流式细胞仪结果分析

光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器 • 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光 • 滤片：长通、短通、带通 • 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
光学系统示意图
Flow Tip
D1 CD4+/CD3D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3D4 CD4- /CD3+
第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求
• 样本制备 • 标记染色 • 液相芯片技术 • 质量控制
一、免疫检测样品制备
➢外周血淋巴细胞样品的制备
分离单个核细胞
单细胞悬液
➢培养细胞的样品制备
蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗 涤 尼龙网过滤
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞 时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构 属性。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
测得的FS与SS信号 通过计算机处理，可 得到FS-SS图，由此 可仅用散射光信号对 未染色的活细胞进行 分析或分选。
层流水力聚焦技术
光学系统
—Light scattering at FSC represents the particle size and area
—Light scattering at SSC depends on granularity and complexity of the particle
计算机系统 分析结果
二、散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以 相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等 粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
568
488
488
荧光颜 色
绿 525
红 615
橙 575
别藻青蛋白 APC 633 红 670
能量传递复 PEcy5 488 红
合染料
670
溶解性 易 不易
易
易
对PH敏 感性 敏感
不敏感
特点
易溶于水，与抗体结 合不影响特异性 稳定，偶联后量子产 额低
不敏感 具较多发光基团，消 光系数和量子产额高
不敏感 减少交叉，成本高
样本来源：各种细胞（如外周血，骨髓， 实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞），微 生物，人工合成微球等。 检测大小：一般是0.5um～40um
流式细胞仪的组成
液流系统 光学系统 数据处理系统
分选系统
分析型流式细胞仪
分选型流式细胞仪
（液1）流液流系统
流动室
流动室（Flow cell）是液流系统的核心部件，流动室是 由石英玻璃制成，单细胞悬液在流动室里被鞘液流包绕 通过流动室内一定孔径的孔，检测区在该孔的中心，细 胞在此与激光垂直相交。
微小的乳胶微球分别染成上百 种不同的荧光色（固相芯片是 用探针在芯片上的坐标位置给 基因的特异性编码；而液相芯 片则是用颜色来编码）
通过对标记不同荧光素分子的检测，实 现FCM对可溶性物质的定量分析
四、流式细胞免疫学技术的质量控制
（一）单细胞悬液制备的质控
• 适当的制备方式 • 处理红细胞 • 实体组织来源标本用机械法 • 温度25~37℃，pH7.0~7.2
（二）免疫荧光染色的质控
• 温度 • pH • 染料浓度 • 固定剂
（三）仪器操作的质控
• 光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少 变异（CV）。
• PMT（光电倍增管）校Fl准ow: 保-c证h样e品ck检测时仪器处于最佳灵敏
度工作状态。
• 绝对计数校准: 保证计数F的lo准w确-性se。t
五、AIDS病检测中的应用
CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例
六、自身免疫病相关HLA抗原分析
HLA-B27可出现在58%～97%的强直 性脊椎炎(As) 患者
七、移植免疫中的应用
FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个 领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广 泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式 细胞术的交叉配型（Flow cytometry crossmatching, FCXM）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody, PRA）检测。
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
（3）数据来自百度文库理系统
主要由计算机及其软件组成
基本工作原理
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
特点：检测速度快、检测通量高、单细胞多参数的检测
流式流式细胞仪仪
流式细胞仪 流式细胞仪 流式细胞仪
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞
分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来
的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、
DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可
分类收集的高技术。
流式细胞仪可以做什么？
流式细胞仪分析技术及 应用
郝圆园 201731830
流式细胞术
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的 一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析 和分选的新技术。
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
红 色 荧 光 强 度
绿色荧光强度
双参数直方图点图
2. 二维等高图
• 由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。 • 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等
高”。 • 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。 • 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。
二维等高图
➢新鲜实体组织单细胞悬液的制备
• 机械法 • 酶处理法 • 化学试剂处理法 • 表面活性剂处理法
➢单细胞悬液的保存
• 深低温保存法（一年） • 乙醇或甲醇保存法（2周） • 甲醛或多聚甲醛保存法（2月）
二、常用的荧光染料与标记染色
适用条件:
• 有较高的量子产额和消光系数 • 对488nm的激发光波长有较强的吸收 • 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 • 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中 细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百 分率。 • 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点 的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
• 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的 总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与 分选速度成反比。
➢荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合
➢免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体 组合标记
三、免疫胶乳颗粒技术的应用
• 免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的 乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对 不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在 悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后 不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。 因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称 。
NK细胞分析
NK(CD3-CD16+CD56+)
二、淋巴细胞功能分析
• 细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例) • 细胞内细胞因子测定
三、淋巴造血系统及白血病免疫分型
•对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型 •用于选择化疗方案、判断预后及检出微小 残留病变
四、肿瘤耐药基因分析
MDR(+)表示对化疗药物耐药
单参数直方图
（二）双参数直方图
• 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数， 根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。
• 双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每 个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强 度的颗粒数量的多少。
1.双参数直方图点图
此为血细胞分类的 基本原理，但不能分 析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
三、荧光测量
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发 后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 • 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波 长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信 号区分开，送入不同的光电倍增管。 • 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多 个不同特征。 • 线性放大器和对数放大器
（一）几种常见的荧光染料
细 胞 悬 液
激光
FITC 异硫氰酸荧光素
Texas red 得州红
PE.PC.APC 藻胆蛋白类 PEcy5 能量传递复合染料
FL1 FL2 FL3 FL4
常用的几类荧光染料
名称
异硫氰酸荧 光素 得州红
藻红蛋白
藻青蛋白
染料
FITC
Texas red PE
PC
激发 波长 488
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
荧光补偿
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。
（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
Flow-count
（四）免疫检测的质控
• 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单 抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。
• 全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次 实验结果可靠。
第四节 在免疫学检验中的应用
流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学 基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式 细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析， 可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增 加了有效的手段和帮助。
• 单参数直方图 • 双参数直方图:点图
二维等高图 假三维等高图 • 三参数直方图 • 多参数分析
设门分析:REGION和GATE设置
（一）单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样 散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。
细 胞 相 对 数 量
信道 (channel )
一、淋巴细胞及其亚群的分析
T淋巴细胞及其亚群分析
Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)
B淋巴细胞及其亚群分析
B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身 免疫病的发生有关 B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体
能量传递复合染料
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激 发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另 一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。
能量传递复合染料机制
488nm
575nm CY5
PE
CY5
藻红蛋白
CY5
花青苷5
670nm 红色荧光
（二）免疫荧光标记
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆 形门、多边形门、任意形状门和十字门。
A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞
A、B、C均 为任意门
线性门
•Region设置:
区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈可与 门对应，但是也可以包含于门。
如十字门分析时，起 就可以由四个区域构 成，即 G=D1+D2+D3+D4。
3. 假三维等高图
（三）三参数直方图
（四）流式细胞仪的多参数分析
多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧 光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。
三、设门分析技术
Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的 细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样 本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。
第二节 数据的显示与分析
• 参数：FS,SS,FL • 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维等
高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ） • 设门分析技术
一、 参数
FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
二、数据显示方式
直分析方图