现代生化药学

. 现代生化药学复习提要2009年12月使用

第一章PCR

1 PCR的英文全称是什么? Polymerase Chain Reaction

2 PCR是谁发明的？Kary Mullis

3 PCR的基本原理是什么？

PCR的基本工作原理，是以拟扩增的DNA片段为模板，以一对分别与模板DNA 互补的寡核苷酸为引物，在DNA聚合酶的作用下，根据半保留复制的机制沿着模板DNA链延伸，直至新的DNA合成。不断重复这一过程，则可使目的DNA 片段得到扩增。

4 PCR反应的产物中一般会生成几种长度不同的产物？反应结束时他们的含量分别是怎样的？

PCR反应中一般会产生2种不同长度的产物：一种是预期长度的产物，一种是比预期长度长得多的产物；前者以指数级数增加（2n），后者以几何级数增加（2n）。因此后者在总产物中所占比重很小，可忽略不计。

5 一般PCR反应中包括几种基本成份？它们的功能分别是什么？

模板：待扩增的DNA或RNA；

引物：与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。只有每条引物都与靶DNA特异性结合，才能保证其特异性，引物越长，特异性越高。两段引物间的距离决定了扩增片断的长度；两引物的5’端决定了扩增产物的5’端位置。说明引物决定了扩增片断的长度、位置和结果。

6 PCR反应对模板有什么要求（种类及质量要求等）？

基因组DNA、噬菌体DNA、质粒DNA、cDNA、mRNA、预先扩增的DNA均可作为模板。PCR反应对模板质量要求不是很高，经过标准分子生物学方法制备的DNA可以作为模板，但是模板中绝对不能含有蛋白酶、核酸酶、Taq酶抑制剂和任何可以结合DNA的蛋白质；虽然片段长短不是影响PCR效率的关键因素，短片段模板PCR效率更高；为保证反应的特异性，应使用ng级的克隆DNA、μg级的单拷贝染色体DNA、或104拷贝的待扩增片段。

7 什么叫PCR的引物？什么叫特异性引物？什么叫简并性引物？

引物是与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。只有每条引物都与靶DNA特异性结合，才能保证其特异性，引物越长，特异性越高。

8 引物设计的基本原则有哪些？

a.引物长度一般在20～24bp：这样长度的引物保证了不易形成杂合体；

b.（G+C）%：两段引物的此数值应相近；在已知模板序列的时候应与模板的

相近。

c.引物本身不能形成明显的次级结构，如发卡结构；

d.两引物不可配对；

e.引物3’端为DNA聚合酶连上寡核苷酸的地方，因此应严格、准确地配对。

9 PCR中使用的DNA聚合酶有哪几种，各具有哪些特点？

a.Klenow片段：为DNA聚合酶Ⅰ的片段，具有聚合酶活性和3’~5’外切酶活性；

b.Taq酶：耐热DNA聚合酶，可耐受93～95摄氏度，是PCR普及的关键。它

避免了不断补加DNA聚合酶的繁琐操作，提高了退火和延伸的温度，减少了非特异性产物和DNA二级结构的影响，提高了PCR的特异性、敏感度和产量。它没有3’~5’外切酶活性，无校对功能。

c.Stoffel片段：第二代耐热DNA聚合酶，将97.5摄氏度的半衰期提高到20min，

而Taq酶只有5min；对复合PCR（2个或以上模板位点的PCR）更有效；

d.Vent酶：耐受100摄氏度以上高温达2h；具有校对功能。

e.RTth 逆转录酶：有依赖于RNA的耐热DNA聚合酶活性和依赖于DNA的耐

热DNA聚合酶活性，这两种活性分别依赖于Mn2+和Mg2+。

10 PCR反应中对于加入的dNTP有什么要求？

dNTP应具有一定浓度：浓度过高会抑制Taq酶活性，较低浓度可降低错误掺入，浓度过高会导致错误掺入，浓度过低会导致产量过低；

4种dNTP应有一样的浓度，否则会诱导聚合酶错误掺入而降低产率、提前终止反应；

不能反复冻融，否则会降解。

11 PCR反应中加入的二价阳离子有什么功能？常用的是什么离子？

缓冲液中二价阳离子的存在至关重要，因为耐热DNA聚合酶需要游离的二价阳离子作为辅助离子，它影响着PCR的产量和特异性。常用Mn2+和Mg2+。

12 PCR反应一般分为几个步骤？各步骤有什么特点？

A变性：双链DNA变成单链DNA。变性温度的高低由G、C含量决定；变性时间由DNA链长度决定。常规PCR变性条件为94～95度45s。

B 退火：指单链DNA与引物特异性结合。退火温度太高则效率低，退火温度太低则出现非特异性复性。

C 延伸：寡核苷酸的延长，一般在耐热DNA聚合酶的最适温度下进行。对于Taq 酶，为72～78度。

13 什么叫PCR的反应平台？形成的原因可能是什么？

PCR反应不是无穷的进行，到了PCR后期，当产物达0.3～1pmol/L时，产物不是呈指数增长而是进入平台期，曲线由指数曲线变为平坦。

形成原因：由于引物和dNTP的减少，Taq酶失活；或由于底物过剩、非特异性

产物的竞争、变性时解链不完全、退货时产物单链自行缔合、最终产物的阻化作用。

14 提高PCR反应的特异性一般可以使用哪几种方法？

a.引物设计：引物长度，G+C含量，退火温度，引物浓度与纯度，稳定性；

b.使用热启动：在变性完成之后再加入DNA聚合酶，这样可以提高特异性，

因为DNA聚合酶在低温时也有活性。

c.镁离子浓度：不同的模板和引物有不同的镁离子浓度，应进行预实验进行探

索；较高的镁离子浓度会提高产量，同时降低特异性；dNTP浓度较高时应适当提高镁离子浓度。

d.促进PCR的添加剂：影响DNA溶解温度的添加剂可提高特异性和产率；

e.使用巢式PCR：降低扩增多个靶位点的可能性，提高特异性

15 常用的促进PCR特异性的试剂有哪些？

甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱，PCRx Enhancer Solution。

16 什么是热启动？

在模板DNA完全变性后再加入DNA聚合酶（或使DNA聚合酶有活性）的方法，可减少低温下DNA聚合酶活性造成的非特异性扩增。

17 RACE的全称是什么？Rapid Amplification of cDNA Ending（cDNA末端的快速扩增）

18 什么叫定量PCR？

利用PCR反应来测定样品中的DNA或RNA的原始拷贝数量。利用每一个循环都能测得PCR产物的增生来获得反应饱和前的资料。

19 为什么PCR中对产物进行终点检定量不准确？

随着PCR的进行，反应体系中的引物、dNTP，甚至模板都会供不应求，导致PCR 的效率下降，产物产生的越来越慢。直到Taq酶都被饱和后，反应就进入平台期。在实际实验中，由于各种条件的相互影响，每个反应进入平台期的时间不同，导致终产物浓度各不相同。即使是重复实验，也不可能做到同时进入平台期。因此反应终产物与原始拷贝数无线性关系，定量不准确。

20 什么是定量PCR的Ct值？Ct值是如何确定的?

Cycle threshold（Ct）：每个反应管内的荧光达到阈值时的循环数，即在PCR中，荧光信号开始由本底进入指数增长的拐点处所对应的循环数。

21 简述Taqman探针技术的原理。

[TaqMan技术]原理：除了一对特异性引物，TaqMan探针法增加一条和模版互补的基因特异性探针（通常20—30bp），探针上5'端和3'端分别标记了一个报告荧光基团（供体）和一个淬灭荧光基团（受体），在反应初始（探针完整）时系统激发供体而产生的荧光信号被临近的淬灭基团吸收，所以此时检测不到供体荧光信号；而当PCR过程中Taq DNA聚合酶扩增到探针结合模版的位点时，其5'-3'核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探针5'端的报告基团——游离的报告基团远离淬灭基团，打破能量的传递，激发报告基团产生的荧光信