分子生物学实验理论考试

2012-2013学年第二学期分子生物实验考试题库

1、PCR原理是什么？

答：PCR技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它的特异性是由两个人工合成的引物序列决定。引物就是与待扩增DNA片段两侧互补的寡核苷酸。双链DNA是在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链DNA分子（变性），两引物分别与两条DNA的两侧序列特异复性，在适宜条件下，DNA 聚合酶以单链DNA为模板，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸，在引物的引导下，按5'→3'方向复制互补DNA，即引物的延伸。在适宜的条件下，这种热变性→复性→延伸的过程不断循环重复，前一个循环的产物DNA可作为后一个循环的模板DNA参与DNA合成，使产物DNA的量按2^n方式扩增。

2、PCR一般体系应加入哪些试剂？

答：10*PCR缓冲液（含Mg+）、模板DNA、四种dNTP、一对引物、耐热Taq 聚合酶。

3、PCR防止其它DNA污染，应注意哪些问题？

答：标本放置时密封要严避免溢于容器外，容器要清洁避免造成相互间交叉污染；移液器使用要规范避免污标本间污染;无菌工作台操作，避免气体中有杂菌。

4、影响PCR产物产量的因素主要有哪些？

答：引物、酶的种类及浓度、dNTP的质量（优劣）与浓度、模板核酸的量与纯化程度、Mg2+浓度、温度与时间、循环次数。

5、引物设计应注意哪些问题？

答：①引物长度不宜过长20bp左右较佳；②引物扩增片段的长度以200-500为宜；③引物碱基的中G+C的含量应在40-60%为宜，G+C太少则扩增效果不佳，G+C过多则易出现非特异条带；④避免引物内部出现二级结构，避免两天引物间互补，特别是3'端的互补否则会形成二聚体结构；⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败。

6、简述克隆某一原核生物基因片段一般操作步骤？

答：克隆某一原核生物基因片段是可用PCR技术对基因进行大量扩增，首先准备好实验材料大体为：需扩增的模板DNA、DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR 缓冲液、引物等、其过程大体分为3个步骤：第一步：变形：通过加热使DNA 模板双螺旋链解离为单链，第二步：退火：当温度突然降低时。由于模板DNA 结构复杂难再互补，而引物建构简单且数量巨多易于模板DNA互补杂交从而使引物结合到模板上DNA上，第三部：延生：在DNA聚合酶和四种底物及镁离子存在条件下DNA连开始延伸。以上3个步骤为一个循环，数小时后即可得到大量扩增的目的片段。

7、什么是质粒？质粒的基本性质有哪些？

答：a质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。b具有复制起点。携带易于筛选的选择标记。具有多种限制性内切酶的切割位点。具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。

8、质粒抽提实验中溶液I、II、III各有什么作用？

答：溶液I:由葡萄糖,EDTA,Tris Cl组成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒DNA;EDTA的作用是络和掉Mg2+等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用;Tris Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。溶液II:由SDS与NaOH组成.SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性;NaOH(pH>12)的作用是破坏氢键,使DNA分子变性。

溶液III:由KAc与HAc组成,是pH值为5.5的高盐溶液.能中和溶液II的碱性,使染色体DNA复性而发生缠绕并使质粒DNA复性.K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去.溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质,很容易与小分子的质粒DNA分离,此外,高盐溶液也有利于各种沉淀的形成。

9、碱裂解法抽提质粒DNA的基本原理是什么？

答：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。PH介于12.0~12.5时，线性DNA变性，双链打开，而质粒DNA 虽变性，但两条互补链彼此缠绕，当PH恢复到中性时，质粒DNA可迅速准确的完成复性，而线性DNA复性较困难，缠绕成网状，通过离心可沉淀除去。10、在碱裂解法提取质粒DNA操作中应注意哪些问题？

答：（1）正确使用移液器。（2）溶液ll必须新鲜配制。（3）加入酚-氯仿后必须充分混匀。（4）混匀的过程不能太过剧烈。（5）每次弃上清液时都应用移液器吸去管壁上黏附的水珠。（6）吸取酚-氯仿溶液时要将Tip头插入液体分层的下侧。【可根据第一次试验自己写的注意事项进行补充】

11、在碱裂解法提取质粒DNA时，酚/氯仿的作用是什么？

答：酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去，氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，本身酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白质

12、碱裂解法提取的质粒DNA分子一般有几种构象？电泳时移动速率有何差异？

答：超螺旋DNA＞线性DNA＞开环DNA

13、提取植物基因组DNA的基本原理是什么？在操作过程中应该注意什么？

答：①基本原理:利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经异丙醇沉淀。②注意事项:⑴材料要新鲜娇嫩，叶片研磨地越细越好；⑵操作应为无菌操作；⑶操作应温和，不宜剧烈晃动；⑷注意移液器的正确使用。

14、在植物基因组提取过程中，DNA 降解的可能原因？

答：原因:⑴从植物中提取DNA时没对细胞内的DNA酶进行灭活；⑵操作过程中被细菌污染了；⑶口水等含酶物质飞入样品中；⑷温度、PH等变化过于剧烈。

15、在植物基因组提取过程中，提高DNA 产量的措施？

答：应当选取幼嫩的叶片，因为幼嫩叶片中的DNA含量高些；组织抽提前要保存在液氮中，以免DNA被破坏；纯化时注意抑制核酸酶污染，使用EDTA等防止DNA降解；整个实验过程应该温和操作，不能剧烈振荡，混合过程要轻缓，减少抽提，减少DNA片段被认为降解，因为过度振荡会使DNA断裂成小片段。

16、在使用苯酚进行DNA提取时应该注意什么？

答：酚一定要进行碱平衡，苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜、眼睛会对人体造成损伤，应当注意防护；它是出去蛋白质的，要充分振荡使蛋白质变性，但不能太剧烈而打断DNA；离心后应该避免再次吸入有机相的苯酚—氯仿，尽量只取上清，不应该让苯酚最后仍有残留，需抽提干净。

17、在提取植物基因组DNA过程中，使用苯酚与氯仿的作用是什么？

答：用苯酚和氯仿抽取，去除多余的蛋白，保证提取的基因组较纯净。

18、在植物基因组提取过程中，该如何检测和保证基因组DNA的质量？

答：检测：琼脂糖凝胶电泳；保证DNA活性:用EDTA抑制DNA酶活性，从而保证DNA不被破坏。

19、什么是限制性内切酶？

答：限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，有三种类型，Ⅰ类，Ⅱ类，Ⅲ类，他们都有甲基化修饰功能和限制酶功能，Ⅱ类常用于分子克隆

20、常见的Ⅱ型限制性内切酶切割双链DNA后会产生末端或末端。答：粘性，平

21、下列有关限制性内切酶的描述，错误的是：（C）

A．一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列

B．限制性内切酶的活性受温度的影响

C．限制性内切酶能识别和切割RNA

D．限制性内切酶可以从原核中提取

22、现有一长度为l 000 bp的DNA分子，用限制性核酸内切酶EcoR I酶切后得到

的DNA分子仍是l 000 bp，用Kpn I单独酶切得到400 bp和600 bp 2种长度的