流式细胞术之基本原理及运用

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LP 500
SP 500
BP500/50
Long pass
Short pass
Band pass
1.2.3 电子系统
光信号
电信号
数字信号
(一)光电检测器(photodetector)
• 光电二极管(photodiode) 光灵敏度低,测定强信号(FSC); • 光电倍增管(photomultiplier, PMT) 光灵敏度高,测定弱信号(SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)。
流式细胞仪的发展及商品化
• • • • • • • • 1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析-流动式); 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题); 1956 Coulter原理(血细胞计数器); 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用; 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置; 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光); 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS); 1973 BD公司与斯坦福大学合作,研制生产第一台商用流 式细胞仪-FACS Ⅰ。 • 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
PARTEC 分选模块PPCS
Piezo HV: 400~560
分选指标
• 分选速度、分选纯度和分选收获率,相互影响。 • 分选时间由三方面决定:进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
1 104 105 106 1.7 min 16.8 min 2.8 h
目标细胞所占比例(%)
PMT
前向散射光 光电二极管
(二)电信号两种放大方式
• 由于光信号比较弱,需将其等比例放大,方便计算机分析 处理,一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。
线性(linear; lin) 对数(logarithmic; log)
• 一般FSC和SSC变异范围较小,故使用线性放大;荧光信号 变异范围较大,多使用对数放大。
1.3.1 散射光信号
(一)前向散射光FSC
FSC信号方向与激光束平行,偏离度一般在1 -6度范围内, 亦称小角度散射光,主要反映被测细胞的体积大小和活力。
(二)侧向散射光SSC
• SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直,亦称90度散 射光,其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。
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(三)散射光的作用
流式细胞仪的分类
• 分析型流式细胞仪
– 细胞样本分析后最终进入废液桶,不能回收利用。
• 分选型流式细胞仪
– 既能流式分析,还能对分析的目的细胞进行分选;
– 进样管道较长,还需要保持无菌状态,所以分选型流 式细胞仪一般只用于分选。
1.2 流式细胞仪的结构组成
• 液流系统
– 流动室 – 液流驱动系统
鞘液
鞘液
细胞流
激光照射点 流体动力学聚焦示意图
流式细胞仪液流系统示意图
流动室
• 流动室(flow cell, flow chamber)是流式细胞仪的核心部件。 流动室中,被测细胞逐个通过,并在此与激光正交。
进样孔
鞘液Sheath 荧光信号 激光束
流动室结构图:单细胞发生器
1.2.2 光路系统
激发光波长 (nm) 490 488 发射光波长 (nm) 520 575
荧光素分子 FITC PE
中文名 异硫氰酸荧光素 藻红蛋白
PerCP
APC PE-Cy5 PE-Cy7 Alexa Flour 488 Alexa Flour 647
490
650 496/546 496/546 495 650
细胞因子
核酸含量
流式细胞术在生物医学中的应用举例
• • • • • • • • 血细胞免疫分型分析 细胞群比例分析 检测基因表达 染色体倍性分析 细胞周期分析 细胞凋亡 微生物分析 细胞绝对计数等
植物倍性-DAPI
细胞周期-PI
转染GFP表达-GFP
人外周血T淋巴细胞分析
GLC细胞凋亡检测
– 富集模式(enrich mode)
– 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
2 流式细胞术在生物医学中的应用
FCM可检测下列细胞成分: • 表面标记物 核内抗原 • 胞浆标记物 • 核内标记物 • 可溶性成分
黏附因子 胞内抗原 表面受体 分泌到胞外的 细胞因子
• 实验中,常利用FSC和SSC这两种参数的组合,区分不同的 细胞群体,去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
粒细胞
单核细胞
淋巴细胞
红细胞、死细胞和碎片
(三)阈值 Threshold
• 阈值:溶液中的杂质或者死细胞,很容易产生微小的干扰 信号,所以必须设置阈值,排除杂质、细胞碎片或体积较 小的死细胞。 • FSC反映细胞体积的大小,FCM应用时常选取FSC设定阈值。
5%
32%
默认阈值
升高阈值后
1.3.2 荧光信号
(一)荧光: 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变
为高能状态,再回到低能状态时释放出的光。
激发波长 Excitation wavelength

发射波长(荧光波长) Emission wavelength
(二)常用荧光素
<499nm 蓝色荧光(Blue); 500-549nm,绿色荧光(Green); 550-584nm,黄色荧光(Yellow); 585-615nm,橙色荧光(Orange); 616-700nm,红色荧光(Red); ≥700nm,远红外荧光(Far-Red)。
675
660 670 767 519 665
多甲藻叶绿素蛋白
别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
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(三)荧光抗体的选择
A 根据流式细胞仪选择抗体
• 流式细胞仪能检测的通道数(由激光器种类、数量和使用 的光学滤片决定)。如PARTEC CyFlow Space 分析模块:
488 FL1 FL2
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1.3 流式细胞术光信号检测
光信号的类型 • 散射光信号:与标记荧光素无关,
是细胞的固有参数。 – 前向散射光(forward scatter, FSC); – 侧向散射光(side scatter, SSC).
• 荧光信号
– 自发荧光 :微弱 – 特异荧光:标记的荧光素分子发出 的荧光,比自发荧光强很多倍。
FITC、Alexa Fluor 488 PE PI PE-Cy5、PerCP APC、AF647
FL3
FL4 640 FL10
• 多色标记荧光素搭配原则:每个通道只能选择一种荧光素; 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同; • 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料,更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原:
主要内容
• 一、流式细胞仪结构和原理
– – – – 流式细胞术简介 流式细胞仪的结构组成 流式细胞仪的光信号检测 流式分选
Baidu Nhomakorabea
• 二、流式细胞术在生物医学中的应用
1.1 流式细胞术简介
• 流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个 细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量 分析和分选的技术。
CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE CD5
C 选择荧光波谱间光谱重叠较小的荧光染料进行组合, 同时需要正确的调节补偿。
1.5 流式分选
电荷式分选
–超声振动器(15-100kHz) lasers –液流充电系统 –高压偏转板 –收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电)
高压偏转板
电荷式分选装置
(一)激发光源 :激光器
激光器 氩离子 产生的激光波长(nm) 通常产生488,514,UV(351/364)
红色 氦-氖(He-Ne) 633 蓝色固体 红色二极管 488 635
– 激光特点:单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。 – 现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器
( 二) 光 束 成 行 系 统
• 光路系统
– 激发光源 – 光束收集系统
• 电子系统
– 光电转换器 – 数据处理系统
• 细胞分选系统
– 喷嘴 – 电偏转板 – 样本收集器
1.2.1 液流系统
• 鞘流技术:根据层流原理发 展起来的技术,可以实现两 种液体的同轴流动,样本细 胞流位于轴心稳定流动,外 面包裹有鞘液(sheath)。 • 流体动力学聚焦:稳定的液 流从截面积较大的部分流入 截面积较小的部分后,有一 个聚焦收缩作用,细胞流直 径被约束在10-20um,避免 了多个细胞重叠进入检测区。
FCM的单细胞照明技术:这种椭圆形光斑的检测区保证样 11 本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。
(三)光收集系统
• 滤光片的组成
– 长通滤片(LP):只允许特定波长以上的光束通过; – 短通滤片(SP):只允许特定波长以下的光束通过; – 带通滤片(BP):只允许一定波长范围内的光束通过。
460 500 540 460 500 540 460 500 540
5 20 s 3.4 min 3.4 min 50 2s 20 s 3.4 min
107
1.2 天
5.6 h
34 min
分选时间表(机器流速10000个/s时)
• 分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比,一般能达 99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的,纯度提高,收获率 降低,反之亦然。
• 流式细胞仪(Flow Cytometer )是集细胞与分子 生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计 算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的一种新型高科技仪器。
流式细胞术的特点
• • • • • • 检测对象:单细胞悬液或生物颗粒; 检测参数:多参数; 检测特点:单细胞水平分析; 检测速度:高速,最高达上万个细胞/秒; 检测结果:精度高、准确性好; 可对目标细胞进行分选;
• 通道(channel)
一个光电检测器就是一个通道,有多少个光电二极管/倍 增管,就有多少个通道: – 散射光通道: FSC通道和SSC通道; – 荧光通道 • 通道命名方式: – 以FL(fluorescence)加数字命名,如FL1、FL2、FL3等。 – 以该通道接收的主要荧光素命名,如FITC通道、PE通道、 APC通道等。 小结: 分析型流式结构 液流系统 光路系统 电子系统
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