分子生物学研究法(下)
分子生物学课程教学大纲
分子生物学课程教学大纲课程名称：分子生物学（Molecular Biology）课程编号：1313072215课程类别：专业课总学时数：68 课内实验时数：18学分：3.5开课单位：生命科学学院生物技术教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子生物学为高等学校生物技术专业学生必修的一门专业基础课，是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，主要研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
通过分子生物学的教学，应使学生了解分子生物学的发展历史以及最新研究成果；熟练掌握DNA的结构与功能、RNA在蛋白质合成中的功能、蛋白质的结构与功能、遗传密码及基因表达调控的本质；了解现代分子生物学基本研究方法，并能运用分子生物学的理论知识分析、研究和解决问题，为进一步学习有关专业课程及从事基因工程领域的研究工作奠定基础。
二、本课程与其它课程的联系与分工从学科角度来讲，分子生物学涵盖面非常广，与生物学、生物化学和细胞生物学、遗传学等生命科学课程有交叉，《生物化学》是先修课程。
三、教学内容及教学基本要求[1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”；△表示自学内容；○表示略讲内容；第一章绪论第一节引言创世说与进化论[1]；细胞学说[2]；经典的生物化学和遗传学[3]；DNA的发现[2]第二节分子生物学简史[1]第三节分子生物学研究的主要内容分子生物学的含义[3]；DNA重组技术、基因工程技术概念[3]；分子生物学研究的主要内容[3]第四节展望分子生物学的一些分支学科[1]；分子生物学发展的趋势[1]重点：分子生物学的含义和研究内容难点：分子生物学的研究内容教学手段：多媒体教学教学方法：讲授法作业：1．简述阵德尔、摩尔根和沃森等人对分子生物学发展的主要贡献。
分子生物学第九章--分子生物学研究方法电子教案精选全文
可编辑修改精选全文完整版•第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。
本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。
电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。
从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。
分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
分子生物学的研究方法例题和知识点总结
分子生物学的研究方法例题和知识点总结分子生物学是一门从分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学。
它的研究方法多种多样，下面我们将通过一些例题来深入理解这些方法，并对相关知识点进行总结。
一、核酸提取与纯化核酸包括 DNA 和 RNA，是分子生物学研究的重要对象。
提取和纯化高质量的核酸是后续实验的基础。
例题：从植物叶片中提取总 DNA，需要经过哪些步骤？知识点：1、破碎细胞：使用机械研磨、酶解法等破坏细胞壁和细胞膜，释放出核酸。
2、去除杂质：通过加入蛋白酶 K 去除蛋白质，用酚/氯仿抽提去除酚类、多糖等杂质。
3、沉淀核酸：常用乙醇或异丙醇沉淀 DNA，离心后获得核酸沉淀。
4、洗涤和溶解：用 70%乙醇洗涤沉淀去除盐分，干燥后用适当的缓冲液溶解。
二、PCR 技术（聚合酶链式反应）PCR 是一种用于扩增特定 DNA 片段的技术。
例题：设计一对引物用于扩增某基因的特定片段，需要考虑哪些因素？知识点：1、引物长度：通常为 18 25 个核苷酸。
2、碱基组成：G ＋ C 含量在 40% 60%之间，避免形成稳定的二级结构。
3、特异性：引物要与目的基因特异性结合，避免与其他序列有过多的同源性。
4、退火温度：根据引物的碱基组成计算退火温度，以保证扩增的特异性和效率。
PCR 的基本步骤包括：1、变性：高温使双链 DNA 解离为单链。
2、退火：降低温度，引物与单链 DNA 结合。
3、延伸：在 DNA 聚合酶的作用下，从引物 3'端开始合成新的DNA 链。
三、基因克隆基因克隆是将目的基因插入到载体中，导入宿主细胞进行复制和表达。
例题：简述构建重组质粒的过程。
知识点：1、目的基因获取：可以通过 PCR 扩增、从基因文库中筛选等方法获得。
2、载体选择：常见的载体有质粒、噬菌体等，要根据实验需求选择合适的载体。
3、酶切和连接：用相同的限制性内切酶分别切割目的基因和载体，然后用 DNA 连接酶将它们连接起来。
(整理)分子生物学研究方法.
一．名词解释IP（免疫沉淀、免疫印迹）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
这个实验是用特异性抗体结合细胞裂解液中的目的蛋白，洗涤后解离特异性抗体和目的蛋白质，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），最后用Western blot分析目的蛋白质。
这种方法可以分析溶液中的、细胞内的、结合在细胞膜上的蛋白质或者受体，但只能是定性或者半定量的实验。
NLS（核定位序列）：核定位信号是另一种形式的信号肽, 可位于多肽序列的任何部分。
一般含有4～8个氨基酸, 且没有专一性, 作用是帮助亲核蛋白进入细胞核。
可分为单一型NLS和双分型NLS。
单一型NLS，由一段连续的碱性氨基酸序列排列而成（RKKKRKV），双分型NLS，有两段碱性氨基酸被中间10~12GE 非特异性氨基酸所分割而形成，（KRPAA TKKAGQAKKKKLDK）。
SUMO（small ubiquitin-related modifier）：是一种小的泛素相关修饰蛋白，它与泛素在序列上虽只有18%相同，但在二级结构和三级结构上有惊人的相似。
SUMO家族成员都有独特的N端氨基酸序列和C端外延序列。
SUMO 化（sumoylation）的功能与泛素化（ubiquitination）不同，它并不是蛋白降解，反而加强它们的稳定性或调解它们在细胞内的定位和分布，甚至与凋亡相关。
二．问答题1.什么是近交系小鼠，它们有什么特征？有哪些常见的近交系小鼠？答：近交系小鼠：是经连续20代（或以上）的全同胞兄妹交配（或亲代与子代交配）培育而成的小鼠，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。
特性：①基因位点的纯合性（Homozygosity）近交系小鼠中任何一个基因位点上纯合子的概率高达99％，因而也能繁殖出完全一致的纯合子后代。
②遗传组成的同源性（Isogenicity）品系内所有动物个体都可追溯到一对共同祖先，个体在遗传上是同源的，基因型完全一致。
分子生物学 分子生物学研究法
5‘ 供者
探针
3‘ 受者
Taqman法 分子信标(molecular beacon)法
高效液相色谱 ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ质谱分析法 DNA芯片技术（DNA chip）
SNP数据库
国立生物技术信息中心 德国的HGBAS网站
JST的数据库
2.5基因打靶(gene targeting)
通过DNA定点同源重组，改变基因组中 的某一特定基因，在生物活体内研究该 基因的功能。(反向遗传学)
抗原－抗体 特异性结合
SDS-PAGE 后转膜
基因表达产 物――蛋白
的检测
ELISA 原理和用途类似于Western blot,但在酶标板中操作，无需SDSPAGE转膜，操作简单，可批量检测，并可半定量测定。
Southern blot
Northern blot
Western blot
双脱氧法测序
gradient gel electrophoresis,DGGE) 原理:当双链DNA在变性梯度凝胶中进行 到与DNA变性温度一致的凝胶位置时， DNA发生部分解链，电泳迁移率下降， DNA链中有一个碱基改变时，会在不同 的时间发生解链，因影响电泳速度变化 的程度而被分离。
荧光共振能量传递 (fluorescent resonance energy transfer, FRET)
基因敲除(gene knockout)：定向敲除 基因敲入(gene knockin)：定向替代
基因打靶的必备条件
胚胎干细胞(ES细胞)
能在体外培养，保留发育的全能性
打靶载体
Neo（新霉素）阳性筛选标志 HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒
(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶 (thymidine kinase)
分子生物学研究方法
分子生物学研究方法
首先，核酸提取与分析是分子生物学的基础。
通过从生物体细胞中提
取核酸，可以获得DNA和RNA的样本，为后续的实验提供原料。
核酸的分
析方法包括凝胶电泳和聚合酶链式反应（PCR）等。
凝胶电泳可以根据核
酸分子的大小和电荷差异进行分离，从而获得目标核酸的纯度和浓度信息。
PCR是一种体外扩增DNA的方法，可以在短时间内从少量的DNA模板扩增
到大量的DNA产物，为后续实验提供更多的材料。
其次，蛋白质的表达与纯化是分子生物学的另一个重要研究方法。
蛋
白质是生物体内功能的执行者，因此研究蛋白质的表达与功能对于揭示生
命活动的机理具有重要意义。
蛋白质的表达通常利用重组DNA技术，将目
标基因克隆到可表达载体中，并转化到细菌或其他表达系统中。
随后，通
过诱导表达、细胞破碎、蛋白质纯化等步骤，最终获得目标蛋白质的产物。
蛋白质的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等多种方法，
可以根据蛋白质的性质和特点选择合适的方法进行纯化。
另外，生物信息学和计算生物学方法也是分子生物学研究的重要手段。
随着DNA测序技术的快速发展，大规模的基因组、转录组和蛋白质组数据
被不断积累，因此需要开发合适的计算方法进行存储、管理和分析这些数据。
生物信息学和计算生物学的研究方法涉及到生物数据库的建立和维护、序列比对、基因和蛋白质结构预测、分子动力学模拟等等。
这些方法可以
帮助研究人员更好地理解和分析分子生物学数据，从而揭示生命活动和疾
病发生发展的机理。
第九章分子生物学研究方法下自测题
第九章分子生物学研究方法下自测题单选题）可用来检测选择性剪接的方法是A. RT-PCRB. NEST-PCRC. AP-PCRD. TAIL-PCR2.（单选题）不属于基因组编辑技术的是A. ZFNB. VIGSC. TALEND. CRISPR/Cas3.（单选题）荧光共振能量转移（FRET）实验中常用的探针不包括A. 荧光蛋白B. 青色染料Cy3C. 生物素D. 荧光素4.（单选题）真核细胞的蛋白质磷酸化位点主要发生在哪种氨基酸残基A. Ser，Tyr和ThrB. Met，Pro和ThrC. Ser，Cys和TrpD. Asp，Glu和Trp5.（单选题）在植物转化的双元载体系统中，外源基因位于A. 与vir基因相同的质粒上B. 任意一个质粒C. 两个质粒都有D. 与选择性标记基因相同的质粒上6.（单选题）关于RNAi，下列说法正确的是A. 在哺乳动物细胞内，用较长的dsRNA会引发非特异性基因沉默B. 非哺乳动物细胞利用较长的双链RNA合成siRNA，最后引发RNAiC. 植物细胞利用较长的双链RNA直接诱导产生RNAi，无须合成siRNAD. RISC复合体可切割靶mRNA中与siRNA正义链互补的区域7.（单选题）酵母双杂交体系用于A. 哺乳动物功能基因的表型分析B. 研究功能基因的亚细胞定位C. 检测细胞核内发生互作的蛋白质D. 研究RNA聚合酶对转录的激活作用8.（多选题）转录组测序的方法包括A. SAGE技术B. Edman降解法C. EST技术D. Long SAGE技术9.（多选题）RNA的选择性剪接包括哪几种类型A. 内含子保留B. 5'选择性剪接和3'选择性剪接C. 外显子遗漏型剪接D. 相互排斥性剪接10.（多选题）Ti质粒上除了介导DNA转移的T-DNA片段外，还有A. 致毒Vir（virulence region）基因B. 植物生长素和分裂素合成基因C. 乙酰丁香酮合成基因D. 冠瘿碱合成基因11.（多选题）凝胶滞缓实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）可以用来研究A. DNA与蛋白质相互作用B. RNA与蛋白质相互作用C. 蛋白质与蛋白质相互作用D. DNA与RNA相互作用12.（多选题）应用RNA原位杂交可显示A. 细胞内特定的mRNAB. 蛋白质的降解速率C. 基因在染色体上的定位D. 基因的转录活性13.（多选题）荧光共振能量转移（FRET）现象发生需满足的基本条件是A. 给体与受体在1～10nm的距离B. 给体的发射光谱与受体的吸收光谱没有重叠C. 给体的发射光谱与受体的发射光谱有部分重叠D. 给体与受体的偶极具有一定的空间取向14.（多选题）关于噬菌体的叙述正确的是A. 脱离宿主细胞后不能生长和复制B. 溶原周期噬菌体称为温和噬菌体，溶菌周期噬菌体称为烈性噬菌体C. 溶原周期噬菌体感染过程中可产生大量的子代噬菌体D. 溶菌周期噬菌体DNA可整合到宿主染色体DNA上，感染过程中不产生子代噬菌体15.（判断题）反向遗传学是从表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。
第6章 分子生物学研究方法(下)
④具有良好的机械性能
非特异吸附少
4.2 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
（2）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到 固相支持物上。
（3）真空转移法
此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝
胶在上的方式将其放臵在一个真空室上，利用真空作用
将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真 空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或
硝酸纤维素膜上。
各种转移方法的比较：
6.1.2 RNA选择性剪接技术
RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前 体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。可分为：平衡剪 切、 5’ 选择性剪切、 3’ 选择性剪切、外显子遗漏型剪切及 相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基 因是否存在 选择性剪切。 果蝇 Dscam 基 因可 以通过可变 剪接产生38000多 种 可 能 的 mRNA 异构体
Illumina Solexa 测序 Workflow
Illumina Sequencing Technology
有参考基因组序列生物信息分析
• 基因结构优化
• 鉴定基因可变剪接 • 预测新转录本 • SNP 分析 • 基因融合鉴定
5.4.1 RACE 法克隆基因全长 (Rapid Amplification of cDNA Ends)
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
分子生物学的研究方法
分子生物学的研究方法分子生物学是生命科学领域中的重要分支，研究生物大分子（如DNA、RNA、蛋白质等）的结构、功能及其在生物体内的相互作用关系。
分子生物学的研究方法随着技术的不断进步，越来越高效、精准。
本文将介绍几种常见的分子生物学研究方法。
1. PCR技术PCR技术是分子生物学中最常用的研究方法之一。
PCR技术简单来说就是以DNA为模板，通过循环加热和降温的方式使DNA 分离成两条单链，并利用DNA聚合酶合成新的DNA分子。
通过PCR技术可以扩增目标DNA片段，为其他分子生物学研究提供了重要的基础。
PCR技术的具体操作是：首先选择适当的引物，引物是一段长度为15~30个核苷酸的单链DNA，与目标DNA上的两端互补，可用来定向扩增DNA。
然后将待扩增的DNA样品与引物混合，加入适当浓度的DNA聚合酶和反应缓冲液，反复加热降温，反应若干个周期后，就可以得到扩增的DNA产物。
近年来，PCR技术不断发展，出现了许多高级变体，如RT-PCR技术和qPCR技术等。
这些技术在分子生物学、医学以及疾病诊断等领域得到了越来越广泛的应用。
2. 质谱技术质谱技术是一种分析化学技术，用于测定化合物的分子量、化学式以及数量等信息。
在分子生物学中，质谱技术主要用于分析蛋白质和核酸的结构和功能。
质谱技术的基本原理是将待测样品中的分析物（如蛋白质、核酸等）转化成气态或溶液状态下的离子，并利用质谱仪测定离子的质荷比。
通过离子的质谷比可以确定分析物的分子量、化学式以及数量等信息。
质谱技术的应用范围非常广泛，包括蛋白质组学、代谢组学以及疾病诊断等领域。
随着技术的不断进步，质谱技术也变得更加高效、精准，未来将有更多的应用。
3. 基因编辑技术基因编辑技术近年来获得了长足发展，它可以通过将基因序列中的单个碱基替换、插入或删除，来打造定制化的基因组序列。
这种技术有巨大的应用潜力，可以用于人类基因疾病的治疗以及植物、动物品种改良等领域。
基因编辑技术最常用的手段是CRISPR-Cas9系统，它是一种通过结合RNAs和酶分子来定向剪切DNA的系统。
现代分子生物学(第四版)朱玉贤课件 PPT 第1章 绪论
主要教材与参考书
1.《现代分子生物学》 第3版（2007）朱玉贤、李毅、郑晓峰
2. 现代生物学精要(Instant Notes)系列 《分子生物学》第二版（2002）刘进元 《Molecular Biology》2e P.C.turner,et al 3. Principles of Biochemistry
1994 Gilman Rodbell 美国
1995
Lewis Nusslein-Volhard Wieschaus
美国 德国 美国
建立DNA测序方法
诺贝尔生理医学奖
建立和发展了单克隆抗体技术
诺贝尔生理医学奖
发现可移动癌基因
诺贝尔化学奖 诺贝尔生理医学奖
G蛋白在细胞内信息传导中的作用 诺贝尔生理医学奖
发现了控制果蝇体节发育的基因
诺贝尔生理医学奖
年份
科学家
Doherty 1996 Zinkernagel
国籍
澳 瑞士
1997 Prusiner
美
Furchgott
美
1998
Ignarro Murad
1999 Blobel
美
Carlsson
德
2000 Greengard
预计到2020年，生物医药占全球药品的比重 将超过1/3，生物质能源占世界能源消费的比 重将达5%左右，生物基材料将替代10%-20%的 化学材料。
生物制造、生物能源、生物环保等一 批新兴产业正在快速形成。
据Ernst＆Young研究报告，2010年生 物环境、生物工业处理、生物海洋技术世界市 场规模将达到 134亿美元、327亿美元、288 亿美元。
6分子生物学研究法(下)——基因功能研究技术
目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术（左图）和 大引物诱变法（右图），在基因序列中进行定点突变。
6.2 基因敲除技术
1、基本原理
经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出 发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因 序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA 与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因 改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗 传等特点。 基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全 基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动植物 个体中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系 统实现特定时间和空间的基因敲除。 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的 FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系 统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
ChIP不仅可以检测体内转录因子与 DNA的动态作用，还可以用来研究 组蛋白的各种共价修饰与基因表达 的关系。 定性或定量检测体内转录因子与 DNA的动态作用。 ChIP-chip and ChIP-seq：在基因 组水平研究DNA结合蛋白、组蛋白 修饰以及核小体分布。 ChIP-seq相对于ChIP-chip来说，具 有更高的分辨率、更小的噪音以及 更广的基因组覆盖范围。 Nucleosome Occupancy study: 一 些转录因子本身并不含有DNA结合 结构域，它是通过参与形成蛋白复 合物从而改变染色质结构来发挥作 用的；因此我们可以通过研究基因 组上核小体的分布变化来揭示转录 因子作用的过程。
第六章：分子生物学研究方法(下全文编辑修改
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交
4. 基因定点突变技术
• 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码 的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨 基酸残基 对蛋白质结构功能的影响。
二、基因敲除技术
• 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通 过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行 精确的定点修饰和基因改造。
方法: • 以9~11bp作为标签（tag）＝49＝262144组合 • 串联tag并通过两端接头PCR扩增 • 扩增产物进行测序 • 每个tag通过Genebank或EST数据库进行比对 • 确认tag代表的基因表达情况
2. RNA的选择性剪接从一个 mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。
2.凝胶阻滞试验 ➢ 是用于研究DNA与蛋白质相互作用的一种
特殊的凝胶电泳技术。
➢ 当DNA与蛋白质结合时，在电泳中会受到阻滞， 说明可能与某种特殊蛋白结合了。
3. DNAase足迹试验 ➢ 蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被
DNAase水解，电泳中对应于结合部位没有条带。
• 常用RT-PCR法研究某个基因是否存在选择性剪切。
3.原位杂交技术( In Situ Hybridization，ISH)
• 用标记的核酸探针，在组织、细胞上对核酸进行 定位和相对定量研究的一种手 段。
• 探针标记用同位素或地高辛、生物素荧光标记等。
地
同
高
位
辛
素
标
标
记
记
染色体原位杂交
三、蛋白质与RNA、DNA相互作用
1. 酵母单杂交系统 • 将待测转录因子cDNA与表达载体导入酵母细胞，
该基因产物如 果能够与顺式作用元件相结合，就 能激活启动子，使报告基因得到表达。
分子生物学常用技术下
标记方法
内标记
切口平移法 随机引物法 单链DNA探针 cRNA探针标记
末端标记
切口平移法：dsDNA，掺入率高，最常用
37℃ 15min 限速步骤 37℃ 2～3h
[α-32P]dATP
随机引物法：dsDNA，掺入率高，常用
dsDNA+随机引物
变性：沸水3min
冰浴：1min [α-32P]dATP
pERV3和pEGSH诱导体系
宿主细胞：CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3 、HEK293等
优点：产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近， 糖基化等翻译后加工最准确。
缺点：表达水平低，发酵液中目的产物我国为0.2~1g/L， 国际上多在1~2g/L以上。
2007年，全球销售额最高的6大类生物技术药物中， 有五类(肿瘤治疗药物、anti-TNF α药物、EPO、胰岛素和 凝血因子)都是经哺乳动物细胞表达生产的。 动物细胞大规模培养是当前生物药物生产的主流方式。
方法2：3’端填充标记法
T4噬菌体DNA聚合酶、T7噬菌体DNA聚合酶、Klenow片段
-
dNTP : 3’ 切酶
dNTP+: 5’
合酶
5’外 3’聚
5’末端：T4多核苷酸激酶(T4PNK)，DNA、
RNA 5’-OH末端寡核苷酸的磷酸化 磷酸基团的交换
[γ-32P] dATP
纯化
凝胶过滤层析: Sephadex G-50 乙醇沉淀法
缺点：表达的蛋白质产物不能进行翻译后修饰、 高表达时容易发生折叠错误、 E coli本身内毒素和毒性蛋白可能混杂在终产物中。
成功例子：β-干扰素
组成
表达载体
启动子：lac、trp、tac、PL启动子 目的基因编码序列 终止子：
分子生物学的研究方法例题和知识点总结
分子生物学的研究方法例题和知识点总结分子生物学作为一门研究生物大分子结构与功能的学科，对于理解生命现象的本质具有至关重要的意义。
其研究方法多种多样，涵盖了从分子水平到细胞水平，再到整体生物个体水平的多个层次。
下面我们将通过一些具体的例题来深入探讨分子生物学的研究方法，并对相关知识点进行总结。
一、分子克隆技术分子克隆技术是分子生物学研究中最常用的方法之一，它能够实现特定 DNA 片段的复制和扩增。
例题：假设我们需要从一个复杂的基因组中克隆出编码某种特定蛋白质的基因。
首先，我们通过设计特异性引物，利用 PCR（聚合酶链式反应）技术扩增出目标基因片段。
然后，将这个片段插入到合适的载体（如质粒）中，转化到宿主细胞（如大肠杆菌）中进行扩增和表达。
知识点：1、 PCR 技术的原理：基于 DNA 半保留复制的原理，通过高温变性、低温退火和适温延伸的循环过程，实现 DNA 片段的指数级扩增。
2、载体的选择：常见的载体有质粒、噬菌体和病毒等，需要根据实验目的和宿主细胞的特性来选择。
3、转化方法：包括化学转化法、电穿孔法等，目的是将重组载体导入宿主细胞。
二、核酸杂交技术核酸杂交技术是基于核酸分子的碱基互补配对原则，用于检测特定核酸序列的存在。
例题：为了检测某一细胞样本中是否存在特定的 mRNA 分子，我们可以设计与之互补的 DNA 探针，进行 Northern 杂交实验。
知识点：1、 Southern 杂交：用于检测 DNA 分子。
2、 Northern 杂交：用于检测 RNA 分子。
3、探针的标记：可以采用放射性同位素标记或非放射性标记（如荧光标记、生物素标记等）。
4、杂交条件的优化：包括温度、离子强度等，以保证特异性杂交的发生。
三、基因测序技术基因测序技术能够确定 DNA 或 RNA 分子的核苷酸序列。
例题：对一个未知基因进行测序，以确定其碱基组成和排列顺序。
知识点：1、 Sanger 测序法：通过双脱氧核苷酸终止法进行测序。
分子生物学研究方法(下)核酸分子杂交技术
增色效应（ 增色效应（二）
• 增色效应可以作为DNA变性的指标 增色效应可以作为DNA DNA变性的指标 • 不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌 不同来源DNA的变化不一， DNA的变化不一 DNA经热变性后 经热变性后， 260nm的吸光度值 DNA经热变性后，其260nm的吸光度值 可增加40%以上，其它不同来源的DNA 可增加40%以上，其它不同来源的DNA 40%以上 溶液的增值范围大多在20 30%之间 20－ 之间。 溶液的增值范围大多在20－30%之间。
DNA变性曲线（二）
6.DNA的复性 6.DNA的复性
• 复性概念： （1）复性概念：指变性 DNA 在适当条 件下， 件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双 螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。 螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。 热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性， 热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性， DNA一般经缓慢冷却后即可复性 此过程称之为“ 退火” annealing）。 此过程称之为“ 退火”（annealing）。
2）DNA的（G+C）含量 DNA的 G+C）
• 在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于 在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于 DNA分子中的 G+C）的含量。 分子中的（ DNA分子中的（G+C）的含量。 • （G+C）含量越高，G-C 碱基对越多，Tm值越 G+C）含量越高， 碱基对越多，Tm值越 高。因G-C碱基对具有3对氢键，而A-T碱基对 碱基对具有3对氢键， 只有2对氢键，DNA中 G+C） 只有2对氢键，DNA中（G+C）含量高显然更能 增强结构的稳定性， 间氢键需比A 增强结构的稳定性，破坏 G-C间氢键需比A-T 氢键付出更多的能量， G+C）含量高的DNA DNA， 氢键付出更多的能量，故（G+C）含量高的DNA， 其变性Tm也高。 Tm也高 其变性Tm也高。
分子生物学研究方法
分子生物学研究方法
分子生物学研究方法是研究生物分子结构、功能和相互作用的一系列实验方法和技术。
这些方法帮助科学家了解细胞的基本结构和功能，研究生物分子在疾病发展、遗传变异和进化中的作用。
以下是一些常用的分子生物学研究方法：
1. DNA提取：从细胞或组织中提取DNA，以用于后续实验。
2. 聚合酶链式反应（PCR）：用于扩增DNA片段，以便进行分析和检测。
3. 凝胶电泳：用电场将DNA、RNA或蛋白质分离成不同大小的片段，以便研究其结构和功能。
4. 蛋白质纯化：通过一系列步骤将目标蛋白质从混合物中纯化出来，以获得足够的纯度用于研究。
5. 克隆：将DNA序列插入到载体中，以产生大量目标DNA 分子，用于进一步的分析和实验。
6. 基因测序：确定DNA序列的顺序，以研究基因功能、分析遗传变异或进行进化研究。
7. 基因表达：将目标基因转录成mRNA，并翻译成蛋白质，以研究基因功能和调控机制。
8. 蛋白质相互作用：使用技术如亲和层析、酵母双杂交等研究蛋白质之间的相互作用关系，以探索细胞信号传导和代谢途径。
9. 基因编辑：利用技术如CRISPR/Cas9，对细胞或生物体的基因进行精确的编辑，以研究基因功能或治疗遗传疾病。
分子生物学研究方法的不断发展和创新使得科学家可以更深入地了解生物分子的结构、功能和相互作用，为疾病治疗和生物技术的发展提供了基础。
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（2）蛋白质芯片利用蛋白质间的相互作用如抗原-抗体反 应或受体-配体之间的特异作用来进行检测。
（3）其它生物芯片有样品制备芯片、核酸扩增芯片、毛 细管电泳芯片等，即在芯片上分别进行样品的分离、扩增、 生化反应等过程。
酵母双杂交体系在细胞周期调节、信号传导、 肿瘤基因表达等诸多的研究领域，都有着广泛的应 用。
➢ 转录因子的两个主要结构域
a. DNA结合域(DNA binding domain, BD)，它可识别 效应基因上游的一段特定的区段，即上游激活序列 (up-stream activating sequence, UAS)，并与之 结合。
进而激活其下游报告基因（如lacZ）的表达。若X与Y不发生
相互作用，则报告基因不表达。即，通过检测报告基因是否 表达，就可分析蛋白X与Y二者之间是否发生了相互作用。
4 基因芯片
➢ 生物芯片的概念及其种类和作用
生物芯片（biochip）是指通过微电子、微加工技术在芯 片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、DNA、 蛋白质及其它生物组分的快速、敏感、高效的处理。生物芯 片可以分为DNA芯片、蛋白质芯片和其它芯片三类。其中前两 者属于检测种有功能的GAL4转录因子。
2）这种有功能活性的GAL4转录因子能识别GAL4效应基因上游
的激活序列(GAL4 UAS)，从而启动下游报告基因(lacZ或 his3)的表达。 3）若报告基因是lacZ, 则可通过显色反应筛选阳性克隆。
为猎物蛋白质(prey protein)
（2）酵母双杂交体系的寄主菌株
将酿酒酵母基因组中的GAL4的编码基因剔除掉，发展成 酵母双杂交体系转化系统的寄主菌株。例如SFY526和HF7c 等。
SFY526菌株：
(a) 丧失了表达内源GAL4转录因子的能力。
(b) 具有lacZ报告基因。 (c) trp1和leu2转化标记，在无Trp和Leu的培养基中不生长。
当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，若它在 凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与 提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了。
*
*
放射性标记的DNA
*
凝胶电泳
* B* * ** *
B
A
C
细胞蛋白质提取物
* 蛋白质与DNA结合
DNA-蛋白质结合物 电泳迁移缓慢
放射自显影
滞后带表明DNA与蛋 白质结合
➢ 检测原理和步骤举例
(1)制作芯片：将核苷酸序列探针，固定于芯片 上，芯片上可固定成千上万个探针。
（2）从被测对象的细胞中提取DNA，用酶切成较 小的片段，并对DNA作荧光标记，并熔解成单链。
（3）将样品滴加到芯片上并与芯片上的探针杂交， 凡是与探针互补的酶切片段会固定于特定位置上， 不能互补的片段会被洗脱掉。
b. 转录激活域(Transcriptional activation domain, AD)，它通过与转录机器(transcription machinery)中其它成分的结合作用，以启动UAS下 游基因进行转录。
➢ 酵母半乳糖苷酶基因的转录因子-GAL4
研究发现，真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、 功能上独立的结构域组成的。
第六章
分子生物学研究方法(下)
本章主要内容
基因表达研究技术 蛋白质组学及研究技术
1 基因改造技术
（1）体外改造
1）缺失：DNA→限制酶酶切→外切酶Bal 31酶切
→连接酶。 2）点突变：DNA→变性→与突变的引物杂交→聚
合反应，连接反应。
➢ 定点突变（site-directed mutagenesis） 是指通过
若蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白 质，经DNaseI消化之后便会产生出距放射性标记末端 1个、2个、3个核苷酸等一系列长度仅相差一个核苷 酸的连续的DNA片段梯度群体。若有一种蛋白质已经 结合到DNA分子的某一特定区段上，那么，它将保护 这一区段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不 能产生出相应长度的切割条带。在电泳凝胶的放射自 显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标 记条带的空白区域，人们形象地称之为“足迹”。
➢ 基因芯片
DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成（in situ synthesis）寡核苷酸探针，或者直接将大量的DNA探针以 显微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后与标记的 样品杂交，通过对杂交信号的检测分析即可得出样品的遗 传信息（基因序列及表达的信息）。由于常用计算机硅芯 片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。DNA芯片又称为基 因芯片（gene chips）、DNA微阵列（DNA microarray）、 cDNA芯片（cDNA chips）、寡核苷酸阵列 （oligonucleotide array）等。
PCR等方法向目的DNA片段中引入点突变，使已克隆基因或 DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失等。 定点突变能迅速和高效地改变DNA所表达的目的蛋白的性状， 是基因工程和蛋白质工程的重要研究手段。
基因的体外改造
（2）体内改造
➢ 基因敲除：是一种基因打靶技术。主要是 应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替 代靶基因片段；也可通过插入突变,使靶基因 失活。
HF7c菌株： (a) 丧失了表达内源GAL4转录因子的能力。
(b) 具有His3和LacZ报告基因。 (c) trp1和leu2转化标记，在无Trp和Leu的培养基中不生长。
（3）共转化
从大肠杆菌细胞中分别提取杂种质粒I和杂种质粒Ⅱ，并 共转化酵母菌株(例如)HF7c。
涂布在选择培养基(缺少His、Leu和Trp三种氨基酸)上，以 便筛选那些表达相互作用的杂种蛋白质的菌落。
在酵母GAL4的N端1-147位氨基酸区有一个DNA结合域(DNABD)；在GAL4的C端768-881位氨基酸区有一个转录激活域(AD)。 一般情况下，BD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段
（UAS）相结合，AD则推动了转录起始。
按照所用转录因子的异同，可将酵母双杂交体系分 为LexA和GAL4两个类型，在此以GAL4类型为例。
凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质结合，于是在凝胶 电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带
2.2 DNaseI足迹试验（DNA foot-printing assay）
将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制性内 切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链单个末端标记的 双链DNA分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后， 再加入少量的DNaseI（它可沿着靶DNA作随机单链切割）消化 DNA分子，并控制酶的用量使之达到平均每条DNA单链只发生 一次磷酸二酯键断裂。
➢ siRNA（small interfering RNAs）是一种由 Dicer酶切dsRNA而来的短片断双链RNA分子(21-23bp)， 参与RAN干扰过程。
➢ Dicer：是一种RNaseIII,能特异识别和逐步切割 外源双链RNA，将RNA降解为21-23bp的双链RNAs (siRNAs)。
若将BD和AD这两个结构域的编码区分别克隆到两个载体 中,再把它们转入同一寄主细胞中进行表达，由此产生的GAL4 DNA-BD和GAL4 AD多肽，由于彼此之间不直接发生相互作用， 所以不能激活其相关的效应基因进行转录。
若将上述分开的两种结构域在体内重新组装成具有功能 活性的转录因子，则能激活下游报告基因进行表达。
（4）对芯片上的荧光作扫描和分析。
DNA微阵列技术示意图
微阵列杂交图
5 RNAi(RNA interference)技术
（1）相关概念
➢ RNAi (RNA interference，RNAi): 是正常生物 体内抑制特定基因表达的一种现象。当向细胞中 导入与内源性mRNA编码区同源的dsRNA时，该mRNA 发生降解而导致基因表达沉默。 RNAi具有特异性 和高效性。此现象发生在转录后水平，又称为转 录后基因表达沉默。 RNAi是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、 抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具 有重大生物学意义。
➢ 总结：酵母双杂交系统是一项研究蛋白质之间相互作用
的实验技术。其系统组成及原理如下：GAL4蛋白是酵母的转 录激活因子，具有DNA结合结构域（DNA binding domain， BD；位于氨基端1～147氨基酸）和转录激活结构域 （transcriptional activating domain，AD；位于羧基端 768～881氨基酸）。为了研究已知蛋白X与未知蛋白Y之间是 否能够相互作用，则将GAL4的BD编码区cDNA与蛋白X的cDNA 按正确的ORF阅读框连接在一起，构建一重组质粒；同理， 将GAL4的AD的cDNA与蛋白Y的cDNA连接在一起，构建另一重 组质粒。将两种质粒共转化工程酵母菌（其编码GAL4的基因 已缺损），则二者分别表达融合蛋白“BD-X”（“诱饵”， bait）和“AD-Y”）（“猎物”或靶蛋白，prey or target protein)。若蛋白X和Y二者之间在酵母细胞核内能够发生相 互作用，则相当于将原来已拆开的BD和AD又连在了一起， GAL4的活性被恢复，识别并结合于特异的DNA调控元件上，
➢ 酵母双杂交体系的构建过程
（1）构建两种E.coli-Yeast穿梭质粒载体
1）第一种质粒载体pGBT9，这种质粒载体又叫做诱饵质粒
载体或DNA-BD质粒载体(具trp基因) 。
把已知的 靶蛋白质编码 基因克隆到 pGBT9的多克隆 位点上。
通常将此种与BD融合的蛋白质叫做诱饵蛋白质(Bait protein)
1）同源重组
2）非同源重组
2 DNA与蛋白质相互作用研究
2.1 凝胶阻滞试验（gel retardation assay）