石蜡切片的制作

石蜡切片的制作

一：试验目的

掌握石蜡切片的制作

二：器材和试剂

实验动物、手术刀、手术剪、镊子、托盘、标本缸、石蜡切片机、恒温箱、水浴锅、温度计、烧杯、电磁炉、石蜡、包埋纸盒、毛笔、载玻片、盖玻片、中性树胶、染色架、鸡蛋清、甘油、甲醛、各级浓度的酒精(50%、70%、80%、85% 、90%、95%、100%)、二甲苯、苏木精、伊红、盐酸、蒸馏水、30%三氯化铁液。

三：试剂配制

苏木精染液：甲液：苏木精1g、无水酒精100ml;乙液：30%三氯化铁液4ml、蒸馏水

100ml、盐酸1ml。使用时将甲液、乙液等量混合。

伊红染液：伊红1g、95%酒精100ml、冰醋酸1-2滴。

1%盐酸酒精：盐酸1ml、70%酒精99ml。

福尔马林：甲醛10ml、蒸馏水90ml。

蛋白甘油1:1配制

四：实验步骤

1.取材和固定

处死实验动物，迅速取出所需的组织，清洗干净放入福尔马林中固定，12h后换福尔马林。

注意事项：

（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。

（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。

（3）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的标本缸里，同时在容器外上标签。标签上注明固定液、材料来源、日期等。

⑷如需清洗的材料可用生理盐水轻轻擦洗。

2.清洗

材料固定后，用清水清洗4小时

2.脱水：

50%酒精12h,在依次经70%、85%、95%、100%各级酒精溶液脱水1-2h。

注意事项：

(1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分和酒精挥发。

(2)在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。

(3)在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。

(4)脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象

4.透明

将组织块放入3:1酒精+二甲苯混合液、2:1酒精+二甲苯混合液、1:1酒精+二甲苯混合液30min，再放入到二甲苯两次各30min。

由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。

注意事项：

在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。

5.浸蜡：此过程应在恒温箱中进行，将恒温箱调至55℃-59℃之间的一个温度，保持恒定。包埋纸盒此时也应放在恒温箱中。

二甲苯+石蜡混合溶液3:1、二甲苯+石蜡混合溶液2:1、二甲苯+石蜡混合溶液1:1、石蜡溶液各1小时。最后进行包埋。

注意事项：

（1）浸蜡必须彻底，否则组织内残留透明剂会造成切片过程的困难和影响切片的质量。

（2）浸蜡温度要恒定，不可忽高忽低。

（3）操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。

6.包埋：在包埋纸盒内注入溶化的石蜡，将已浸蜡的组织块置入其内，使蜡块冷却硬固，组织块在蜡块中可长期保存。

7. 切片

①将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上，并打开水浴锅使水温维持在40-45℃，另准备蛋白甘油溶液。

②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。

③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。

④调整石蜡块与刀口之间的角度（一般为15度左右）与位置。

⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为5微米。

⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，摇转速度不可太急。

⑦切成蜡带时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，放入水浴锅中，使其展片。

⑧在载玻片上滴加几滴蛋白甘油，将片放在蜡片下方，用毛笔压在蜡片上，抬起载玻片。

⑨将有蜡片的载玻片放入37℃恒温箱中烘干。

8. 脱蜡复水

石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5min，然后放入3：1二甲苯和无水乙醇的混合液，2：1二甲苯无水乙醇的混合液，1：1二甲苯和无水乙醇的混合液各5min,再放入100%、95%、85%、80%、70%各级酒精溶液中各5min，再放入蒸馏水中5min。

9．染色

切片放入苏木精中染色约8min。

10．水洗

用自来水流水冲洗约3-5min。使切片颜色变蓝，但要注意流水不能过大，以防切片脱落。

11．分色（1%盐酸酒精）

将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色15s。见切片变红，颜色较浅即可。这一步骤是H.E.染色成败的关键，，如分色不当会导致染色不匀，或深或浅，得到的切片染色效果差。之后水洗3-5min，颜色变蓝即可。

12、伊红染色

用伊红染液染色15min。

13.直接用85%的酒精清洗。

14.脱水

将染色好的载玻片依次放入90%、95%、100%各级浓度的酒精溶液中2min，再放入到3:1酒精+二甲苯混合液、2:1酒精+二甲苯混合液、1:1酒精+二甲苯混合液2min，再放入到二甲苯两次各2min。

15.封藏

中性树胶封存