糖中的的羰基氧化，自身则还原生成氧化铜沉淀，反应终点用亚甲基蓝指示剂显示。

亚甲基蓝也是氧化剂，但其氧化能力比二价铜弱，待二价铜反应完毕，过量1滴还原糖，立即使亚甲基蓝还原，蓝色消失为终点。

2.试剂配制：
（1）菲林试剂的配制：
甲液：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）69.3g溶于水并稀释至1L。

乙液：称取酒石酸钾钠（C4O6H2KNa·4H2O）346g，氢氧化钠（NaOH）100g，溶于水并稀释至1L。

（2）2g/L葡萄糖标准溶液：准确称取于100~105℃烘2h并在干燥器中冷却的无水葡萄糖2g（准确到0.0002g），溶于水，加5ml浓盐酸（抑制细菌生长，可不
加），用水定容至1L。

（一般贮存在冰箱内，不能存放太久，存放一周后需重配）（3）10g/L亚甲基蓝指示剂：1g亚甲基蓝于100ml水中温热溶解。

3.测定步骤（注意：菲林试剂必须现配现用！）
（1）菲林试剂标定：准确吸取菲林甲液、乙液各5ml于250ml三角瓶中，加水约20ml，加入2滴亚甲基蓝指示剂，用滴定管加入约24ml 2g/L葡萄糖标准溶液，摇匀，微沸2min后，继续用2g/L葡萄糖标准溶液滴定到蓝色消失为终点。

最后的滴定操作应控制在1min完成。

消耗糖液总量为V（ml）。

即可求出10ml 菲林试剂相当于标准葡萄糖的克数（F）。

F=V×C
（2）糖液滴定：
a，预滴定：准确吸取菲林甲液、乙液各5ml于250ml三角瓶中，加水20ml，亚甲基蓝指示剂2滴，在沸腾状态下用试样滴定到终点，记录消耗体积V′（ml）。

b，正式滴定：准确吸取菲林甲液、乙液各5ml于250ml三角瓶中，加水20ml，亚甲基蓝指示剂2滴，加入比预滴定少1ml试样，煮沸2min，继续用试样滴定到蓝色消失，消耗试样总体积V（ml）。