实验设计-小鼠背部皮肤中毛囊干细胞的鉴定

小鼠背部皮肤中毛囊干细胞的鉴定

一、研究背景

毛囊干细胞定植在毛囊隆突部位，具有其它成体干细胞的共性, 即慢周期性、未分化性、多向分化潜能、潜在的高增殖能力和保持细胞静止的能力等特点。谱系分析技术已经证实几乎所有的内皮细胞层内成体毛囊和毛发均起源于隆突部位的细胞。因此，毛囊干细胞可能在毛囊的每一个增殖循环中均发挥重要作用。CD34, K15, K19和Nestin 可能作为毛囊干细胞的表面标记。在毛囊干细胞信号调控中涉及到许多的调控信号, 主要包括WNT信号、BMP信号和NFAT c1等基因的作用。WNT信号通路在调节毛囊干细胞增殖和命运决定中起重要作用, 它在毛囊循环的过程中呈一种动态变化, 在生长期活性最高。B-CATENIN是WNT 信号所激活的一种重要的转录因子。骨形成蛋白信号( BMP ) 也在毛囊形态发生、出生后的重建和通过调节毛发基质前体细胞的分化和增殖来控制毛囊循环中起到重要作用。通过异位表达BMP4或特定的缺失BMP拮抗者noggin而增强的BMP信号将导致毛囊生长延迟和越来越严重的光秃。。在毛发生长期早期, WNT 信号的表达使毛囊干细胞发生增殖和分化, 从而引起表皮相关成分的形成; 但是此阶段过后, BMP 信号中的转录因子表达量升高, 抑制正在进行增殖分化的干细胞, 从而维持干细胞巢中的干细胞数量。毛囊干细胞在体外能够分化成为神经元、胶质细胞、角质化细胞、平滑肌细胞和黑色素细胞。体内实验研究表明巢蛋白和绿色荧光蛋白标记的毛囊干细胞移植到裸鼠皮下能够分化成为血管和神经组织。毛囊干细胞植入到坐骨神经或胫神经离断处的缝隙中，能够促进离断神经的再生并促进受损神经的功能恢复。毛囊干细胞能够转分化为大量的雪旺氏细胞来促进神经元的再生，有助于恢复正常的行走能力。因此，毛囊干细胞移植技术提供了一个有效的、方便的自体来源的干细胞来治疗周围神经损伤。因此，毛囊干细胞在再生医学中可以替代胚胎干细胞治疗各种疾病，而且毛囊干细胞移植较胚胎干细胞移植没有伦理学问题。更为重要的是，与其他来源的干细胞相比，毛囊干细胞更加容易从患者自身获取，在体外经培养扩增后可以直接应用于患者。Jahoda 研究小组证实了毛囊干细胞可以分化为小鼠血液细胞，能够分化成为脂肪细胞和成骨细胞，并且参与组织损伤的修复。毛囊干细胞在毛发再生领域也有极大的应用价值。目前，多数实验以鼠的触须毛囊、外科获取的人头皮样本为毛囊干细胞的组织来源。

二、研究目的和意义

本实验目的：小鼠背部皮肤中毛囊干细胞的鉴定。

本实验意义：对小鼠背部皮肤中毛囊干细胞的鉴定，为毛囊干细胞的机制与应用等的研究提供种子细胞。

三、实验材料与方法

1.小鼠背部皮肤中毛囊干细胞的 RT-PCR 鉴定

1）主要的仪器设备及试剂如RT-PCR 仪、高速低温离心机、TRIZOL 总 RNA 提取试剂、RT-PCR 试剂盒、Marker DL2000等。

2）合成实验中所涉及的引物序列。

3）人毛囊组织的总 RNA 提取（Trizol 法），用紫外分光光度计测定RNA纯度及含量。

4）反转录合成 cDNA（RT 逆转录反应）。

5）PCR 扩增。

6）1%琼脂糖凝胶电泳 PCR 反应结束后，取 PCR 产物 10μl，经 1%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察。

7）凝胶分析系统分析。

8）利用图像分析软件，采集 RT-PCR 凝胶图像。

2. 取小鼠背部皮肤标本1.0×1.0cm，消毒好的皮肤标本用眼科剪剪成小条，经中性蛋白酶处理，分离去除表皮，从真皮中拔取并收集生长期的毛囊组织，制成石蜡切片。

3.毛囊干细胞的免疫组织化学鉴定

1）烤片：58℃ 2-６h；

2）脱腊和水化：二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡15min脱蜡→100﹪酒精Ⅰ、Ⅱ中分别浸泡5min→95﹪、90﹪、80﹪、70﹪酒精各浸泡2min→PBS洗3次×3min。

3）蒸汽修复抗原:内盛自来水的铝制容器加热至水沸腾,放入含pH 6.0的0.1mol ／L柠檬酸缓冲液和切片的容器.继续沸腾10-15min,室温冷却.

4）细胞膜打孔 0.1﹪-0.3％tritonX-100浸泡，RT，25min，PBS冲洗3次×5min。5）灭活内源性过氧化物酶：3﹪甲醇-H2O2浸泡，RT，30min，PBS冲洗3次×5min；6）非免疫血清封闭：-5﹪BSA（牛血清白蛋白），RT，10min，不洗；

7）加入兔抗鼠 CD34 单克隆抗体（1:100 稀释,CST公司），4℃过夜。 PBS 冲洗，3×5min。

8）加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔第二抗体(1:100 稀释，CST公司),37℃室温孵育 30min。PBS 冲洗，3×5min。

9）新鲜配制的 DAB 显色液显色 5-10min，（显微镜下观察监控）。自来水冲洗。

10) 苏木精染液复染细胞核3-5min，自来水冲洗。

11）1%盐酸酒精分化，自来水冲洗。

12) 梯度酒精脱水。

80%酒精 5min，95%酒精ⅠⅡ各 5min，100%酒精ⅠⅡ各 5min。 18）二甲苯透明，二甲苯ⅠⅡ各 5min。

13）中性树胶封片。镜下检查结果。

四、实验结果

1.RT-PCR 预期结果:小鼠背部皮肤中获得的毛囊组织，RT-PCR 凝胶图像根据产物长度不同，可得结果整合素（α6、β1、β4）、CK15、CK19、CD34、CD200 为毛囊干细胞的阳性标志物。CK1、CK6、CK9、CK10 为毛囊干细胞的阴性标志物。

2.小鼠背部皮肤毛囊干细胞的免疫组织化学鉴定预期结果：在小鼠毛囊的隆突部位表达CD34阳性细胞的的角化细胞中有棕黄色（DAB 显色）颗粒。

五、结果分析

1.RT-PCR 结果分析：小鼠背部皮肤中获得的毛囊组织中整合素（α6、β1、β4）、CK15、CK19、CD34、CD200 为毛囊干细胞的阳性标志物，CK1、CK6、CK9、CK10 为毛囊干细胞的阴性标志物。

2.免疫组织化学鉴定预期结果分析：CD34是毛囊干细胞的阳性标志物之一，在毛囊干细胞的鉴定中比较有意义。对小鼠背部皮肤中毛囊干细胞进行CD34免疫组织化学鉴定，可以初步判定获得的组织中是否含有毛囊干细胞。若在小鼠毛囊的隆突部位表达CD34阳性细胞的的角化细胞中发现棕黄色（DAB 显色）颗粒则可初步判定小鼠背部皮肤中存在毛囊干细胞。

六、经费预算：约4000元人民币。