生物化学实验技术-PowerPointPresenta
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临床生物化学检验常用技术ppt课件 ppt课件
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20
❖ 1、制备标准液 ❖ 2、显色反应 ❖ 3、比色 ❖ 4、作图 ❖ 5、制作检量表。
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21
标准曲
1
线法
0.5
吸光度
0 0 20 40 60 80 100
标准曲线
浓度
将一系列浓度不同的标准溶液按照、 一定操作过程显色后， 分别测吸光度，以吸光度为纵坐标， 浓度为横坐标绘制标准曲线。 从标准曲线找出相对应的待测样品的浓度， 即标准曲线法。
第3章
临床生物化学检验常用技术
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1
本章主要内容
① 光谱检验技术 ② 电化学分析技术 ③ 电泳技术 ④ 干化学技术 ⑤ PCR技术
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2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
熟悉离心技术，其它电泳技术和层析技术 中的HPLC及亲和层析的原理和应用；免疫分析 技术、生物传感技术的概念和应用原理。
了解色谱、层析等常用生化技术的应用原 理和方法，生物芯片技术的概念和应用原理。
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5
第一节 光谱分析技术
分光光度技术的基本原理 分光光度计的基本结构 分光光度计的操作方法 分光光度技术的定性和定量方法
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22
制作和应用标准曲线时应注意下面几点：
（1）浓度范围足够大 （2）减少偶然误差 （3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。
（4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。
（5）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘 制。
《生物化学实验》PPT课件
掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术， 尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加 科研工作打下坚实的基础。
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24
3 实验记录与实验报告
3.1 实验记录 实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔)。 实验中应及时准确地记录(专用纸，事先在记录纸上
设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量 的数据。 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为 “0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽 可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差 很大，也都应如实记录，不得涂改。 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、 编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试 剂的浓度等。
编辑ppt
25
3 实验记录与实验报告
3.2 实验报告
实验报告的格式应为：
⑴ 实验目的；
⑵ 实验原理；
⑶ 仪器、材料和试剂；
⑷ 实验步骤；
⑸ 结果讨论（含数理据处）；
⑹ 注意事项;
(7) 思考题
注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有 关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化 学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析 和见解，并欢迎对实验提出改进意见。
编辑ppt
35
（2）离子交换层析
原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固 定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。
常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交 联剂：二乙烯苯）
阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基 阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 可交换离子：阳离子：Na+、H+
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21
7、实验六 酵母RNA的提取和鉴定 (4学时) 8、实验七 血糖含量的测定 （4学时） 9、实验八 脂肪酸的β-氧化 （5学时） 10、实验报告讲解及考核 （2学时）编辑ppt22绪论1 实验目的
编辑ppt
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3 实验记录与实验报告
3.1 实验记录 实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔)。 实验中应及时准确地记录(专用纸，事先在记录纸上
设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量 的数据。 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为 “0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽 可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差 很大，也都应如实记录，不得涂改。 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、 编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试 剂的浓度等。
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3 实验记录与实验报告
3.2 实验报告
实验报告的格式应为：
⑴ 实验目的；
⑵ 实验原理；
⑶ 仪器、材料和试剂；
⑷ 实验步骤；
⑸ 结果讨论（含数理据处）；
⑹ 注意事项;
(7) 思考题
注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有 关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化 学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析 和见解，并欢迎对实验提出改进意见。
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（2）离子交换层析
原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固 定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。
常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交 联剂：二乙烯苯）
阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基 阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 可交换离子：阳离子：Na+、H+
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21
7、实验六 酵母RNA的提取和鉴定 (4学时) 8、实验七 血糖含量的测定 （4学时） 9、实验八 脂肪酸的β-氧化 （5学时） 10、实验报告讲解及考核 （2学时）编辑ppt22绪论1 实验目的
《生物化学实验》PPT课件
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24
四.几种常见电泳的比较
类型
优点
缺点
纸电泳
设备操作简单
分辨率差，电渗现 象
醋酸纤维薄膜电 设备操作简单，样品
泳
用量少
分辨率差
琼脂糖凝胶电泳 快速，分辨率高
电渗现象严重
聚丙烯酰胺凝胶 电泳
可调节凝胶孔径，样 品用量少分辨率高，
无电渗现象
高浓度凝胶难剥离
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25
五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理
A.凝胶层的不连续性
浓缩胶T=2.8％ C=20%；分离胶T=7％ C=2.5%
B.缓冲液成分的不连续性：
凝胶缓冲液Tris-HCl,含Cl－，电极缓冲液Tris-Gly,Gly
－
C.pH的不连续性：
浓缩胶pH6.7,分离胶pH8.9，电极缓冲液pH8.3
D.电位梯度的不连续性
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30
五. 盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 （2）盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应
样品的浓缩效应
电荷效应
分子筛效应
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31
A. 样品的浓缩效应
缓冲液成分及pH的不连续性 浓缩胶pH6.7 缓冲液 浓缩胶Tris-HCl, 电极缓冲液Tris-Gly
解离度 ：Cl> 蛋> Gly mcl cl>m蛋 蛋>m Gly Gly 凝胶中Cl－为快离子， Gly－为慢离子，
蛋白质从“－”极向“＋”极移 动，从浓缩胶进入分离胶，速 度变慢，堆积浓缩。
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缓冲 液
浓缩胶 分离胶
40
B.电荷效应
蛋白质样品进入分离胶后 pH增大(pH 8.9)，Gly－解离度增 大，不存在快、慢离子之分， 蛋白质样品在均一电场强度和 pH条件下泳动。
生化实验基本操作ppt课件
18
o 结果分析和讨论：讨论部分不是对实验结果 的重述，而是关于实验方法(或操作技术)和 有关实验的一些问题，如对实验的正常结果 和异常现象以及思考题进行探讨；对于实验 设计的认识、体会和建议；对实验课的改进 意见等。
19
o 1．新购置玻璃仪器的清洗 新购买的玻璃 仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用 肥皂水(或去污粉)洗刷，再用自来水洗净， 然后浸泡在l％~2％盐酸溶液中过夜(不少 于4h)，再用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲 洗2~3次，在烘箱内 。
3
o 3．注意保持实验室的整洁。实验完毕，须 将药品试剂排列整齐，仪器要放好，将实验 台面抹拭干净。使用后的玻璃仪器要清洗干 净放好。
4
o 4．要爱护实验仪器，节约使用各种试剂、 物品。使用仪器时，应小心仔细，防止损坏 仪器。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操 作规程，发现故障立即报告教师，不要自己 动手检修。仪器损坏时，应如实向教师报告。
39
o 分光光度法具有操作简便，快速等特点，它 是生物化学分析的重要手段之一，也是其他 学科进行分析研究的重要手段之一，对医学 生来说是一项重要的操作技术。
40
o 原理 分光光度法作为定量分析的基本依据 是Lambert-Beer定律，他们根据一系列的 实验证明：当一束单色光通过溶液介质时， 部分光能被溶液吸收。吸收的比值(透射光 /入射光)和入射光的强度无关，但与介质 的厚度及介质的浓度成正比。
49
o 3．比色杯外壁的液体用擦镜纸或细而软的 吸水纸吸干，再放入比色槽。不能用吸水纸 擦比色杯内壁。
o 4．测定有色溶液时，一定要用少量的原液 (有色溶液)洗比色杯内壁1~2次，以免改
变有色溶液的浓度。另外，在测一系列溶液 时，通常是按从稀到浓的顺序测定，以减少 测量误差。
o 结果分析和讨论：讨论部分不是对实验结果 的重述，而是关于实验方法(或操作技术)和 有关实验的一些问题，如对实验的正常结果 和异常现象以及思考题进行探讨；对于实验 设计的认识、体会和建议；对实验课的改进 意见等。
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o 1．新购置玻璃仪器的清洗 新购买的玻璃 仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用 肥皂水(或去污粉)洗刷，再用自来水洗净， 然后浸泡在l％~2％盐酸溶液中过夜(不少 于4h)，再用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲 洗2~3次，在烘箱内 。
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o 3．注意保持实验室的整洁。实验完毕，须 将药品试剂排列整齐，仪器要放好，将实验 台面抹拭干净。使用后的玻璃仪器要清洗干 净放好。
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o 4．要爱护实验仪器，节约使用各种试剂、 物品。使用仪器时，应小心仔细，防止损坏 仪器。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操 作规程，发现故障立即报告教师，不要自己 动手检修。仪器损坏时，应如实向教师报告。
39
o 分光光度法具有操作简便，快速等特点，它 是生物化学分析的重要手段之一，也是其他 学科进行分析研究的重要手段之一，对医学 生来说是一项重要的操作技术。
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o 原理 分光光度法作为定量分析的基本依据 是Lambert-Beer定律，他们根据一系列的 实验证明：当一束单色光通过溶液介质时， 部分光能被溶液吸收。吸收的比值(透射光 /入射光)和入射光的强度无关，但与介质 的厚度及介质的浓度成正比。
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o 3．比色杯外壁的液体用擦镜纸或细而软的 吸水纸吸干，再放入比色槽。不能用吸水纸 擦比色杯内壁。
o 4．测定有色溶液时，一定要用少量的原液 (有色溶液)洗比色杯内壁1~2次，以免改
变有色溶液的浓度。另外，在测一系列溶液 时，通常是按从稀到浓的顺序测定，以减少 测量误差。
生物化学PowerPointPresentation
酶是生物催化剂(biological catalyst)， 具有两方面的特性，既有与一般催化剂相 同的催化性质，又具有一般催化剂所没有 的生物大分子的特征。酶与一般催化剂一 样，只能催化热力学允许的化学反应，缩 短达到化学平衡的时间，而不改变平衡点。 酶作为催化剂在化学反应的前后没有质和 量的改变。微量的酶就能发挥较大的催化 作用。酶和一般催化剂的作用机理都是降 低反应的活化能(activation energy)。因为 酶是蛋白质，所以酶促反应又固有其特点。
• 当底物浓度很低([S]《 Km)时,V=Vmax [S]/ Km,反应速度与底物浓度成正比。当底物浓度很高 ([S] 》Km)时，V≌Vmax，反应速度达最大速度， 再增加底物浓度也不再影响反应速度。
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生物化学PowerPointPresentation
•Km是酶学研究中一个常数，有重要意义： •1．当反应速度为最大速度一半时，米氏方程式可以变换如下：
• 酶活性中心内的必需基团可分为两种：一 是结合基团，其作用是与底物相结合，使底物 与酶的一定构象形成复合物；另一是催化基团， 其作用是影响底物中某些化学键的稳定性，促 进底物转变成产物，有些必需基团同时具有这 两方面的功能。
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生物化学PowerPointPresentation
•二、酶原及酶原激活
生物化学PowerPointPresentati
on
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2020/11/30
生物化学PowerPointPresentation
•第五章 酶 化 学
•主要内容：
• 主要介绍酶的化学本质、结构和特性； 酶的作用动力学；酶的作用机理；酶的应 用；还介绍了别构酶、共价调节酶、同工 酶等的概念、性质、生物学意义。
生物化学实验技术PPT课件
特定DNA片段
农业生物学实验教学中心
耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80 活 性 60
40
20
40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。
PCR反应循环
Taq
P2
Mg2+
2021/3/12
P1
dATP dCTP
dTTP
dGTP
农业生物学实验教学中心
PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA
结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
5’ 3’
SG SG SG
Emission
3’ 5’
SG
农业生物学实验教学中心
梯度PCR仪
实时荧光定量PCR仪
普通PCR仪
2021/3/12
农业生物学实验教学中心
一、实验目的
PCR示例
学习PCR分析的原理与技术。
2021/3/12
农业生物学实验教学中心
二、实验材料、仪器和试剂
1、材料：含1Kb插入片段的克隆载体
基因组DNA结构功能的研究
农业生物学实验教学中心
低浓度引物
高浓度引物
2)反向PCR (reverse PCR)
用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段， 对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
未知序列
已知序列
生物化学实验课件ppt课件
（8）最后一组实验人员，离开实验室时，检查水、电、门、 窗是否关闭，以保证实验室安全。
（9）如有突发事件（起火、试剂腐蚀伤人）发生，不要惊 慌失措，应妥善处置（使用灭火机、关闭电源等）。
实验一 糖类的性质实验
ppt课件
9
糖类的重要鉴别方法是 Ｍｏｌｉｓｈ反应和Ｓｅｌｉ ｗａｎｏｆｆ反应。糖类、苷类及其他含糖物质与α 萘酚和 浓硫酸呈紫红色的环的反应称为 Ｍｏｌｉｓｈ反应，该反应 可用于糖类和非糖物质的鉴别。酮糖糖加入间苯二酚和６ｍ ｏｌ／Ｌ盐酸能产生红色的反应称为Ｓｅｌｉｗａｎｏｆｆ 反应，该反应可用于酮糖和醛糖的鉴别。如己酮糖加入间苯 二酚和浓盐酸，加热后迅速产生红色，而同样条件下己醛糖 的反应速度要慢得多。
ppt课件
17
四、实验步骤
1、α-萘酚反应
1%葡萄溶液
观
1%果糖溶液 各加1ml
★各加2滴
★各加1ml
察
5
记
1%蔗糖溶液
支
莫氏试剂 混
浓硫酸
录
试
各
1%淀粉溶液
管
匀
管
0.1%糠醛溶液
颜 色
ppt课件
18
Molisch反应（-萘酚反应）
界面：显色------鉴定：所有的糖类均可显色
浓H2SO4
糖 α -萘酚+酒精
ppt课件
11
一、实验目的：
1、了解糖类某些颜色反应的原理； 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法； 3、学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及
其原理。
ppt课件
12
二、实验原理
(一)颜色反应
1. α-萘酚反应
糖在浓无机酸（硫酸或盐酸）作用下，脱水生
（9）如有突发事件（起火、试剂腐蚀伤人）发生，不要惊 慌失措，应妥善处置（使用灭火机、关闭电源等）。
实验一 糖类的性质实验
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9
糖类的重要鉴别方法是 Ｍｏｌｉｓｈ反应和Ｓｅｌｉ ｗａｎｏｆｆ反应。糖类、苷类及其他含糖物质与α 萘酚和 浓硫酸呈紫红色的环的反应称为 Ｍｏｌｉｓｈ反应，该反应 可用于糖类和非糖物质的鉴别。酮糖糖加入间苯二酚和６ｍ ｏｌ／Ｌ盐酸能产生红色的反应称为Ｓｅｌｉｗａｎｏｆｆ 反应，该反应可用于酮糖和醛糖的鉴别。如己酮糖加入间苯 二酚和浓盐酸，加热后迅速产生红色，而同样条件下己醛糖 的反应速度要慢得多。
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四、实验步骤
1、α-萘酚反应
1%葡萄溶液
观
1%果糖溶液 各加1ml
★各加2滴
★各加1ml
察
5
记
1%蔗糖溶液
支
莫氏试剂 混
浓硫酸
录
试
各
1%淀粉溶液
管
匀
管
0.1%糠醛溶液
颜 色
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Molisch反应（-萘酚反应）
界面：显色------鉴定：所有的糖类均可显色
浓H2SO4
糖 α -萘酚+酒精
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11
一、实验目的：
1、了解糖类某些颜色反应的原理； 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法； 3、学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及
其原理。
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二、实验原理
(一)颜色反应
1. α-萘酚反应
糖在浓无机酸（硫酸或盐酸）作用下，脱水生
《生物化学技术实验》PPT课件
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33
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34
■ 亲和层析作用机理：
(1) X
B A
Sample
(2)
Washing
A
B
配体
X
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(3)
Elution
A
B
35
亲和吸附剂的制备
• 分离纯化一定数量的游离配体 • 载体活化 • 配体与载体偶联
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36
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37
■ 亲和层析图谱：
酯键＞酰胺键＞肽键
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49
胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶) 和弹性蛋白酶三种酶在理化性质和结构 上均十分接近，利用一般常用的提取分 离方法，很难将它们之间彼此彻底分开 。为了获得高纯度的胰蛋白酶制品，采 用亲和层折技术进一步纯化后，可达到 十分满意的效果。
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50
胰蛋白酶的天然抑制剂 -------鸡卵类粘蛋白(CHOM)
生物化学技术实验部分
(2010版)
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1
生物化学研究的核心任务： 阐明生命现象的分子机理。
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2
生物大分子物质制备的基本过程：
• 确定测定方法 • 材料的选择与处理 • 抽提 • 浓缩 • 纯化 • 有效成分纯度和性质的分析
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3
蛋白质的制备：
前处理
浓缩、粗分离
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59
胰蛋白酶的BAEE单位定义为： 在下列实验条件下，引起每分钟光吸收值 A253nm增加0.001的酶量。 • 底物（BAEE）浓度为1mmol/L • 反应液为0.05mol/L Tris-HCl,pH7.6 • 光程1cm • 反应温度25℃ • 波长253nm • OD值递增0.001/min
生物化学实验技术-PowerPointPresenta
（3）收集：
加样同时可进行收集，每管收集1ml。 收集12 管后加紧螺旋夹。回收凝胶 和尼龙布等。
⑷ 检测：准备反应板两块。将12管收集液 各取1 滴分别放入反应板的12个凹孔。一 块板的各孔内加纳氏试剂1滴，有NH4+ 者呈黄色至橙色。可用＋、－号表示有无 呈色或颜色深浅。再向另一块板的各孔内 加双缩脲试剂1滴，有蛋白者呈蓝紫色。
凝胶面以下； 5．实验后将凝胶中盐洗脱干净后回收再利用。
【思考题】
1.装柱不均匀，凝胶面不平整对实验结果 有什么影响？
2. 盐析与变性的异同？ 3．凝胶层析的原理？
（二） 血清γ-蛋白的鉴定 —— 醋酸纤维素薄膜电泳
【实验目的】
1. 掌握电泳的基本原理； 2. 熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的方法和
应用。
【注意事项】
• 1．本实验所用各种玻璃仪器必须洗净烤干后备用。 • 2．各种试剂的加入量要准确。 • 3．严格掌握加入酶液后的保温时间，否则会影响其
产物量的准确度
【思考题】
• 1．为何可以酶活性单位代表酶促反应速度？ • 2．酶促反应的影响因素有哪些？ • 3．何为Km值？如何测定一个酶的Km值？
deaedeae掌握deae纤维素离子交换层析法的基本原掌握其实际操作过程包括装柱洗脱测定等步骤熟悉deae纤维素离子交换剂的结构及特点仪器与材料试管烧杯玻璃搅棒层析柱梯度洗脱仪等药品deae纤维素22纤维素de2205mollhcl05mollnaohdeae22纤维素处理检测deaedeae2222先用40ml05mollhcl浸泡30分钟加蒸馏水60ml反复洗涤使上层液体没有细的混悬物然后倒入有100目尼龙滑布的漏斗中用蒸馏水充分洗涤直到流出液的ph4止再用40ml05mollnaoh浸泡30分钟倾弃上清液加蒸馏水100m1搅拌后倒入有细尼龙布的漏斗中用蒸馏水充分洗涤直到流出液的ph8时滤去水分100m1浸泡并搅动放置5分钟倾去上层液体必要时再重复操作直到溶液ph8止用螺旋夹扭紧层析柱下端胶管把层析柱夹在铁支架上柱中加数毫升001mna液然后打开出口排出气泡待柱中液体只剩下约1cm高时关闭出口将处理好的deae纤维素混悬液用吸管连续移入层析柱内拧松下口的螺旋夹使液体滴下全加到柱内后待液面接近纤维素顶上界面时把出口螺旋拧紧将梯度发生器两筒间及出口胶管的螺旋夹都拧紧向有出口侧的筒内加入001mna液40m1另一筒内加05mna液40m1把此梯度发生器放到磁力搅拌器上搅拌子放在出口侧的盛液筒中使梯度发生器出口细胶管内充满掖体排出气泡
生物化学实验基本技能 ppt课件
体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。 • 测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误后
方可倒掉。
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28
实验一
病原菌多基因调控机制研究
酪蛋白等电点测定 （P62）
PPT课件
29
实验目的
• 通过实验进一步了解蛋白质的理化性质 • 理解等电点的意义及蛋白质在等电点时的性质 • 熟悉蛋白质等电点测定的操作方法
PPT课件
30
实验原理
• 蛋白质是两性电解质，分子中含有的氨基和羧基均可 电离。当溶液中的pH值大于等电点时，其氨基电离被 抑制而羧基电离，蛋白质成带负电荷的阴离子。反之 ，当溶液pH小于蛋白质等电点时，其羧基电离受到抑 制而氨基接受质子，蛋白质成为带正电荷的阳离子。 当溶液pH值达到某一值时，蛋白质分子成为所带的正 、负电荷数相等的兼性离子，此时溶液的pH值就是该 蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质的粘度和溶解 度均大幅降低。
PPT课件
4
• 5、注意节约药品、试剂；洗涤和使用仪器 时要小心仔细，防止损伤仪器及造成自身 伤害；发现仪器故障应立即报告老师，不 可擅自动手检修。
• 6、严禁在实验室吸烟、喝水、吃东西。
• 7、每次实验课结束，由班长负责安排值日 生，负责打扫实验室卫生。
PPT课件
5
二、生物化学实验的基本操作
• （一）常用玻璃器皿的洗涤
PPT课件
31
本实验观察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解状态以测
定其等电点。以醋酸和酪蛋白溶液中的醋酸钠构成各种不
同pH值的缓冲液，在某种溶液中，酪蛋白溶解度最小时，
该溶液的pH值就是酪蛋白的PP等T课件电点。
32
（三）实验材料
• 器材：200和1000μL可调移液枪、试管、试管架、 刻度吸管等
方可倒掉。
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实验一
病原菌多基因调控机制研究
酪蛋白等电点测定 （P62）
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实验目的
• 通过实验进一步了解蛋白质的理化性质 • 理解等电点的意义及蛋白质在等电点时的性质 • 熟悉蛋白质等电点测定的操作方法
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实验原理
• 蛋白质是两性电解质，分子中含有的氨基和羧基均可 电离。当溶液中的pH值大于等电点时，其氨基电离被 抑制而羧基电离，蛋白质成带负电荷的阴离子。反之 ，当溶液pH小于蛋白质等电点时，其羧基电离受到抑 制而氨基接受质子，蛋白质成为带正电荷的阳离子。 当溶液pH值达到某一值时，蛋白质分子成为所带的正 、负电荷数相等的兼性离子，此时溶液的pH值就是该 蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质的粘度和溶解 度均大幅降低。
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4
• 5、注意节约药品、试剂；洗涤和使用仪器 时要小心仔细，防止损伤仪器及造成自身 伤害；发现仪器故障应立即报告老师，不 可擅自动手检修。
• 6、严禁在实验室吸烟、喝水、吃东西。
• 7、每次实验课结束，由班长负责安排值日 生，负责打扫实验室卫生。
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5
二、生物化学实验的基本操作
• （一）常用玻璃器皿的洗涤
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本实验观察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解状态以测
定其等电点。以醋酸和酪蛋白溶液中的醋酸钠构成各种不
同pH值的缓冲液，在某种溶液中，酪蛋白溶解度最小时，
该溶液的pH值就是酪蛋白的PP等T课件电点。
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（三）实验材料
• 器材：200和1000μL可调移液枪、试管、试管架、 刻度吸管等
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样品管
—— 0.1 —— 5.0
空白管
—— —— 0.1 5.0
• 各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用 540nm比色，以空白管调零点，读取各管光 密度值。
【注意事项】
• 1．正确使用微量加样器。 • 2．取液要准确。 • 3. 做好标记，不要将试管号弄混。
【思考题】
• 1．分光光度计的使用及计算原理。
【方法步骤】
• 1．取干净试管8支，按下表正确操作：
试剂 1
2345678
0.02M 基质液
0.1
蒸馏水 1.3
碳酸盐
缓冲液 1.5
0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.2 1.1 1.0 0.8 0.6 1.4 1.4 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 混匀置37℃水浴保温5分钟
• 3．标本测定：用生理盐水将待测蛋白质样品稀释 成大约1mg/ml溶液。取1.0ml样加生理盐水3.0ml混 匀，按上述方法测其吸光度。
【结果与分析】
• 1．根据标准曲线查出蛋白质浓度。
• 2．也可利用经验公式计算蛋白质含量；适 当稀释蛋白质溶液测其A280nm和A260nm 处吸光度，再用经验公式直接计算蛋白质 浓度。
钼蓝 通过测定钼蓝颜色的深浅计算葡萄糖的含量！
【实验操作】
1．动物准备 取正常家兔两只，实验前预先饥饿，称体重
（一般为2～3kg）。 2．取血
以耳缘静脉取血，先去毛，用二甲苯擦拭兔耳， 使其血管充血，再用干棉球擦干，用粗针头刺 破静脉放血，将血液收入抗凝管中（按10：1 的比例将防凝剂放入试管，边收集（量约3ml） 边摇匀，以防凝固。 用干棉球压迫血管止血。
【实验原理 】
1.体内血糖水平主要依靠激素的调节
主要ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ节 激素
降低血糖：胰岛素
升高血糖：胰高血糖素(glucagon)、 糖皮质激素、肾上腺素
胰岛素(insulin)： 体内唯一降低血糖水平的激素
肾上腺素：主要在应激状态下发挥调节作用。
本实验采用吴宪氏法测定血糖， 要求将血液制成无蛋白血滤液：???
实验一
双缩脲法测定蛋白质含量
【目的要求】 • 掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理。
• 【实验器材】
• 中试管3支，1毫升刻度吸管3支，10毫升刻 度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计
【方法步骤】
• 取中试管3支，按下表操作。
试剂（ml） 标准管
蛋白质标准 待测液 蒸馏水 双缩脲试剂
0.1 —— —— 5.0
3.检测分离效果
（1）纳氏试剂：盐存在时，NH4+ 与其反应呈现黄色或橙色。
（2）双缩尿试剂检测：蛋白质与 其呈现红色或紫红色。
【实验操作】
1．盐析 ⑴ 血清2ml放入离心管中，加入PBS2ml混 匀逐滴加入饱和硫酸铵溶液4ml，边加边 摇匀。静置10分钟后，离心3000 rpm 10 分钟，倾上清液（上清中主要含清蛋 白）。
3．注射激素后取血
(1)取饿兔血后，其中一只兔腹部皮下注射胰岛 素，剂量按0.75u/kg体重计算，并记录注射时 间。一小时后再取血。取血后立即腹腔或皮下 注射25%葡萄糖液10ml，以免家兔发生胰岛素性 休克而死亡。 (2)另一只兔腹部皮下注射肾上腺素，剂量按 0.4mg/kg体重计算，并记录注射时间。半小时 后再取血。
生物化学实验技术
生物化学实验技术
• 实 验一、 双缩脲法测定蛋白质含量 • 实 验二 、紫外分光光度法测定蛋白质含量 • 实 验三 、血清γ-球蛋白的分离与纯化 • 实 验四、碱性磷酸酶Km值测定 • 实 验五、胰岛素和肾上腺素对血糖含量的影响 • 实 验六、 血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析 • 实 验七、 SGPT活性测定 • 实 验八、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶 • 实 验九 、RNA的分离与鉴定 • 实 验十 、DEAE 纤维素离子交换层析法分离蛋白质 • 实 验十一、 质粒的提取与鉴定
【实验目的】
1． 掌握蛋白质分离纯化的主要方法 和原理；
2．熟悉盐析和层析的基本操作； 3． 掌握离心机的正确使用方法。
【仪器试剂】
试管、刻度吸管、吸耳球、胶头滴管、 层析柱、反应板；血清、PBS液、葡 聚糖凝胶G-25、纳氏试剂、饱和硫酸 铵溶液。
【实验原理 】 1.盐析 ：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。
【注意事项】
• 1．本实验所用各种玻璃仪器必须洗净烤干后备用。 • 2．各种试剂的加入量要准确。 • 3．严格掌握加入酶液后的保温时间，否则会影响其
产物量的准确度
【思考题】
• 1．为何可以酶活性单位代表酶促反应速度？ • 2．酶促反应的影响因素有哪些？ • 3．何为Km值？如何测定一个酶的Km值？
2.无蛋白血滤液的制备原理
COOH
2R
+ H2WO4
NH2
COOH
R
WO4
NH2 2
此方法是生物碱沉淀蛋白质
沉淀蛋白质 的方法还有
哪些？
3.利用吴宪氏法测定血糖的原理
G + Cu2+ OH-
△
Cu2O
+糖氧化物
3Cu2O +3H3PO4.2MO3.12H2O
6CuO +
3H3PO4.2MO2O3.12H2O
2.本实验分离全血清中各种蛋白质成分，同 时鉴定上次实验提纯结果。
点样 γ β α2 α1 清蛋白
♁
♁
Γ球蛋白
【实验操作】
1. 准备与点样：用巴比妥缓冲液将醋酸纤维素 薄膜充分浸透，在毛面距一端1.5厘米处点样， 即上述实验得到的γ-蛋白，另取薄膜一点全 血清。
2. 电泳：点样面朝下，点样端靠近负极，电压 110V，通电40-45min；
实 验二
紫外分光光度法测定蛋白质含量
【目的要求】 • ①了解分光光度法的基本原理； • ②能较熟练使用紫外分光光度计。
• 【实验器材】 • 1．紫外分光光度计。 • 2．微量加样器。 • 3．蛋白标准液（1mg/ml）。
【方法步骤】
• 1．标准蛋白质溶液：任选一种蛋白质溶液，经凯氏 定氮法测定蛋白质的含量后，用生理盐水稀释成浓 度为1mg/ml的蛋白质溶液。
【仪器试剂】
电泳仪、点样器、镊子、醋酸纤维素 薄膜；巴比妥缓冲液、染色液、漂洗 掖。
【实验原理 】
1.蛋白质是两性电解质，在同一个PH 环境下，混合蛋白质中各种成分带电量 不同、分子大小不同，在同一电场中泳 动的速度不同，导致相同的时间迁移的 距离不同而把它们分开。
（1）分子越小，泳动速度越快
（2）带电量越多，泳动速度越快 反之，越慢。
• 2．计算各管[S]。 [S]＝加入[S]量/3.0×0.02
• 3．进一步计算出各管1/V和1/[S]。 • 4．将上述数据填入下表
数值 1号 2号 3号 4号 5号 6号
光密 度值 V 1/V [S] 1/[S]
以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标，画出各管的坐标点，并将其 连成直线，此直线与横轴的相交点为-1/Km，由此可计算出该 酶的Km。
⑵ 将离心管中的沉淀用1 ml PBS搅拌溶解，再 逐滴加入饱和硫酸铵溶液0.5ml，边加边摇匀。 静置10分钟后，离心3 000 rpm 10分钟 （注意离心机使用时需要配平并且离心时将盖 子盖好）。倾上清液（上清中主要含α、β球 蛋白），沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白。
2.脱盐：
⑴ 装柱：将制好的葡
酚标准
0.1
液
酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
0.1
充分混匀置37℃水浴准确保温15分钟
0.5％铁 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
氰化钾
• 充分混匀后置室温10min，510nm波长下进行 比色，以第8管做空白，测定各管的光密度。
【结果与分析】
• 1．计算各管酶活性单位。 D测/D标×0.01
沉淀蛋白质 的方法还有
哪些？
（2）盐析的影响因素
蛋白质的浓度 、盐浓度、 pH 值、温度等。
本实验球蛋白在半饱和硫酸铵溶液 中沉淀而清蛋白溶解，γ-球蛋白在 33%浓度的硫酸铵溶液中沉淀。
2.层析：
待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相） 时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及 亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配， 并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。
• 如Lowry-Kalckar公式：蛋白质浓度 （mg/ml）＝1.45A280－0.74A260。
【注意事项】
• 1．加量要准确。 • 2．比色皿的正确应用。 • 3．结果重复3次，取平均值。
【思考题】
• 1．为何要同时测定蛋白280nm和 260nm处的光吸收值？
实验三
（一） 血清γ-球蛋白的分离 与纯化
3．染色：2-5 min； 4. 脱色：直至背景漂净为止。
【实验结果】
根据电泳区带出现的位置和条数判 断是何种血清蛋白，如果只是一条 γ-蛋白说明上个实验分离纯化的较 好。
【实验注意事项】
1．不要用手触摸纤维素膜； 2．注意区分醋酸纤维素薄膜的光面和毛
面； 3．点样位置要在1.5厘米以内，不要距边缘
（3）收集：
加样同时可进行收集，每管收集1ml。 收集12 管后加紧螺旋夹。回收凝胶 和尼龙布等。
⑷ 检测：准备反应板两块。将12管收集液 各取1 滴分别放入反应板的12个凹孔。一 块板的各孔内加纳氏试剂1滴，有NH4+ 者呈黄色至橙色。可用＋、－号表示有无 呈色或颜色深浅。再向另一块板的各孔内 加双缩脲试剂1滴，有蛋白者呈蓝紫色。
【实验结果】
可用＋、－号表示有无呈色或颜色深 浅。将双色脲反应呈色最深的一管收 集液保留供下次实验使用。利用醋酸 纤维素薄膜电泳检测本次实验所提γ球蛋白的纯度。