离子交换色谱
离子交换色谱
Ion exchange chromatography,IEC
2018/6/8
内
容
一、离子交换色谱的基本原理
二、离子交换剂的基本性质
三、离子交换介质的选择原则
四、离子交换色谱的基本操作
一、基本原理
1、基本原理
以离子交换树脂等作为固定相，树脂上具有固定离子基 团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的 离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基 团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得 到分离。
（2）阴离子交换剂
阴离子交换树脂是在基质骨架上引入伯胺[-NH2]、仲胺[-NHCH3]、 叔胺[-N(CH3)2]和季胺[-N+(CH3)3]基团后构成的。
2、亲水性离子交换剂
基质为与水亲和力较大的天然或人工的化合物
（1）纤维素离子交换剂
以微晶纤维素为基质，再引入电荷基团构成，最为广泛使用的是 二乙氨基乙基（DEAE-）纤维素和羧甲基（CM-）纤维素。
（2）交联葡聚糖离子交换剂
以交联葡聚糖G-25和G-50为基质，通过化学方法引入电荷而制成 的。
（3）琼脂糖离子交换剂
以交联琼脂糖CL-6B为基质，引入电荷基团而构成。
三、离子交换剂的选择原则
1、离子交换剂的选择
（1）如果被分离物质带正电荷，则选用阳离子交换剂；如果带负
电荷，应选用阴离子交换剂。 （2）强型离子交换剂适用的pH范围很广，用来分离一些在极端pH
2、缓冲液的选择
（1）对于两性蛋白质
+
等电点 蛋 白 质 净 电 荷 吸附阴离子交换剂 pH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
来说，缓冲液的pH决定
离子色谱缩写
离子色谱缩写
离子色谱（IonChromatography，缩写为IC）是一种分离和分析离子的方法，主要用于水样、食品、药物等样品中离子的分析。
该技术是基于分离过程中离子与固定相之间的相互作用来实现离子分离的。
离子色谱可分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱两种类型。
其中阳离子交换色谱（Cation Exchange Chromatography，缩写为CEC）主要用于分离带正电荷的离子，如钠、钾、铵等；阴离子交换色谱（Anion Exchange Chromatography，缩写为AEC）则主要用于分离带负电荷的离子，如氯离子、硝酸根离子等。
离子色谱技术由于具有高精度、高灵敏度和高选择性等优点，在环保、食品、化学、医药等领域得到了广泛应用。
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强阳离子交换色谱
强阳离子交换色谱
强阳离子交换色谱（Strong Anion Exchange Chromatography，SAX）是一种液相色谱技术，常用于分离和分析带有负电荷的分子，例如有机酸、核苷酸、糖类、氨基酸和蛋白质等。
在SAX色谱中，样品在高压下通过离子交换树脂柱，树脂中含有大量的阴离子官能团，如磺酸基团（SO3H）和羧基团（COOH）。
样品中带有负电荷的分子与树脂中的阳离子发生相互作用，从而在树脂表面发生交换反应，被分离出来。
SAX色谱通常使用有机溶剂作为移动相，如甲醇、乙腈和二甲基甲酰胺等，以增加样品与树脂之间的相容性。
同时，SAX色谱还可以通过调节移动相的pH值、离子强度和流速等参数来控制分离效果。
SAX色谱具有分离效率高、分离范围广、重复性好等优点，在生物化学、生物医学、环境科学等领域得到了广泛应用。
离子色谱
离子交换色谱摘要：离子交换色谱主要包括阴离子交换色谱和阳离子交换色谱。
本文介绍了，离子交换色谱的分离原理，检测方法，淋洗液、色谱柱类型和特点，以及离子交换色谱的应用。
离子色谱（IC）是高效液相色谱（HPLC）的一种，是分析阴离子和阳离子的一种液相色谱方法。
离子色谱的分离机理主要是离子交换，有3种分离方式，它们是高效离子交换色谱（HPIC）、离子排斥色谱（HPIEC）和离子对色谱（MPIC）。
3种分离方式的柱填料的树脂骨架基本都是苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物，但树脂的离子交换功能基和容量各不相同。
HPIC 用低容量的离子交换树脂，HPIEC用高容量的树脂，MPIC用不含离子交换基团的多孔树脂。
3种分离方式各基于不同分离机理：HPIC的分离机理主要是离子交换，HPIEC主要为离子排斥，而MPIC则是主要基于吸附和离子对的形成。
离子交换色谱的离子交换分离基于流动相和固定相上的离子交换基团之间发生的离子交换过程。
对高极化度和疏水性较强的离子，分离机理还包括非离子交换的吸附过程。
离子交换色谱主要是用于无机和有机阴离子和阳离子的分离。
离子交换功能基为季铵基的树脂用作为阴离子分离，为磺酸基和羧酸基的树脂作为阳离子分离。
离子交换色谱主要用于分析常见的Cl-，F-，Br-等无机阴离子，有机酸，糖和氨基酸等有机阴离子，分析的阳离子主要是同一元素的多种价态金属阳离子的分离与分析；离子排斥色谱主要用于分离和分析有机酸和无机酸；离子对色谱主要是用于对表面活性剂的分离和分析。
1分离原理离子交换色谱的色谱柱的填料主要由基质（substrate material）和功能基（functional）两部分组成。
功能基是可解离的无机基团，与流动相接触，在固定相表面形成带电荷的离子交换位置，与流动相中的离子发生离子交换，在离子交换反应中，功能基的本体结构不发生明显变化，仅由其离子交换功能基的离子与外界同性电荷的离子发生等量离子交换。
色谱柱填料又被称为“离子交换剂”[1]。
离子交换色谱法适合分离
离子交换色谱法适合分离
离子交换色谱法是一种用于分离物质的高效分析技术。
它可以根据分子量，氢离子、阴离子和其他物理和化学状态来对所需物质进行分离。
它是一种'离子交换'的分析技术，利用树脂或其他吸附剂的离子交换作用，从混合溶液中分离的物质，从而使其成分可以快速检测和分离。
离子交换色谱法适用于分离药物，芳烃，醇，醛，酸，氨基酸，蛋白质，多糖，糖原和细胞因子等各种物质。
此外，它还可以用于分离重金属离子和有毒物质。
离子交换色谱法的一个优点是可以快速、精确地对物质进行分离，比色谱法更加有效。
此外，它还具有更高的效率，更容易控制，可以有效地提取和分离低分子量物质，以及可以实现低成本和高效的分离。
离子交换色谱法的缺点是操作复杂，耗费时间，而且在分离过程中受到环境条件的影响。
这就需要操作人员高度专业化和良好的经验来才能实现最佳的分离效果。
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离子交换色谱（ion
离⼦交换⾊谱（ion exchange chromatography）2、离⼦交换⾊谱（ion exchange chromatography）蛋⽩质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH⼩于其等电点时，带净正电荷，⽽在缓冲液pH⼤于其等电点时，带净负电荷。
阴离⼦交换凝胶本⾝带有正电荷基团，阳离⼦交换凝胶本⾝带负电荷基团。
由于静电相互作⽤⽽使样品结合到凝胶上，再采⽤盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进⾏洗脱对于等电点⼩于5.0的酸性蛋⽩质，推荐使⽤阴离⼦交换，对于等电点⼤于7.0的碱性蛋⽩质，推荐使⽤阳离⼦交换。
两种模式：⼀种使⽬的蛋⽩结合凝胶，通过梯度洗脱；⼀种使⽬的蛋⽩不结合凝胶，⽽⼤部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有⽬的蛋⽩。
column chromatography（柱⾊谱）batch chromatography（批⾊谱）c、疏⽔作⽤⾊谱利⽤蛋⽩质、多肽在⾼盐存在下，可以结合疏⽔凝胶，⽽在盐浓度降低时⼜可以解脱的原理实现分离。
d、亲和⾊谱利⽤蛋⽩质、多肽与某些配基的特异性相互作⽤⽽进⾏分离。
例如：酶-底物，酶-抑制剂，糖蛋⽩-凝集素，抗原-抗体等。
近来发展了⾦属螯合亲和⾊谱，⽤于纯化表⾯含⾊氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋⽩质以及(His)6-tagged重组蛋⽩。
亲和⾊谱分为特异性亲和⾊谱和组别亲和⾊谱两类。
肝素、凝集素、染料、⾦属螯合亲和⾊谱均为组别亲和⾊谱（同⼀配基可以结合许多种蛋⽩质）。
e、反相⾊谱常⽤于蛋⽩质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极⾼，可以分离两种仅相差⼀个氨基酸的多肽。
如⾎管紧张素（angiotensin）的⼏个亚型通过反相⾊谱可以很好地分离。
同⼀个样品在同⼀Source 30 RPC柱上进⾏分离，由于⾊谱条件进⾏了改变，⾊谱图截然不同，说明反相⾊谱具有⾼度的选择性。
四、应⽤举例例⼀、⼀种抗HIV gp120单克隆抗体的Fab⽚断（E.coli中表达）分⼦量：50 kD等电点：11表达定位：周质（periplasmic）纯化策略：渗透压休克提取周质，阳离⼦交换去除⼤部分杂质，疏⽔作⽤⾊谱进⼀步去除杂质，最后⽤凝胶过滤分离。
化学分离技术中的离子交换色谱
化学分离技术中的离子交换色谱离子交换色谱是一种常用的化学分离技术，广泛应用于生化、药物、食品、环境等领域。
在化学实验室和工业生产中，离子交换色谱是一个必不可少的工具。
离子交换色谱的原理是利用离子交换树脂与样品中离子的相互作用，将不同离子分离开来。
离子交换树脂是一种高分子材料，具有很强的离子交换能力，可以选择性地吸附或释放离子。
当样品溶液通过离子交换柱时，离子与离子交换树脂表面上的离子发生竞争作用，最终被吸附在离子交换树脂上，从而实现分离。
离子交换色谱可以分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱两种类型。
在阳离子交换色谱中，树脂上的功能基团带有阴离子，可以选择性地吸附阳离子；在阴离子交换色谱中，树脂上的功能基团带有阳离子，可以选择性地吸附阴离子。
离子交换色谱在化学分离中的应用非常广泛。
例如，在食品分析中，离子交换色谱可以用于检测大豆制品中的异黄酮；在生化分析中，离子交换色谱可以用于检测DNA和蛋白质；在药物制剂中，离子交换色谱可以用于纯化生物碱和抗生素。
离子交换色谱不仅可以用于分离和检测化学物质，还可以用于污水处理和工业废弃物处理。
例如，农业废水中的氨氮可以通过阴离子交换色谱沉淀出来，从而减少对环境的污染。
然而，离子交换色谱在使用时也存在一些问题。
首先，离子交换树脂会受到样品中其他成分的影响而失活，从而影响分离的效果。
其次，离子交换色谱在使用过程中需要经常更换离子交换柱，增加使用成本。
此外，离子交换色谱需要进行缓冲液的调配和pH值的控制，操作较为繁琐。
总之，离子交换色谱是一种非常有用的化学分离技术，具有广泛的应用前景。
虽然存在一些问题，但随着科技的发展和技术的改进，离子交换色谱将会被更广泛地应用于各个领域，为化学分离技术做出更大的贡献。
离子交换色谱的应用
离子交换色谱的应用
离子交换色谱（ionexchangechromatography，简称IEC）是一种常见的分离和分析技术，其主要原理是利用离子交换树脂与被分离物质中的离子进行交换，实现对被分离物质的分离纯化。
离子交换色谱的应用非常广泛，可以用于分离和纯化各种离子性物质，如酸、碱、金属离子、有机离子等。
在生物医药领域中，离子交换色谱可以用于蛋白质、多肽、核酸等生物大分子的纯化和分析。
在环境监测领域，离子交换色谱可以用于水体中大量离子的分离和检测。
在食品工业中，离子交换色谱可以用于脱盐、去污、提纯等。
离子交换色谱技术的发展也在不断提高，已经出现了高效液相离子交换色谱、离子对色谱、离子交换色谱-质谱联用等新技术，为离子交换色谱的应用提供了更多可能性。
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离子交换色谱法和离子色谱法
阳离子交换树脂
RSO H
3
+
X
RSO3X
+
H
不可交换离子 可交换离子 待测离子
交换平衡常数或选择性系数
RSO X H RSO X 3 3 s m s Ks RSO3 H s X m RSO3 H s / X m K A KB / H m
强酸型阳离子交换树脂：含有磺酸基-SO3 H+的树脂
OH 2.阴离子交换树脂：在骨架上引入能电离出 的
碱性基团，如季铵基、氨基、仲胺基，叔胺基。 强碱型阴离子交换树脂：含有季铵基-N(CH3)+3 OH 的树脂。
交联度和交换容量
交联度：
表示离子交换树脂中交联剂的含量大小，即合成树脂 时二乙烯苯在原料中的重量百分含量。 强酸型--2～16%：强碱性--<10%。 交联度越高。网眼越小，选择性越高，大体积离子愈 难进入树脂基体。
影响Ks的因素
1）溶质的离子电荷数越大或水合离子半径越 小，则KS ↑。 2）交换能力强、选择性大的离子组成流动相 的洗脱力越大，则tR↓, KS↓ 3) pH降低时，弱电解质的离解被抑制（弱酸 ），tR↓, KS↓ 4）交联度↑，交换容量↑， tR ↑, KS ↑
流动相
离子交换色谱多以水溶液为流动相，因为水具有使组
分离子化的特性，也可在流动相中加入少量有机溶剂（甲
醇，四氢呋喃和乙腈）以增加某些组分的溶解度进而改变 分离选择性，这对分离可离解的有机化合物尤为有利。 以水为流动相的离子色谱中，组分的保留时间和分离 度主要通过控制流动相pH和离子强度调节。
离子交换色谱法分析化学
离子交换色谱法分析化学离子交换色谱法是一种常用的分离和分析方法，广泛应用于化学、生物、环境等领域。
该方法基于离子交换剂与样品中离子之间的相互作用，实现对目标化合物的分离和分析。
本文将介绍离子交换色谱法的基本原理、实验操作步骤以及在化学分析中的应用。
一、离子交换色谱法的基本原理离子交换色谱法利用离子交换剂作为固定相，通过与样品中离子之间的相互作用，实现分离目标化合物。
离子交换剂是一种具有交换基团的功能性材料，通过基团与样品中离子进行交换，从而实现对目标化合物的分离。
根据不同的交换基团和固定相材料，离子交换色谱法可应用于不同类型化合物的分离和分析。
二、实验操作步骤1、准备实验仪器和试剂，包括色谱柱、流动相、样品溶液等。
2、将离子交换剂填充至色谱柱中，制成固定相。
3、将样品溶液注入进样器中。
4、开启泵，使流动相通过色谱柱，将样品中的离子与固定相中的交换基团进行交换。
5、通过检测器对分离后的离子进行分析和检测。
6、根据峰高、峰面积等参数计算目标化合物的含量。
三、离子交换色谱法在化学分析中的应用1、有机酸和碱的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定有机酸和碱的含量，如乳酸、柠檬酸、苯胺等。
通过选择合适的离子交换剂和流动相，可实现高分辨率分离和准确测定。
2、金属离子的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定金属离子，如钠、钾、钙、镁等。
通过选择含有适当功能基团的固定相，可实现对不同金属离子的分离和分析。
3、环境样品的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定环境样品中的阴、阳离子，如水样、土壤样品的分离和分析。
通过优化实验条件，可实现高分辨率分离和准确测定。
4、生物样品的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定生物样品中的离子，如氨基酸、多肽等。
通过选择合适的固定相和流动相，可实现高分辨率分离和准确测定。
5、其他领域的应用：离子交换色谱法还可应用于化学合成、药物分析、食品分析等领域。
通过选择合适的固定相和流动相，可实现对不同类型化合物的分离和分析。
离子交换色谱
离子交换色谱一、实验原理：离子交换层析Ion Exchange Chromatography简称为IEC是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法;离子交换层析中,基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成;带有正电荷的称之阴离子交换树脂;而带有负电荷的称之阳离子树脂;离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化;由于蛋白质也有等电点,当蛋白质处于不同的pH条件下,其带电状况也不同;阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,所以这类蛋白质被留在柱子上,然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施,将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来;结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来;反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来;离子交换层析是用离子交换剂作固定相,利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法;即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程;带电荷量少,亲和力小的先被洗脱下来,带电荷量多,亲和力大的后被洗脱下来;二、实验设计离子交换剂；缓冲液；洗脱剂具体操作：1、离子交换介质的选择：考虑目的分子的大小,目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团；功能集团的强弱,目的分子稳定,选择强交换介质;对于大多数纯化步骤来说,建议开始的时候使用强离子交换柱,可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围;对于一个已知等电点的蛋白质,可根据其等电点来选择;如果选用阴离子交换剂,使用缓冲液的pH值应高于该蛋白质等电点,因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净负电荷,可与阴离子交换剂结合;如果选用阳离子交换剂,缓冲液的pH值应低于该蛋白质的等电点,因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净正电荷,可与阳离子交换剂结合;对于一个未知等电点的蛋白质,可以先选择一个阴离子交换剂,再选择一个中性的pH缓冲液,将蛋白质样品透析至,然后过阳离子交换柱,根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pH;如果目的蛋白再穿过液中,说明目的蛋白在此pH条件下带正电荷,可将缓冲液升高一个pH,将蛋白质样品透析纸,然后再过阴离子交换柱,根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pH;以此类推,直至目的蛋白能够结合在阴离子交换柱上为止,也可用阳离子交换剂作类似的选择,不过要注意,pH的改变应向减小的方向进行;功能集团的强弱一般情况下,在分离等电点pH为6-9的目的分子,尤其是当目的分子不稳定时,需要较温和的色谱条件才会选用弱交换介质;流动相缓冲液的选择：离子交换色谱的流动相必须是有一定离子强度的并且对pH有一定缓冲作用的溶液；阳离子交换剂应选择阴离子缓冲液,可用柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐等；阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液,可用乙二胺、Tris等；起始缓冲液浓度应尽可能低,这样可使色谱柱上吸附更多的分离物质;2、色谱柱的选择通常选择粗短柱,即高径比小的色谱柱;离子交换分离蛋白质是依靠吸附强弱不同,发生吸附时蛋白质会优先结合在色谱柱的上部,如果柱子过长,增加了从吸附位置到收集位置的流程距离,容易增加样品扩散,导致峰值增加3、折叠预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒,以保证有较好的均匀度,对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤;溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理,使之成为带H+或OH-的交换剂型;阴离子交换剂常用"碱-酸-碱"处理,使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用"酸-碱-酸"处理,使最终转为-H-型交换剂;洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度;已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡;为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层,要适当加压装柱,同时使柱床压紧,减少死体积,有利于分辨率的提高;柱子装好后再用起始缓冲液淋洗,直至达到充分平衡方可使用;5、折叠加样与洗脱及洗脱组分的收集和分析加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度,所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围,同时要注意离子强度应低,可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的;样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前,以离心法除去;为了达到满意的分离效果,上样量要适当,不要超过柱的负荷能力;柱的负荷能力可用交换容量来推算,通常上样量为交换剂交换总量的1%-5%;折叠洗脱：已结合样品的离子交换前,可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱,也可同时改变pH与离子强度;为了使复杂的组份分离完全,往往需要逐步改变pH或离子强度,其中最简单的方法是阶段洗脱法,即分次将不同pH与离子强度的溶液加入,使不同成分逐步洗脱;由于这种洗脱pH与离子强度的变化大,使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱,纯度较差,不适宜精细的分离;最好的洗脱方法是连续梯度洗脱,两个容器放于同一水平上,第一个容器盛有一定pH的缓冲液,第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液,两容器连通,第一个容器与柱相连,当溶液由第一容器流入柱时,第二容器中的溶液就会自动来补充,经搅拌与第一容器的溶液相混合,这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化;第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算:C=C2-C2-C11-VA2/A1式中A1、A2分别代表两容器的截面积:C1、C2分别表示容器中溶液的浓度;V为流出体积对总体积之比;当A1=A2时为线性梯度,当A1>A2时为凹形梯度,A1>A2时为凸形梯度;洗脱时应满足以下要求:①洗脱液体积应足够大,一般要几十倍于床体积,从而使分离的各峰不至于太拥挤;②梯度的上限要足够高,使紧密吸附的物质能被洗脱下来;③梯度不要上升太快,要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态;目的物的过早解吸,会引起区带扩散;而目的物的过晚解吸会使峰形过宽;洗脱馏份的分析按一定体积5-10ml/管收集的洗脱液可逐管进行测定,得到层析图谱;依实验目的的不同,可采用适宜的检测方法生物活性测定、免疫学测定等确定图谱中目的物的位置,并回收目的物;洗脱组分的收集和分析：通常色谱柱下端连接一个紫外检测器,用于检测蛋白质组分的洗脱过程,而后又连接着部分收集器,用于收集洗脱液;6、离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生;如离子交换纤维素可用2mol/:NaCl淋洗柱,若有强吸附物则可用LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生,也可用乙醇洗涤,其顺序为：LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水;保存离子交换剂时要加防腐剂;对阴离子交换剂宜用%氯已定洗必泰,阳离子交换剂可用乙基硫柳汞%;有些产品建议用%叠氮钠;三、举例：离子交换层析法分离氨基酸原理：所用样品为天冬氨酸和组氨酸的混合液,分别属酸性氨基酸、碱性氨基酸,用强酸型阳离子交换树脂Dowex50,在一定洗脱条件下洗脱,将它们分离;组氨酸pH>10,天冬氨酸.器材：层析柱,沸水浴等试剂：Dowex50；LNaOH；柠檬酸缓冲液；氨基酸混合液；茚三酮混合液目数：离子交换树脂的颗粒直径大小Dowex50为20-50目Dowex20 840µmDowex50 297µmDowex100 149µm代表二乙烯苯的百分含量操作：1、层析：将Dowex50装柱后,用LNaOH清洗树脂5分钟,再用柠檬酸缓冲液平衡10分钟;方法同凝胶层析法加样5-6滴;当样品进入树脂后,加入柠檬酸缓冲液洗脱加样后立即收集,每管收集3ml控制流速15滴/分钟;当第一峰一出现,换用LNaOH作洗脱液,直至第二峰收集完毕;用柠檬酸缓冲液再平衡10分钟,再生;2、检测：从第二管起每收集管中加入茚三酮显色液,充分混合,沸水浴15分钟,自来水冷却,观察氨基酸与茚三酮的显色反应,若生成紫色混合物,则说明收集到氨基酸;四、离子交换色谱的优缺点：优点：1、具有开放性支持骨架,大分子可以自由进入和迅速扩散,故吸附容量大；2、有亲水性,对大分子的吸附不太牢固,用温和条件即可洗脱,不致引起蛋白质变性和酶的失活；3、多孔性、表面积大、交换容量大、回收率高,可用于分离和制备;缺点：由交换层析介质决定,不同蛋白质相互分离效果也不确定,这种分离也易造成各蛋白峰的重叠,造成分离纯度的下降;四、离子交换色谱的优缺点：优点：1、具有开放性支持骨架,大分子可以自由进入和迅速扩散,故吸附容量大；2、有亲水性,对大分子的吸附不太牢固,用温和条件即可洗脱,不致引起蛋白质变性和酶的失活；3、多孔性、表面积大、交换容量大、回收率高,可用于分离和制备;缺点：由交换层析介质决定,不同蛋白质相互分离效果也不确定,这种分离也易造成各蛋白峰的重叠,造成分离纯度的下降;。
离子色谱
抑制型电导技术由最初的抑制柱技术，又经历了可连续再生式的纤维管、微膜抑制器阶段，最新的抑制技术采用电解抑制法，使抑制电导检测可以自动进行而不必采用传统的再生液。通过电导抑制可以使背景电导值很低，而检测灵敏度可以达到很高水平。
因此，目前大多数离子色谱基本上还是采用抑制电导法检测。无论是痕量测定的电场，还是半导体工业，抑制电导检测始终是最理想的方法。
由于H.Small等人研制的抑制型离子色谱仪是专利产品，只有Dionex公司可以生产和销售，人们设想采用其他途径研制离子色谱仪。这其中最为成功的是在美国依阿华州立大学J.S. Fritz等人提出非抑制型离子色谱，即采用低交换容量的离子交换树脂制成色谱柱，采用弱酸及其盐类作为淋洗液对不同离子进行淋洗，在控制一定pH值的条件下，背景电导比较低，可以不加抑制器直接电导检测。该方法称为非抑制电导离子色谱。由于非抑制型离子色谱只采用了分离柱，人们通常称之为单柱型离子色谱；而对应的称为抑制型离子色谱，由于用分离柱和抑制器，又称为双柱型离子色谱。
20世纪80年代初，离子色谱已经广泛地被人们所认同、接受，离子色谱的销售量每年以15%以上的速度递增。美国化学文摘及英国的分析化学文摘专门将离子色谱分成独立的一类；而Journal of Chromatography Science每年在介绍色谱仪器时，将其分为液相色谱、气相色谱、离子色谱和毛细管电泳4大类型。国际上每年都召开国际离子色谱学术会议，至今已经召开了十四届，而国内目前也每两年召开一次全国性离子色谱会议和一些区域性的离子色谱协作会议。由此可见，离子色谱学科以飞快的速度向前发展。
三、离子排斥色谱
它主要根据Donnon膜排斥效应：电离组分受排斥不被保留，而弱酸则有一定保留的原理制成。离子排斥色谱主要用于分离有机酸以及无机含氧酸根，如硼酸根、碳酸根和硫酸根、有机酸等。它主要采用高交换容量的磺化H型阳离子交换树脂为填料，以稀盐酸为淋洗液。
色谱分离技术—离子交换色谱分离技术
离子交换剂
离子交换树脂的性能评价——滴定曲线 滴定曲线也是检验和测定离子交换剂性能的重要数据，如下图是几种离子交
换剂的滴定曲线。
几种典型离子交换剂的滴定曲线
n为单位质量离子交换剂所加入的NaOH或HCl的毫摩尔数 1,2,3,4分别为强酸型、弱酸型、强碱型、弱碱型离子交换剂滴定曲线
影响离子交换的因素
温度的影响 温度的改变对稀溶液的离子交换性能影响不大，但在0.1mol/L以上浓度时，
温度升高对水合倾向大的离子容易交换吸附。同时离子的活性系数增大，对弱 酸、弱碱交换剂来说其交换率有较大的影响。一般温度增高，离子交换速度加 快，在洗脱时亦可提高洗脱能力。但对不耐热的交换剂应注意提高温度的条件， 避免引起交换剂的破坏。
离子交换树脂的命名 离子交换树脂的型号由三位阿拉伯数字组成：第一位数
字代表产品的分类；第二位数字代表骨架；第三位数字为顺 序号，用以区别基团。
离子交换色谱分离技术
离子交换剂
离子交换树脂的性能评价——交换容量
不同的树脂其交换能力大小不同，表征树脂交换能力大 小的主要参数是交换容量，即指每克干燥离子交换树脂或每 毫升完全溶胀的离子交换树脂所能吸收的一价离子的毫摩尔 数。交换容量的大小，取决于网状结构中活性基团的数目， 含有活性基团越多，交换容量也越大。但交换容量太大，活 性基团太多，树脂不稳定。
影响离子交换的因素
溶剂的影响 通常在水中进行交换，亦可采用含水溶剂，但在极性小的溶剂中难以进行
或不进行交换，同时还导致离子交换的选择性的降低或消失。
离子交换色谱分离技术的应用
可溶性的有机或无机离子化合物均可进行离子交换色谱操作。 化合价越高，被结合的生物物质越强，相同化合价和条件下，结合的亲和力
离子交换色谱
离子交换色谱
离子交换色谱（Ion exchange chromatography，简称IEX）是一种在离子交换树脂上进行的分离技术。
该技术基于样品中离子与固相固定离子之间的相互作用，实现样品中化合物的分离和纯化。
离子交换色谱的原理是利用带电的离子交换树脂作为固定相，当样品溶液经过固定相时，离子交换树脂上的固定离子会与样品中的带电离子发生相互作用。
在交换树脂上，样品中的带电离子可以与固定离子发生相互作用，形成离子交换。
通过调节溶液的离子强度或改变pH值，可以控制离子交换的强弱，从而实现对样品中的离子的分离。
离子交换色谱技术广泛应用于生物化学、生命科学、制药和环境科学等领域，常用于分离和纯化蛋白质、多肽、核酸、多糖等生物分子。
同时，离子交换色谱也可以用于分析和测定样品中特定离子的浓度。
离子交换色谱可以分为阳离子交换色谱（Cation Exchange Chromatography，简称CEX）和阴离子交换色谱（Anion Exchange Chromatography，简称AEX）
两种类型。
阳离子交换色谱适用于带正电荷的物质的分离，而阴离子交换色谱则适用于带负电荷的物质的分离。
离子交换色谱
色谱峰：1=次黄嘌呤、2=鸟苷、3=胞苷、4=胞嘧啶、 5=鸟嘌呤、6=腺嘌呤
图2 啤酒样品的色谱图（色谱峰编号同图1）
图3 鲱鱼精DNA样品的色谱图（色谱峰编号同图1）
1=次黄嘌呤、2=鸟 苷、3=胞苷、4=胞 嘧啶、5=鸟嘌呤、 6=腺嘌呤
阳离子交换：
阴离子交换：
R+、R为交换剂上的固定离子基团，如RSO3-或RNH3+； Y+、Y为可交换的平衡离子，可以是H+、Na+或OH-、 Cl-等；X+ 、X为组分离子。 组分离子对固定离子基团的亲和力强，分配系数大， 其保留时间长；反之，分配系数小，其保留时间短
二、分类及常见种类
（一）分类 离子交换剂的固定相是交换剂，按活性基团可 分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。 1.阳离子交换剂：根据活性基团离解出H+能力的大 小不同，阳离子交换树脂分为强酸性和弱酸性两种 (例如含-SO3的为强酸性阳离子交换树脂，常用R-SO3H表示
三、离子色谱具有以下优点
（1）分析速度快：可在数分钟内完成一个试样的分析
（2）分离能力高： 在适宜的条件下，可使常见的各种 阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内， 可使七种阴离子完全分离。
（3）分离混合阴离子的最有效方法。 （4）采用塑料管线、接头及玻璃分离柱，抗腐蚀能力 强。
影响离子交换的主要因素
季胺(-N(CH3)3) H+不易电离，强碱性阴离子交换树脂； 伯胺基(-NH2)、仲胺基(-NHCH3)和叔胺基(-N(CH3)2)的树脂 为弱碱性阴离子交换树脂。 水化: R-NH3OH、R-NH2CH3OH、R-NH(CH3)2OH 和RN(CH3)3OH ,OH-可被阴离子交换和洗脱。
离子色谱基本原理
离子色谱基本原理离子色谱（Ion Chromatography，简称IC）是一种利用离子交换柱进行色谱分离的技术。
其基本原理是利用离子交换层析柱的离子交换功能，将样品中的离子根据其大小、电荷、亲和性等特性分离出来，并通过检测器进行定量或定性分析。
离子色谱的基本原理可以总结为四个步骤：样品进样、洗脱、分离和检测。
1.样品进样：将待测样品以溶液的形式通过进样器进入色谱柱。
一般情况下，样品需要经过前处理步骤，如过滤、稀释、调整pH值等，以保证样品的适应性和稳定性。
2.洗脱：色谱柱内填充有离子交换树脂，样品中的离子将与树脂上的固定离子相互作用，进而分离出来。
洗脱液（也称为展开液）是通过注入携带电荷的溶液来实现的。
洗脱液的选择应根据待测离子的性质来确定，以保证有效的分离效果。
3.分离：根据样品中离子的电荷和亲和性，通过调节洗脱液的性质，控制离子在柱上的停留时间，使不同离子按一定顺序从色谱柱中洗脱出来。
离子在离子交换树脂上的停留时间取决于它们与树脂上的固定离子的亲和性。
一些离子可能与树脂不发生亲和作用而直接通过色谱柱，因此可以快速通过。
4.检测：离子色谱可以使用各种类型的检测器进行定量或定性分析。
常见的检测器包括电导检测器、紫外可见吸收检测器、荧光检测器、脉冲电化学检测器等。
根据检测器的灵敏度和选择性，可以选择相应的检测器进行离子的定量或定性分析。
离子色谱的基本原理有以下几个特点：1.离子交换柱：离子交换树脂是离子色谱的核心部分，其在离子交换过程中发挥着重要的作用。
离子交换树脂的选择要考虑到样品的特性和待测离子的选择性。
2.洗脱液的选择：洗脱液的选择根据待测离子的性质来确定，以保证有效的分离效果。
洗脱液通常是溶液，如盐酸、硫酸、氯化钠等。
3.检测器的选择：离子色谱常采用的检测器有电导检测器、紫外可见吸收检测器、荧光检测器等。
根据检测器的灵敏度和选择性，可以选择相应的检测器进行离子的定量或定性分析。
离子色谱广泛应用于环境、食品、制药、化工等领域。
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（2）在离子交换剂的交换容量固定的情况下，起始缓 冲液的浓度应尽可能的低 （3）缓冲液离子不影响被分离蛋白或干扰其活性，同 时不应影响目标蛋白的溶解度。
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四、离子交换色谱的基本操作
图3 IEC装置示意图
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（一）交换剂的预处理、再生 （1）用水浸透使干树脂吸水溶胀，再用酸、碱 处理除去水中的不溶性杂质。 （2）再生是指将用过的离子交换剂恢复原状的 处理过程。
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2、平衡常数
离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律，且 离子交换剂与溶液中的离子或离子化合物所进行的离子交换反应 是可逆的。 阳离子交换剂RA，在溶液中解离出阳离子A+与溶液中的阳离子B+ 发生可逆交换反应：RA+B+ ⇋RB+A+
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，离子交换剂的 选择性可用平衡常数K表示：
（二）交换剂装柱 （1）离子交换色谱柱的选用 （2）装柱
垂直装柱，严防气泡和断层。
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当所用的交换剂与待分离物质各组分之间亲和力差 不多而需要交换剂体积较大时，以增加柱长为宜， 使待分离组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增 加。柱的直径与高度比以1:20左右为宜。
如采用离子强度较大的洗脱液梯度洗脱时，以选用 粗而短的柱子为宜，因为当柱上洗脱液的离子强度 高到足以完全取代被吸附离子时，这些被置换的离 子则以同洗脱液等速率向下移动，如果柱细长，就 增加了脱附离子扩散的机会。
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2、缓冲液的选择
（1）对于两性蛋白质 来说，缓冲液的pH决定 蛋白质在该缓冲体系下 所带的电荷， 以一个pI为5的蛋白为 例：
+
等电点
蛋
白
吸附阴离子交换剂
质
净
pH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
电
荷 吸附阳离子交换剂
图2 蛋白质静电荷与pH的关系
pH < pI（+） pH = pI（0） pH > pI（-）
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（三）样品上柱、洗脱和收集 （1）上柱 （2）洗脱 IEC中的洗脱是至关重要的一步，从交换剂上把被吸附 的物质洗脱下来，有两种方法：一种是增加离子强度， 置换出被吸附的离子；另一种是改变pH，使被吸附的 离子解离度降低，减弱其对交换剂的亲和力而被脱附。 （3）收集 用部分收集器分部收集，收集体积一般为柱体积的 1%~2%。
1、离子交换剂应具备高度的不溶性，保证在各种溶剂 中不会发生溶解； 2、具备稳定的理化性质，不能因物理化学变化而发生 分解； 3、具有较大的表面积或疏松的孔状结构，确保交换离 子自由地发生扩散和交换。
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离子交换剂
1、疏水性离子交换剂
与水亲和力较小的人工合成树脂 （1）阳离子交换剂 阳离子交换树脂具有酸性基团，电荷基团带负电，反离子带正电， 可与溶液中的阳离子或带正电荷的化合物进行交换反应。 （2）阴离子交换剂 阴离子交换树脂是在基质骨架上引入伯胺[-NH2]、仲胺[-NHCH3]、 叔胺[-N(CH3)2]和季胺[-N+(CH3)3]基团后构成的。
K [RB][A] [RA][B]
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1
2
3
4
5
反离子
样品溶液
梯度溶液
图1 IEC原理示意图
1-平衡阶段：离子交换剂与反离子结合
2-吸附阶段：样品与反离子进行交换
3,4-梯度缓冲液洗脱，先洗下弱吸附物质，再洗下强吸附物质
5-再生阶段：原始平衡缓冲液进行充分洗脱，即可重复使用 .
二、离子交换剂的基本性质
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2、亲水性离子交换剂
基质为与水亲和力较大的天然或人工的化合物 （1）纤维素离子交换剂 以微晶纤维素为基质，再引入电荷基团构成，最为广泛使用的是 二乙氨基乙基（DEAE-）纤维素和羧甲基（CM-）纤维素。 （2）交联葡聚糖离子交换剂 以交联葡聚糖G-25和G-50为基质，通过化学方法引入电荷而制成 的。 （3）琼脂糖离子交换剂 以交联琼脂糖CL-6B为基质，引入电荷基团而构成。
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三、离子交换剂的选择原则
1、离子交换剂的选择
（1）如果被分离物质带正电荷，则选用阳离子交换剂；如果带负 电荷，应选用阴离子交换剂。 （2）强型离子交换剂适用的pH范围很广，用来分离一些在极端pH 中解离且较稳定的物质；弱型则适宜用来分离生物大分子，活性不 易丧失。 （3）在分离生物大分子物质时，由于亲水性基质对被分离物质的 吸附和洗脱都比较温和，生物活性不易破坏而常被选用。 （4）交换容量：通常选用离子交换剂与溶液中离子或离子化合物 进行交换能力较大的介质。 （5）交换速度：一般选用交换速度快的介质。
离子交换色谱
Ion exchange chromatography,IEC
2020/5/15
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内容
一、离子交的选择原则 四、离子交换色谱的基本操作
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一、基本原理
1、基本原理 以离子交换树脂等作为固定相，树脂上具有固定离子基 团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的 离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基 团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得 到分离。
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Thank you ！
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