核酸提取

核酸提取（样本处理）

血液：

使用QIAamp® DNA Mini Kit（组织）进行核酸提取，提取步骤如下。

开始前需要注意：

1、所有的离心步骤都在室温下进行（15-25℃）

2、200ul的全血会产生3-12ugDNA，如果需要更多的DNA产量需要准备血沉棕黄层。

(血沉棕黄层是全血中富含白细胞的部分，从全血中准备血沉棕黄层很容易，并且会比等体积的全血中DNA的产量高5到10倍；制备血沉棕黄层通过在室温中（15-25℃）将全血在2500×g离心10min，离心后会出现3个分层：最上层清晰的是血浆，中间的分层是血沉棕黄层，最底下的分层包含浓缩的红细胞)

实验开始前准备工作：

1、确保室温在15-25℃。

2、将恒温金属浴调到56℃，以备步骤4使用。

3、将Buffer AE或蒸馏水置于室温以备步骤11的洗脱。

4、确保Buffer AW1、Buffer AW2、蛋白酶K处理完毕。

（确保Buffers AW1和Buffers AW2已经按照瓶体的指示加上适量的96-100%的乙醇；当使用QIAamp® DNA Blood Mini Kit(50)，参照标签说明，将 1.2ml蛋白酶溶剂吸取到冻干的蛋白酶中溶解。当使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(250)，参照标签说明，将5.5ml蛋白酶

溶剂吸取到冻干的蛋白酶中溶解；溶解的冻干蛋白酶在2-8℃能存放12个月）

5、如果在加入Buffer AL后产生沉淀，那么56℃水浴溶解。

实验步骤：

1、吸取20ul的凯杰蛋白酶（或蛋白酶K）到1.5ml离心管中。

2、在离心管中加入200ul样本，可以是全血、血清、血浆、血沉棕黄层。

(如果样本体积少于200ul，加PBS到200ul；如果需要无RNA的基因组DNA，那么在加入Buffer AL之前要加入4ul的RNase A)

3、样本中加入200ul的Buffer AL，脉冲涡流混合15s。

（为了确保高效的溶解，必须将样本与Buffer AL充分混匀才能获得均一的溶液；如果样本体积多于200ul，成比例地增加蛋白酶K （或凯杰蛋白酶）、Buffer AL的量，例如，400ul的样本体积需加40ul蛋白酶K（或凯杰蛋白酶）、40ul的Buffer AL，如果样本体积大于400ul，那么推荐使用QIAamp DNA Blood Midi or Maxi Kits，这个试剂盒能处理到2ml或到10ml样本。注意：不要将凯杰蛋白酶或蛋白酶K直接加到Buffer AL中）

4、56℃孵育10min。

（在56℃溶解10min后DNA的产量会达到最大化，更长的孵育时间不会影响DNA的产量和质量）

5、将1.5ml离心管短暂离心，确保将管盖和管壁的溶液离心到管底。

6、加入200ul的96-100%乙醇，脉冲涡流混匀15s，短暂离心。

7、将步骤6的混合溶液加入离心柱中（离心柱放到2ml收集管中），关闭管盖，8000rpm离心1min。弃掉带有滤液的收集管，将离心柱重置于干净的收集管中。

8、打开离心柱的管盖，加入500ul Buffer AW1，关闭管盖8000rpm 离心1min。弃掉带有滤液的收集管，将离心柱重置于干净的收集管中。

9、打开离心柱的管盖，加入500ul Buffer AW2，关闭管盖140000rpm 全速离心3min。

10、推荐步骤：弃掉带有滤液的收集管，将离心柱重置于干净的收集管中，全速离心1min。（注意：这一步是为了避免Buffer AW2的遗留）

11、弃掉带有滤液的收集管，将离心柱放置于一个新的1.5ml离心管中。小心打开离心柱的盖子，加入200ul Buffer AE或者蒸馏水。室温孵育1min后8000rpm离心1min。

组织

使用QIAamp® DNA Blood Mini Kit进行核酸提取，提取步骤如下。

由用户提供的试剂和设备：

1、PBS

2、96-100%乙醇

3、1.5ml离心管

4、两台恒温金属浴

5、组织破碎仪或研钵

6、微型离心机（搭配2ml离心管的转子）

7、漩涡振荡仪

8、实验服、一次性手套、防护眼镜

实验开始前准备工作

1、确保室温在15-25℃。

2、两个恒温金属浴：56℃在实验的第三步，70℃在实验的第5步。

3、将Buffers AE或者蒸馏水置于室温，在接下来的第11步的DNA 洗脱备用。

4、确保Buffers AW1和Buffers AW2已经按照瓶体的指示加上适量的96-100%的乙醇。

5、如果Buffer ATL或者Buffer AL存在沉淀物，在56℃恒温金属浴中孵育溶解。

实验步骤：

1、获取样本组织不超过25mg。（DNA 的提取量取决于组织的类型和质量，1mg组织大约会提取到0.2-1.2ug的DNA）

2、3种处理方法：

2a、将25mg的组织处理成小块，置于1.5ml离心管中加入180ul的Buffer ATL。（将25mg的组织剪成小块会降低溶解时间）

2b、将25mg组织置于液氮中用研钵充分研，将研磨完成的组织粉末倒入1.5ml离心管中，可以使剩余液氮蒸发掉，但是要防止组织变暖。加入180ul Buffer ATL。

2c、加25mg组织到1.5ml离心管中，并加入不超过80ul的PBS.用均质器将组织均匀化，加入100ul Buffer ATL

3、加入20ul蛋白酶K，漩涡混匀，56℃孵育，直到组织完全溶解。孵育过程中经常用漩涡振荡器将样本分散，或者将样本置于振动型恒温水浴。（注意：蛋白酶K是必须使用的；组织溶解的时间取决于处理样本的类型，通常在1-3h能完全溶解。为了确保高效的溶解，需要配合振动型恒温水浴或者振荡器，如果没有在孵育的每1个小时漩涡震动2-3min）

4、将1.5ml离心管短暂离心，为了将离心管盖子和内壁的物质离心到底部。

5、如果想获取无RNA的基因组DNA，接下来进行步骤5a，否则进行步骤5b。

5a、首先加入4ul RNase A（100mg/ml）,脉冲涡流混匀15s，室温（15-25℃）孵育2min。在加200ul Buffer AL前将1.5ml离心管短暂离心，脉冲涡流混匀15s后70℃孵育10min。短暂离心。

（注意：为了活得均一的溶液，将样品与Buffer AL充分混匀是十分必要的；在添加Buffer AL后可能会产生白色沉淀，通常会在70℃孵育10min后溶解，这种白色沉淀对后续实验没有影响）

5b、将样本中加入200ul的Buffer AL,用脉冲涡流15s混匀，70℃孵育10min，短暂离心。

（注意：同5a）

6、将样本中加入200ul 96-100%乙醇，用脉冲涡流15s混匀，短暂