流式细胞仪结果分析
sybergreen流式细胞结果解读
Sybergreen流式细胞仪是一种用于检测细胞遗传学和细胞分化的先进工具，其结果解读需要结合实验的具体情况以及相关知识和技能。
首先，Sybergreen流式细胞仪主要用于检测细胞内Syber Green I染料标记的DNA的荧光强度，从而确定细胞的DNA倍体和细胞类型。
在正常的情况下，二倍体细胞和单倍体细胞的荧光强度会有明显的差异，而异常倍体细胞的荧光强度可能会下降。
因此，Sybergreen流式细胞仪结果通常会显示不同倍体细胞的荧光强度分布图。
其次，对于结果的分析，需要注意以下几点：
1. 阳性细胞数量：观察荧光强度分布图中的阳性细胞数量，如果数量较多，则说明该指标在某些细胞中存在异常。
2. 倍体类型：观察荧光强度分布图中的各倍体类型的比例，如果某一种异常倍体细胞的荧光强度明显高于其他倍体类型，则说明该异常倍体细胞的数量较多。
3. 阳性细胞的形态：在观察异常细胞时，需要注意阳性细胞的形态是否与正常细胞存在差异。
异常细胞的数量增多时，需要观察是否有一些特殊形态的细胞出现。
在具体的应用中，Sybergreen流式细胞仪可以用于检测肿瘤细胞的DNA倍体和增殖活性，从而判断肿瘤的恶性程度、患者的预后以及治疗效果等。
同时，该仪器还可以用于干细胞研究、组织分化研究等领域。
但是需要注意的是，在解读Sybergreen流式细胞仪结果时，需要结合患者的临床资料、病理诊断、免疫组化染色以及其他检测结果等进行综合分析。
综上所述，解读Sybergreen流式细胞仪结果需要具备一定的细胞遗传学和流式细胞仪方面的知识，并结合患者的具体情况进行分析。
只有在充分理解实验数据的基础上，才能准确地评估病情、制定治疗方案和评估治疗效果。
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞术分析PMA诱导THP1分化为巨噬细胞的表型特征
流式细胞术分析PMA诱导THP1分化为巨噬细胞的表型特征一、本文概述流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速分析单个细胞的多参数特性的强大技术。
该技术通过标记特异性抗体与细胞表面或内部抗原的结合，结合流式细胞仪的高通量分析能力，使我们能够精确测量细胞群体的表型特征。
在生物医学研究中，流式细胞术广泛应用于细胞分化、细胞周期、细胞凋亡、信号转导等多个领域。
本文旨在利用流式细胞术分析佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）诱导人急性单核细胞白血病细胞系THP-1分化为巨噬细胞的表型特征。
我们将通过流式细胞术检测分化过程中细胞表面标志物的表达变化，如CDCD68等，以及细胞内分子如肿瘤坏死因子TNF-α、白介素IL-1β等的表达情况，从而全面揭示PMA诱导THP-1细胞向巨噬细胞分化的分子机制。
通过本文的研究，我们期望能够为深入理解巨噬细胞分化过程中的分子事件提供新的视角，并为开发针对巨噬细胞相关疾病的治疗策略提供理论依据。
本文还将探讨流式细胞术在细胞分化研究中的应用价值，以期为生物医学领域的研究人员提供有益的参考。
二、材料与方法1 细胞系：人单核细胞系THP-1，购自美国ATCC（American Type Culture Collection）。
2 试剂：佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA），购自Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素双抗，购自Gibco公司；流式细胞术抗体，包括但不限于CDCDHLA-DR等，购自BD Biosciences或eBioscience公司。
3 仪器：流式细胞仪（如FACS Canto II，BD Biosciences）；二氧化碳培养箱；离心机；倒置显微镜。
1 细胞培养：THP-1细胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗的RPMI 1640培养基中，于37℃、5% CO2的条件下培养。
流式细胞仪数据分析
流式细胞仪数据分析5.1 数据采集及显示光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机可以储存处理的数字信号。
流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会〞制定。
根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。
4参数〔FSC，SSC，FITC和PE〕的单细胞分析会生成8位数据。
当单个样品累计搜集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB。
数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。
单参数如FSC或FITC〔FL1〕可使用直方图，横轴表示荧光通道。
纵轴表示在该通道内搜集到的细胞数量〔如图5-1〕。
处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有一样的信号密度。
通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。
图5-1 流式数据分析图双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1〔FL1〕，Y轴显示通道2〔FL2〕。
3维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量〔如图5-1〕。
习题：数据采集及显示1 在直方图中横轴和纵轴分别表示。
2 二维点图用于显示参数。
3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表。
5.2 设门通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。
如：血样本是混合细胞群，假如想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。
图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图习题：设门1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。
〔对错〕5.3 细胞亚群的数据分析数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。
如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。
如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。
图5-3 选定淋巴细胞亚群设门门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。
流式细胞分析技术
ü 光电倍增管（PMT）：
检测散射光和荧光；同时将光学信号转换成 电脉 冲信号。
14
滤光片
分色反光镜
15
PMT 滤光片
荧光和散射光检 测系统
分色反光镜
激发光
激光聚光系统
16
数据处理系统
• 计算机及其软件组成 • 进行实验数据的分析、存储、显示
Photons/Detector (V)
光信号转化为电脉冲信号
特点：单细胞、快速、高通量、多参数、准确、灵敏
经典流式细胞仪（分析型和分选型） 量化成像分析流式细胞仪 质谱流式细胞仪
单激发光；4个 荧光检测通道
经典流式细胞仪
双激发光；6个 荧光检测通道
Coulter EPICS XL
6
量化成像分析流式细胞仪
美国merck millipore公司
质谱流式细胞仪
11
经典流式细胞仪
液流系统-液流聚焦原理
喷 嘴
鞘液(Sheath）
喷嘴
荧光信号或 侧向散射光
样本流
前向散射光 单个细胞流
12
液流系统形成单 个细胞流示意图
13
光路系统
ü 激发光：
常用的是空冷式的氩离子激光光源（488nm）；氦氖 激光光源（633nm)；紫外光源
ü 各种光学镜片：
分色反光镜 光束成形器；透镜 滤光片：长通滤片；短通滤片；带通滤片
(一）标本采集、运输、保存和操作 l标本来源
l几乎所有组织细胞均可用于FCM检测 l免疫标本主要来源于外周血、骨髓、 淋巴器官或组织等
l抗凝剂选择
l肝素钠(首选) lEDTA-Na2
l标本保存
标本制备
ü 外周血或骨髓样本
不同流式细胞分析仪检测淋巴细胞亚群的比较研究重点
ｏｆ ＭｅｄｉｃｉＭ，Ｓｈａｎｇｈａｉ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏ凡ｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｓｈｅｎ Ｌｉｓｏｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｆｉｓｏｎｇｓｈｅｎ＠ｈｏｔｍａｉＬ ｃｏｍ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｃｙ ａｍｏｎｇ ３ ｂｒａｎｄｓ ｏｆ ｆｌｏｗ ｅｙｔｏｍｅｔｅｒｓ （ＢｒｉＣｙｔｅ Ｅ６，ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏⅡａｎｄ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ ５００）ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｕｂｓｅｔｓ． Ｍｅｔｈｏｔｉｓ Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ ＢｒｉＣｙｔｅ Ｅ６ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ２ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ ｃｏｍｍｏｎｌｙ
ｗａｓ
ｎｏ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｅｅ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ３ ｆｌｏｗ ｃ”ｏｍｅｔｅｒｓ（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ
ａｒｅ
４．２４２。３．９１６．０．８５２．
２．５９５，１．８３５ ａｎｄ ０．５７８，Ｐ＝０．１１９ ９，０．１４１ ２，０．６５３ ２，０．２７３ ３，０．３９９ ６，０．７４９ ０．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｅ６ ｍａｙ ｂｅ
Ｍｅ４ ２０１６，３９：３６１－３６５）
Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ；Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｕｂｓｅｔｓ；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｆｕｎｄ ｐｒｏｇｒａｍ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（８１３０１７８８）
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
２、０．０２７、０．０００ ４、
流式细胞仪结果分析
双 参 数 散 点 图 分 析
散点图
等高线图
密度图
FCM的主要测定指标：FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)
FCM标记方法
单标：一种单抗/tube--FL1, FSC, SSC（三参数）
双标：两种单抗/tube--FL1, FL2, FSC, SSC（四参数）
三/四标：三种单抗/tube、四种单抗/tube--FL1-FL3/4, FSC, SSC
……
1. 上机检测
单色/双色/多色样本 参数调节
电压、阈值、设门、补偿
2. 细胞分选 3. 细胞表面和胞内标志检测 4. 细胞周期(PI单染) 5. 细胞凋亡（Annexin V与PI双染）
举例：FACS Calibur可检测FL1-4四个通道的4个颜色
检测器组 所需探测器 （激光器） （PMT）位置
流式细胞仪分析细胞周期
依据细胞DNA含量（横坐标）： G1期：DNA复制还没开始，
也 是 DNA 含 量 最 少 的 ， 即 流 式 检测结果图的第一个峰；
S期：DNA开始复制，到完 成 复 制 ， 是 一 个 一 倍 DNA 到 二 倍 DNA 的 过 程 ， 在 流 式 结 果 图
中显示期跨度特别大（第二个 不高但很宽的峰）；
“设门”就是确定阳性细胞群，去除散点部分。
指在细胞分布图中，根据该图的细胞群分布选定其中
想要分析的特定细胞群（细胞基本来自于同一状态，有数据显示
1. 直方图（Histogram）
可比较性）。通过“设门”得到不同的区域，从而对 其中的细胞进行单参数或多参数分析。
设门是流式细胞仪分析中的一种重要技术，只有
颗粒杂质、气泡 对检测的影响
细胞功能的流式细胞仪检测
细胞功能的流式细胞仪检测细胞功能检查在近几年来由于流式细胞仪技术的开展有了很大的提高，不同于其它技术，最大的一点在于流式细胞仪能快速、定量地检测，分析单个不同细胞的功能，并且获得大量同一细胞或不同细胞总体的状况，也就是说常规的一些标本检测即可满足多人份的不同细胞群体的检查结果。
本章节主要涉及的是吞噬细胞（包括巨噬细胞和多形核细胞）。
影响吞噬细胞的数量和功能的因素很多，其中包括各种药物作用，例如皮质类固醇药物常常引起循环血液中白细胞数量的升高，其机理是主要促进骨髓中的白细胞释放，同时降低白细胞粘附血管内皮的能力至减少了白细胞的血管外移，还有轻℃提高了白细胞在循环血液中的半衰期。
正常情况下，中性粒细胞在骨髓中需5-7天后释放至循环血液中，其半衰期仅为7h，当趋向和进入各种组织中，在1至2天内发挥其生理功能，最终不管其功能状况如何（静止或激活），主要经过巨噬细胞的吞噬和粘膜表面的降解来完成。
由于中性粒细胞在人体中数量大、半衰期短，在微环境中稍微有变化，即会产生一些复杂的生理作用。
本节目的是介绍用流式细胞仪检测及阐述中性粒细胞和巨噬细胞的功能。
吞噬功能一般来说，吞噬过程大致分为几步：首先是识别，然后相互间接触、结合，最后才是内吞与消化。
其中关键的一步在于它们之间的正常接触。
当机体调理作用的紊乱和吞噬细胞的分解作用的缺陷，常引起吞噬的异常现象。
介导吞噬的细胞表面受体主要是C3b(CR)和FcR 受体。
Bassoe和 Berbnes运用流式细胞法很好地分析了细菌吞噬现象，指出流式细胞仪测定的两大优点：1. 要求的细胞数量相对较少；2. 白细胞分离步骤不多。
因此它特别适用于儿童等低年龄患者。
其检测原理是利用吞噬细胞内吞标记了FITC的细菌，并且保持吞噬细胞细胞膜的完整性，使后加入的EB染料只能结合未被吞噬的细菌，这样通过流式细胞仪可以区分已吞噬细菌和末吞噬细菌的吞噬细胞等情况。
应用流式细胞仪检测吞噬功能的方案很多，依据被用来内吞的微粒不同而言。
流式细胞仪结果分析
流式细胞仪结果分析一、获取数据在进行流式细胞仪结果分析之前，首先需要获取实验数据。
流式细胞仪会输出每个样本细胞的荧光强度、散射性质等参数。
这些参数可以代表细胞的表型特征或者亚细胞结构。
根据实验的需要，可以选择一种或多种指标进行数据分析。
二、数据清洗和预处理由于实验过程中可能会受到一些随机因素的干扰，比如机器灵敏度、噪声等，得到的数据可能存在一些异常值。
因此，在进行数据分析之前，首先需要对数据进行清洗和预处理，以减少这些异常值的干扰。
数据清洗可以通过以下几种方法进行：1.去除非细胞事件：流式细胞仪在采集数据时可能会采集到一些非细胞事件，比如细胞碎片、空白颗粒等，可以通过设置或者后续数据处理来去除这些非细胞事件。
2.去除离群值：根据实验的需要和数据的分布情况，可以使用统计学方法或者软件工具来判断和去除离群值。
3.数据归一化：如果实验中使用了多个荧光探针，不同探针之间的信号强度可能有差异。
可以通过归一化处理来消除这种差异，以确保数据的可比性。
三、统计分析数据清洗和预处理之后，可以进行统计分析来描述和解析数据。
流式细胞仪的数据通常是多维的，可以使用多种统计分析方法来从不同角度揭示数据的特点和规律。
1.基本统计分析：包括均值、标准差、中位数等指标，可以帮助了解数据的集中趋势和离散程度。
2.相关性分析：通过计算各个参数之间的相关系数，可以研究不同指标之间的关系。
例如，可以使用皮尔逊相关系数来衡量两个参数之间的线性相关性。
3.差异分析：比较不同样本或不同组的数据之间的差异。
常用的差异分析方法有t检验、方差分析等。
四、数据可视化为了更好地理解和传达数据的结果，可以使用数据可视化技术将数据以图表、图像等形式展示出来。
常用的数据可视化方法包括散点图、条形图、箱线图等。
通过数据可视化，可以帮助研究者直观地观察数据的分布情况、群体几何形状和特征变化趋势等。
五、结果解读在进行流式细胞仪结果分析时，需要根据实验目的和样本特性进行结果的解读。
流式细胞仪结果分析
CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例
六、自身免疫病相关HLA抗原分析
HLA-B27可出现在58%～97%的强直 性脊椎炎 As 患者
七、移植免疫中的应用
FCM作为一个强大的技术平台,已应用于多个领 域,其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛， 目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞 术的交叉配型 Flow cytometry cross-matching, FCXM 和群体反应性抗体 Panel reactive antibody, PRA 检测，
样本来源：各种细胞 如外（ZHOU）血,骨 髓,实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞 ,微生 物,人工合成微球等， 检测大小：一般是0.5um～40um
流式细胞仪的组成
液流系统 光学系统 数据处理系统
分选系统
分析型流式细胞仪
分选型流式细胞仪
液1 液流流系统
流动室
流动室 Flow cell 是液流系统的核心部件,流动室是由石英 玻璃制成,单细胞悬液在流动室里被鞘液流包绕通过流动 室内一定孔径的孔,检测区在该孔的中心,细胞在此与激光 垂直相交，
荧光染料的特性
•激发波长 EXCITING •发射波长 EMISSION
荧光补偿
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选主 要是在对具有某种特征的细胞需进 一步培养和研究时进行的，
一 分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
微小的乳胶微球分别染成上百 种不同的荧光色 固相芯片是用 探针在芯片上的坐标位置给基 因的特异性编码；而液相芯片 则是用颜色来编码
流式细胞仪在造血干细胞生物学研究中的应用
2、基因功能研究：流式细胞术可以与基因敲除技术相结合，用于研究基因在 细胞生长和分化中的作用，这有助于深入了解基因的功能和调控机制。
3、疫苗研发：流式细胞术可以用于研究免疫细胞的活化和分化，这有助于疫 苗的研发和免疫学研究。
应用场景
1、细胞分类：流式细胞仪可通过检测细胞表面标志物或细胞内抗原物质，对 细胞进行分类和亚群分析，有助于揭示细胞在生理和病理状态下的功能和作用。
2、细胞计数：流式细胞仪可快速准确地测定细胞样品中的细胞数量和细胞浓 度，为生物学研究和临床诊断提供依据。
3、DNA/RNA提取：流式细胞仪在结合特异性抗体和其他标记物后，可从细胞 中提取 DNA或 RNA进行基因表达谱分析、突变检测等研究。
流式细胞仪在造血干细胞生物 学研究中的应用
01 引言
03 应用举例
目录
02 介绍流式细胞仪 04 参考内容
引言
造血干细胞是人体造血系统的基础，对于理解血液疾病的发病机制、寻找治疗 策略等方面具有重要意义。流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）是一种在细 胞水平上对生物样品进行高速分析的技术，能够在短时间内获取大量有关细胞 的信息。本次演示将探讨流式细胞仪在造血干细胞生物学研究中的应用，以期 为相关领域的深入研究提供参考。
参考内容
引言
流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测细胞特性的技 术。它通过将单个细胞与特异性抗体或其他标记物结合，将细胞的多种特性， 如细胞大小、内部结构、细胞表面标志等转化为光信号，再通过光电检测系统 和计算机数据处理系统进行数据分析和显示。流式细胞仪在生物学研究中具有 广泛的应用价值，为生命科学、医学和生物技术等领域提供了强有力的工具。
流式细胞分群不明显的原因
流式细胞分群不明显的原因全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：流式细胞分群是一种广泛应用的技术，用于对细胞进行快速准确的分类和鉴定。
在实际操作中，有时会遇到分群不明显的情况，这可能会给实验结果带来一定的误差。
那么，流式细胞分群不明显的原因是什么呢？本文将针对这一问题展开讨论。
流式细胞分群不明显的原因可能与实验条件有关。
在某些情况下，可能由于细胞浓度过高或过低，导致细胞在流式细胞仪中无法得到合适的分离和检测。
细胞的免疫原性和表面抗原也可能会影响分群结果，如果使用的抗体相关性不高或抗原表达量不稳定，可能会导致分群困难。
流式细胞分群不明显的原因还可能与仪器的性能和设置有关。
流式细胞仪是分析和分离细胞的重要设备，而其性能和设置直接影响分群结果的准确性。
如果仪器的光学系统不稳定或者通道设置不合理，可能会导致分群结果不明显。
仪器的校准和维护也非常重要，只有保持仪器的良好状态，才能保证分群结果的准确性。
流式细胞分群不明显的原因还可能与细胞样品的处理有关。
在进行流式细胞分群前，通常需要对样品进行预处理，如细胞计数、离心、染色等。
如果这些步骤操作不当或者处理时间过长，可能会导致细胞受到损伤或死亡，从而影响分群结果。
细胞的沉降速度和聚集性也可能会影响分群结果，如果细胞过于密集或聚集在一起，可能会导致分群不明显。
流式细胞分群不明显的原因还可能与操作者的经验和技术水平有关。
流式细胞技术是一项复杂的实验技术，需要操作者具备一定的实验技能和经验。
如果操作者对流式细胞仪的操作流程和原理不熟悉，可能会影响分群结果的准确性。
提高操作者的实验技术水平和经验是避免流式细胞分群不明显的关键。
流式细胞分群不明显可能由多种因素造成，包括实验条件、仪器性能、细胞样本处理和操作者技术水平等方面。
为了提高流式细胞分群结果的准确性，我们需要注意这些因素，并采取相应的措施，如优化实验条件、维护仪器、合理处理细胞样本等，从而确保分群结果的可靠性和准确性。
流式细胞周期结果图解读(仅供参照)
流式检测细胞周期操作步骤1. 细胞培养：取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。
2. 细胞固定：800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。
3. 细胞染色：1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。
4. 流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
注：上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团！流式细胞周期结果图解读1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；2、横坐标DNA Content：即DNA含量；3、G1、G2、S三期在图中已经标示；4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA 含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；以此类推…流式细胞周期结果图的意义，主要从细胞周期的角度看各参数的意义：1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。
1、细胞周期可分为四个阶段：①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡的影响因素
基本内容
、特异性和自动化程度，从而为细胞凋亡研究提供更加可靠的工具。
谢谢观看
解决方法：熟练掌握流式细胞仪数据分析的方法和技巧，理解细胞凋亡的生 物学过程。在数据分析中，应选择经验证的参数设置，并结合研究目的进行调整。 对于结果的解读，应结合凋亡相关文献和实验数据进行综合分析，避免主观偏见。
4、数据分析与解读
总结：使用PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡时，需要注意多个影响因素。这 些因素包括PI染料的浓度和作用时间、样本处理过程、流式细胞仪的操作和维护 以及数据分析与解读等。为了获得准确的实验结果，需要对这些因素进行严格的 控制和优化。
1、PI染料的浓度和作用时间
1、PI染料的浓度和作用时间
PI（Propidium Iodide）是一种常用的细胞凋亡染色剂，可以与DNA结合并 使其发出红色荧光。然而，PI的浓度和作用时间对实验结果有很大影响。如果PI 浓度过低，则不能有效地染色细胞；而如果浓度过高，则可能导致细胞膜通透性 改变，
基本内容
结果可以以图表形式展示，如散点图、柱状图和曲线图等，以便直观地反映 细胞凋亡状态。
基本内容
总之，流式细胞术在细胞凋亡检测中具有广泛的应用价值，可以提供快速、 准确和多参数的结果。随着生物学和医学研究的不断发展，流式细胞术在细胞凋 亡检测中的应用将不断完善和拓展。未来，随着技术的进步，流式细胞术有望实 现更高的灵敏度
第二部分：双脱氧核苷酸法
与DAPI、PMA-RPN和IBF-IP等其他几种方法相比，双脱氧核苷酸法在检测细 胞凋亡方面具有较高的灵敏度和特异性。然而，双脱氧核苷酸法操作较为繁琐， 且需要使用较多的双脱氧核苷酸，可能会增加实验成本。
第三部分：聚合酶链反应法
第三部分：聚合酶链反应法
DC凋亡的流式细胞术分析
１． Ｄ ．２ ３ Ｃ分离培 养 ： Ｐ ＭＣ以４×１９Ｌ细胞 密度接种 在 ６ Ｌ 中， 将 Ｂ ０／ 孑板 置于 ３ ℃ 、０ ｌ Ｃ ２ ７ ５ ｍ／ Ｏ 培养箱 中贴 壁培养 ６ 后 ， 除非 Ｌ ｈ 去 贴 壁细胞 ， 加入含 ２ｕ ／ Ｉ一 、０ ｇＬｈ Ｍ— Ｓ ｌ０ ／ 胎 牛血清 的Ｒ Ｍ １４ 培养液 ， 于培养箱 培养 ， ０ ｇＬｒ Ｌ ４ ５ｕ ／ｒＧ Ｃ Ｆ、Ｏ ｍｌ ｈ Ｌ Ｐ Ｉ６ ０ 置 两天半量换 液 ，
熟Ｄ ｃ数量有关 。对 于 Ｄ ］ Ｃ引起上述疾病 的发 病机制及 临床 治疗 研究正在 引起 越来越多 的关 注 。其 中对 于 Ｄ ｃ在体 内外生 长发育不 同阶段 的增殖 及凋亡更加重要 。诱 导 Ｄ Ｃ凋亡可能会在预 防移 植物抗宿主病及治 疗 自身免疫病等发 面取 得一定的
效果 。所 以对 于诱导 Ｄ Ｃ凋亡 的研究具有 非常重要 的意义 。为 了更好 的对 Ｄ 凋亡进 行研究 ， 文 旨在摸索一 条对于 Ｄ ｃ 本 ｃ凋
２ １ 年 ０ 月 ００ ９
内 蒙 古 民 族 大 学 学 报
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ ｎ ｅ ｎ ｏ ｉ ｉ ｅ ｓｔ ｒＮａｉ ｎ ｌ ｉｓ ｏ ｒ ａ ｎ ｒＭｏ ｇ ｌ Ｕｎ ｖ ｒ ｉ ｆ ｔ ａ ｉ ｅ ｏＩ ａ ｙｏ ｏ ｔ
Ｓ ｐ２ １ ｅ． ０ ０
Ｖｏ ． ６ Ｎｏ５ １１ ．
ｒＧ Ｃ Ｆ 自北 京利文公 司 ， 巴细胞分离液 ， Ａ Ｓ ａ ｂ ｒ ｈ Ｍ— Ｓ 购 淋 Ｆ Ｃ ｃｌ ｕ 型流式 细胞仪为 Ｂ ｉ Ｄ公 司产 品 ， 超净 工作 台， 二氧化碳细胞培 养 １ 外周血 来源 ． ２
１ 实验 方 法 ． ３
新鲜抽取 的正常人外 周血 ２ ｍ ， ０ｌ 装入肝素抗凝 的无菌试管 内 ， 日使用 。 当
流式细胞周期结果图解读
流式细胞周期结果图解读(附图详解)Time：2010-12-07 PM 19:03Author:bioer Hits: 51 times 流式检测细胞周期操作步骤1. 细胞培养：取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。
2. 细胞固定：800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。
3. 细胞染色：1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。
4. 流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
注：上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团！流式细胞周期结果图解读首先来认识一下流式细胞周期结果图：1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；2、横坐标DNA Content：即DNA含量；3、G1、G2、S三期在图中已经标示；4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；以此类推…流式细胞周期结果图的意义，主要从细胞周期的角度看各参数的意义：1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。
可分为四个阶段：①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
流式细胞仪检测细胞增殖方法有哪些
流式细胞仪检测细胞增殖方法有哪些？在生物学和医学研究中，细胞增殖是一个关键过程，对于理解生命活动的基本规律以及疾病的发病机理具有重要意义。
随着科技的发展，流式细胞仪作为一种高效、灵敏的分析工具，广泛应用于细胞增殖的检测。
流式细胞仪通过快速分析单个细胞，可以对细胞周期、细胞增殖活性、细胞凋亡等多个方面进行研究。
本文将探讨流式细胞仪在检测细胞增殖方面的主要方法，包括但不限于溴脱氧尿苷（BrdU）掺入法、细胞周期蛋白检测法以及细胞大小分析法等，为读者提供全面的技术应用概览。
流式细胞仪检测细胞增殖方法：1、3H（氚离子）掺入法原理：是在细胞DNA合成时，用3H脱氧胸腺嘧啶核苷代替普通的脱氧胸腺嘧啶核苷掺入新合成的DNA中，增殖的细胞因为掺入3H而具有放射性，通过定量检测样品细胞的放射性大小而反映细胞的增值活性缺点：1）使用的是具有放射性的同位素，操作较为复杂，同时需要采取放射性保护措施2）低比例高活跃增殖和高比例低活跃增殖可能得到的是相同的结果，用此方法无法进行鉴别3）此方法无法进一步得到具有活性的增值细胞用于下一步的研究4）此方法时间较短，无法检测加入前细胞的增殖情况，而且检测到放射性只能说明细胞DNA合成，而不能提供合成DNA的细胞是否进入增殖阶段的信息2、相对计数法原理：将对照组和各实验组控制在相同条件下直接计数然后比较计数结果得到增殖结论注意点：对照组与实验组每种细胞所加浓度必须相同，每组至少设置3个复孔，这样每个孔可以得到1个细胞数，将3个复孔取平均值后就是这个组的结果。
如果同时需要得到每孔目标细胞增殖后的绝对参数，在每孔细胞中加入1*105PE标记的人工微球作为内参收集各组的细胞于EP管中，注意必须尽量将各组的所有细胞都收集起来。
标记需要计数细胞的标志表型的荧光素偶联抗体，4℃静置30minPBS洗涤一次，洗去游离的抗体3、示踪染料标记法示踪染料与细胞结合的方式：1）能够与细胞内的蛋白质上的氨基发生非特异性的共价结合2）能够非特异性地嵌入细胞膜的脂质双分子层中与细胞发生非共价性结合原理：示踪染料的荧光信号都很强，当细胞分裂时，母细胞内的染料会被平均分配到子细胞中，细胞荧光信号会被减弱一半，所以通过检测减弱的、发射示踪染料荧光信号的细胞比例就可以判断细胞增殖的强弱。
流式细胞仪细胞周期图详解
1
流式细胞术检测细胞周期
1. 纵坐标Cell Number：即计数到的有效细胞数；
2. 横坐标DNA Content：即DNA量，为什么用DNA量来区别各周期
3. G1、G2、S三期在上图已经用箭头标示；
4. 右侧数字含义：Mean G1=19
5.4即G1期DNA含量平均值为
195.4；%G1=73.6即G1期细胞数占总数的73.6%；
1 G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；
② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；
2 G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时
间；④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
3
3、流式细胞结果图各参数的意义：
前面讲过，常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：
G1期：细胞DNA复制还没有开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；
S 期：细胞开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；
G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第二个峰；
M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。
基因组流式结果
基因组流式结果
基因组流式结果是一种通过流式技术对基因组进行检测和分析的方法。
流式技术是一种基于单细胞的分析技术，可以对细胞进行多参数、快速、高通量的检测和分析。
在基因组流式结果中，可以获得以下几个方面的信息：
1. 细胞周期：通过检测DNA的含量和倍体变化，可以了解细胞周期的变化，判断哪些细胞周期受到了阻滞。
2. 细胞凋亡：通过检测细胞碎片的面积，可以了解细胞凋亡的情况，判断凋亡细胞的比例和程度。
3. 细胞分群：通过使用不同的参数对细胞进行分类，可以将不同的细胞群区分出来，更有针对性地进行分析。
4. 基因表达：通过检测特定基因的表达水平，可以了解基因的表达情况，分析基因的功能和作用机制。
总之，基因组流式结果是一种非常有用的技术，可以对基因组进行全面、深入的检测和分析，为遗传学、肿瘤学、免疫学等领域的研究提供重要的帮助。
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荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
荧光补偿
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。
（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
568
488
488
荧光颜 色
绿 525
红 615
橙 575
别藻青蛋白 APC 633 红 670
能量传递复 PEcy5 488 红
合染料
670
溶解性 易 不易
易
易
对PH敏 感性 敏感
不敏感
特点
易溶于水，与抗体结 合不影响特异性 稳定，偶联后量子产 额低
不敏感 具较多发光基团，消 光系数和量子产额高
不敏感 减少交叉，成本高
第二节 数据的显示与分析
• 参数：FS,SS,FL • 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维等
高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ） • 设门分析技术
一、 参数
FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
二、数据显示方式
直分析方图
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞 时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构 属性。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
测得的FS与SS信号 通过计算机处理，可 得到FS-SS图，由此 可仅用散射光信号对 未染色的活细胞进行 分析或分选。
3. 假三维等高图
（三）三参数直方图
（四）流式细胞仪的多参数分析
多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧 光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。
三、设门分析技术
Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的 细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样 本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。
样本来源：各种细胞（如外周血，骨髓， 实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞），微 生物，人工合成微球等。 检测大小：一般是0.5um～40um
流式细胞仪的组成
液流系统 光学系统 数据处理系统
分选系统
分析型流式细胞仪
分选型流式细胞仪
（液1）流液流系统
流动室
流动室（Flow cell）是液流系统的核心部件，流动室是 由石英玻璃制成，单细胞悬液在流动室里被鞘液流包绕 通过流动室内一定孔径的孔，检测区在该孔的中心，细 胞在此与激光垂直相交。
NK细胞分析
NK(CD3-CD16+CD56+)
二、淋巴细胞功能分析
• 细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例) • 细胞内细胞因子测定
三、淋巴造血系统及白血病免疫分型
•对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型 •用于选择化疗方案、判断预后及检出微小 残留病变
四、肿瘤耐药基因分析
MDR(+)表示对化疗药物耐药
一、淋巴细胞及其亚群的分析
T淋巴细胞及其亚群分析
Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)
B淋巴细胞及其亚群分析
B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身 免疫病的发生有关 B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体
光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器 • 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光 • 滤片：长通、短通、带通 • 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
光学系统示意图
Flow Tip
（一）几种常见的荧光染料
细 胞 悬 液
激光
FITC 异硫氰酸荧光素
Texas red 得州红
PE.PC.APC 藻胆蛋白类 PEcy5 能量传递复合染料
FL1 FL2 FL3 FL4
常用的几类荧光染料
名称
异硫氰酸荧 光素 得州红
藻红蛋白
藻青蛋白
染料
FITC
Texas red PE
PC
激发 波长 488
计算机系统 分析结果
二、散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以 相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等 粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
此为血细胞分类的 基本原理，但不能分 析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
三、荧光测量
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发 后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 • 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波 长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信 号区分开，送入不同的光电倍增管。 • 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多 个不同特征。 • 线性放大器和对数放大器
单参数直方图
（二）双参数直方图
• 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数， 根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。
• 双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每 个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强 度的颗粒数量的多少。
1.双参数直方图点图
特点：检测速度快、检测通量高、单细胞多参数的检测
流式流式细胞仪仪
流式细胞仪 流式细胞仪 流式细胞仪
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞
分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来
的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、
DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可
分类收集的高技术。
流式细胞仪可以做什么？
SS and FL Detectoer
（3）数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
基本工作原理
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
• 单参数直方图 • 双参数直方图:点图
二维等高图 假三维等高图 • 三参数直方图 • 多参数分析
设门分析:REGION和GATE设置
（一）单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样 散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。
细 胞 相 对 数 量
信道 (channel )
能量传递复合染料
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激 发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另 一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。
能量传递复合染料机制
488nm
575nm CY5
PE
CY5
藻红蛋白
CY5
花青苷5
670nm 红色荧光
（二）免疫荧光标记
➢新鲜实体组织单细胞悬液的制备
• 机械法 • 酶处理法 • 化学试剂处理法 • 表面活性剂处理法
➢单细胞悬液的保存
• 深低温保存法（一年） • 乙醇或甲醇保存法（2周） • 甲醛或多聚甲醛保存法（2月）
二、常用的荧光染料与标记染色
适用条件:
• 有较高的量子产额和消光系数 • 对488nm的激发光波长有较强的吸收 • 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 • 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性
D1 CD4+/CD3D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3D4 CD4- /CD3+
第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求
• 样本制备 • 标记染色 • 液相芯片技术 • 质量控制
一、免疫检测样品制备
➢外周血淋巴细胞样品的制备
分离单个核细胞
单细胞悬液
➢培养细胞的样品制备
蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗 涤 尼龙网过滤
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中 细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百 分率。 • 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点 的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
• 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的 总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与 分选速度成反比。
流式细胞仪分析技术及 应用
郝圆园 201731830
流式细胞术
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的 一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析 和分选的新技术。
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
（二）免疫荧光染色的质控
• 温度 • pH • 染料浓度 • 固定剂
（三）仪器操作的质控