禽流感病毒中和实验整理

禽流感病毒中和实验及其他方法（一）实验材料1、中和反应实验材料(1)病毒：）的滴定。

一般为鸡胚尿囊病毒液，进行中和实验前，需要进行病毒滴度（TCID50(2)血清样品包括待检血清和阳性以及阴性对照血清。

人血清实验前需要56℃ 30分钟灭活，动物血清需RDE处理。

－20℃储存，避免多次反复冻融。

(3)MDCK细胞和细胞培养试剂1)MDCK细胞（狗肾上皮细胞）2)MDCK细胞培养液：DMEM+5%牛血清+抗生素，过滤除菌500毫升 DMEM（修饰的Eagles培养基）5.5毫升 100×抗生素（100单位/毫升青霉素+100微克/毫升链霉素）5.5毫升 100×L－Glutamine（2毫摩尔）25.5毫升 56℃、30分钟加热灭活的牛血清3)胰酶 / EDTA(4)其它1)平底96孔微量培养板2)病毒稀释液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。

429毫升 DMEM66毫升 7.5%牛血清白蛋白（BSA）5毫升 100×抗生素3)TPCK－胰酶（使用浓度为2微克/毫升）4)固定液：80%的丙酮，即配即用，4℃保存400毫升丙酮100毫升 PBS，PH 7.22、ELISA实验材料(1)抗体1：鼠抗流感病毒甲型核蛋白克隆抗体(2)抗体2：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(3)洗涤液：PBS+0.05%TWEEN－204升 PBS，PH 7.22毫升 TWEEN－20(4)封闭液：PBS+1%牛血清白蛋白+0.05％TWEEN－20867毫升PBS，PH 7.2132毫升牛血清白蛋白1毫升TWEEN－20(5)底物和底物溶液：常用的辣根过氧化物酶（HRP）所用底物为磷苯二胺（OPD）底物溶液为PH5.0磷酸盐－柠檬酸缓冲液（0.05M）底物和底物溶液：10毫克OPD20毫升柠檬酸缓冲液（含0.015%双氧水）即配即用磷酸盐－柠檬酸缓冲液，PH5.058.8克柠檬酸三钠1升蒸馏水用盐酸调节PH为5.0加0.015%双氧水，（临用前加入）* 如果使用磷酸盐－柠檬酸缓冲液胶囊（Sigma）1个胶囊加入100毫升蒸馏水，临用前配制(6)终止反应液：1N硫酸（28毫升浓硫酸+1升蒸馏水）3、其他细胞培养和酶联免役吸附实验的常用设备和仪器（参照英文讲义）备注：A.以上实验材料购自Gibco,，Hyclone，Dynatech，Kirkegaard&Perry和Sigma 公司，材料编号（CAT#）参照英文讲义。

B.实验材料的配制，例如0.25%的胰酶等，请参照黄桢祥主编的医学病毒学基础及实验技术一书。

（二）质量控制病毒中和实验技术是一个相当复杂的过程，参与中和反应的因素有病毒、抗血清和宿主细胞。

这些因素的变化都会影响中和实验的结果。

因此，对中和实验的整个过程进行严格的质量控制。

每次测定必须设立阳性和阴性血清对照，阳性和阴性细胞对照，以及对病毒使用剂量进行滴定。

1、血清对照血清对照包括人或动物血清阳性和阴性对照。

即血清中含有（阳性对照）或不含有（阴性对照）对测定病毒特异性的中和抗体。

血清对照一般分装成多份，－20℃保存，并避免反复冻融使用。

(1)阴性血清对照1）动物血清一般来自未免疫或未感染动物，即与待检血清同种动物的正常血清。

2）人血清一般来自与待检血清年龄相同的正常人群，该人群未曾暴露于待检病毒。

3）测定过程中，阴性对照血清与待检血清应处于相同稀释水平。

(2)阳性血清对照1）动物血清一般来自免疫后或感染后动物。

2）人血清一般采用急性期和恢复期双份血清做对照。

* 人血清使用前须经加热灭活处理，动物血清则须经霍乱滤液RDE（即受体破坏酶）处理，以排除非特异性反应因素。

2、病毒和细胞对照每次实验必须设立阳性和阴性细胞对照，以及对加入病毒工作液进行滴定检查，以便获得准确可靠的实验结果。

(1)阳性和阴性细胞对照一般设立4个重复孔为阳性细胞对照，即将细胞与100倍组织细胞半数感染剂量（100TCID）的病毒进行混合培养。

同时设立4个孔为阴性细胞对照，即将细胞与病50毒稀释液进行混合培养。

阳性细胞对照：50微升病毒稀释液+50微升病毒+100微升MDCK细胞。

阴性细胞对照：100微升病毒稀释液+100微升MDCK细胞(2)病毒工作液滴度检查的100微升病毒液，然后进行2倍稀释，再与MDCK 一般第1孔加入含有200TCID50细胞进行混合培养。

）病毒滴度检查：50微升2倍系列稀释病毒液（第1孔为100TCID50 +50微升病毒稀释液+100微升MDCK细胞（1.5×104细胞/孔）（三）实验步骤1、病毒滴度测定（组织培养半数感染量－TCID滴定）50(1)流感病毒制备利用鸡胚尿囊腔接种法制备流感病毒，收获尿囊液，血凝实验测定病毒的存在，分装后－70℃冻存。

(2)病毒的稀释1)取1管冻存病毒尿囊液，1:100稀释（100微升病毒液+9.9毫升稀释液）2)第1排孔加入146微升1:100稀释过的病毒液，然后做系列半对数稀释，使之成10-2、10-2.5、10-3、10-3.5……10-7。

每孔含100微升病毒液，每个稀释度重复4孔，详细操作参见图1。

* 人流感病毒一般在胰酶存在的条件下才能感染MDCK细胞，因此病毒稀释液中需加入2微克/毫升的TPCK－胰酶。

某些毒性很高的禽流感病毒在无胰酶存在的条件下即可感染MDCK细胞，因此在测定新病毒滴度时，最好配制含有和不含有胰酶的两种稀释液，以获得最佳结果。

(3)MDCK细胞的准备1)使用前2天将MDCK细胞1:100传代，使之70~90%成片，处于对数生长期的细胞对病毒具有最大的敏感性，细胞过度生长以及代数太高（大于30代）将使细胞对病毒的敏感性降低。

2)弃去细胞培养液，用5毫升胰酶 / EDTA洗细胞一次，然后弃去。

温箱中消3)加4到5毫升胰酶 / EDTA覆盖细胞（162cm2的细胞培养瓶）37℃ 5%CO2化10~20分钟。

4)待细胞开始脱落时，加5~10毫升MDCK细胞培养液，吹打分散细胞，并将细胞转入离心管中，用PBS洗2次，以去除牛血清。

5)将细胞悬浮于病毒稀释液中，用1毫升吸管充分吹打分散细胞，在细胞计数板上计数细胞数量。

6)用病毒稀释液将细胞稀释成1.5×105细胞/毫升。

7)加100微升细胞（1.5×104细胞/孔）于已稀释好病毒的微量细胞培养板中。

温箱中培养18－22小时。

8)在37℃ 5%CO2(4)测定组织细胞半数感染剂量（TCID50）1)弃去微量培养板中的细胞液，250微升PBS洗细胞一次。

2)弃去PBS（不要让细胞干燥），加入100微升/孔固定液。

3)覆盖微量培养板，于室温固定细胞10分钟。

4)弃去固定液，让微量培养板室温干燥。

5)用ELISA检测细胞感染（参见ELISA部分）6)利用ELISA检测仪，于490纳米波长，测定每孔吸光度（OD）值，计数细胞阴性对照孔的平均OD值。

7)若含有不同稀释度病毒孔平均OD值是细胞阴性对照孔平均OD值的2倍以上，则判断为病毒生长阳性。

/100微升（参见附8)根据Reed和Muench方法对病毒滴度进行计算，最终获得TCID50录和表2）。

流感病毒。

9)在进行中和实验前，稀释病毒液，使之50微升中含有100TCID502、病毒微量中和实验(1)待检血清的准备和稀释1)检测对一种病毒的中和抗体需要10微升血清，每份血清需要进行至少1次重复测定（共需至少20微升血清/每种病毒），每块板可检测11份样品。

2)人血清需56℃加热灭活30分钟。

3)实验设计请参照图2。

4)每孔中加入50微升病毒稀释液。

5)第1排中（A1－A11）再加入40微升病毒稀释液，使之成为90微升/孔。

6)加入10微升待检血清于第1排A1－A11。

7)将待检血清作系列倍比稀释（A－H）使之成为1:10、1:20、1:40……1:1280。

(2)病毒的准备/50微升。

根据病毒特性选择是否在病毒稀释液中加入TPCK 1)稀释病毒至100TCID50胰酶（大约5毫升/每板）。

2)除细胞阴性对照孔（4孔）外，每孔加入50微升病毒工作液。

3)加50微升病毒稀释液于细胞阴性对照孔。

4)选择1列孔做病毒工作液滴度核实。

第1孔加入200TCID/100微升病毒工作液，50做系列倍比稀释，使之成100TCID50，50，25，12，6……0.7。

然后每孔加入50微升病毒稀释液，使体积至100微升/孔。

5)摇匀病毒－血清混合物，放37℃温箱作用2小时。

(3)MDCK细胞的准备。

（参见病毒滴定测定部分）加100微升细胞液（1.5×104细胞/孔）于含有病毒－血清混合物以及倍比稀释病毒工作液的微量板中，37℃温箱孵育18－22小时。

* 当测定大量样品时，每叠培养板一般不超过4－5块，各叠板之间要保持一定距离，以确保混合物受热均匀，从而达到良好的中和效果。

(4)细胞的固定1)弃去微量培养板中的细胞液。

2)250微升PBS洗细胞一次。

3)弃去PBS（不要让细胞干燥），加入100微升/孔固定液。

4)覆盖微量培养板，于室温固定细胞10分钟。

5)弃去固定液，让微量培养板室温干燥。

3、酶联免疫吸附实验（ELISA）ELISA的基本原理是：酶结合物与相应抗体或抗原特异性结合，再遇酶底物时，在酶的强烈催化下使原来无色的底物产生化学反应，即形成有色的产物，便可用肉眼或分光光度计定量检测其含量。

该方法具有特异性、敏感性、快速性和简易性等优点。

在流感病毒微量中和实验中，酶结合物（HRP标记的羊抗鼠IgG抗体）与存在于MDCK细胞膜上的病毒核蛋白抗原-核蛋白单克隆抗体复合物结合，HRP酶催化OPD，使无色底物形成橙黄色化合物，再由ELISA检测仪测定吸光度值，从而获得中和抗体滴度。

(1)实验操作1)用250微升PBS洗涤微量培养板3次，以去除残余的丙酮。

2)用封闭液1：4000（或最佳稀释度）稀释抗体1（抗流感病毒核蛋白-NP单克隆抗体）3)每孔加入稀释后的100微升抗体1，室温作用1小时。

4)用250微升洗涤液洗板4次以除去抗体1。

5)用封闭液1:2000（或最佳稀释度）稀释抗体2（HRP标记的羊抗鼠IgG）。

6)每孔加入稀释后的100微升抗体2，室温作用1小时。

7)用250微升洗涤液洗涤板6次以除区抗体2。

8)每孔加OPD底物100微升（10毫升OPD+20毫升柠檬酸缓冲液+10微升30%双氧水，即用即配）。

9)室温放10分钟左右显色，直至细胞阳性对照孔变橙黄色，而细胞阴性对照孔尚未变色时，每孔加1M硫酸100微升终止反应。

10)在ELISA测定仪上（490纳米）读出每孔OD值。

(2)结果判定下列公式用于判定中和反应结果（细胞阳性对照平均OD值—细胞阴性对照平均OD值）／2+细胞阴性对照平均OD值=XX=细胞半数感染阈值，每孔OD值低于X值时，判定为中和反应阳性，中和反应阳性的血清最高稀释度即为血清中的和抗体滴度。