禽流感病毒中和实验整理

禽流感病毒中和实验及其他方法

（一）实验材料

1、中和反应实验材料

(1)病毒：

）的滴定。

一般为鸡胚尿囊病毒液，进行中和实验前，需要进行病毒滴度（TCID

50

(2)血清样品

包括待检血清和阳性以及阴性对照血清。人血清实验前需要56℃ 30分钟灭活，动物血清需RDE处理。－20℃储存，避免多次反复冻融。

(3)MDCK细胞和细胞培养试剂

1)MDCK细胞（狗肾上皮细胞）

2)MDCK细胞培养液：DMEM+5%牛血清+抗生素，过滤除菌

500毫升 DMEM（修饰的Eagles培养基）

5.5毫升 100×抗生素（100单位/毫升青霉素+100微克/毫升链霉素）

5.5毫升 100×L－Glutamine（2毫摩尔）

25.5毫升 56℃、30分钟加热灭活的牛血清

3)胰酶 / EDTA

(4)其它

1)平底96孔微量培养板

2)病毒稀释液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。 429毫升 DMEM

66毫升 7.5%牛血清白蛋白（BSA）

5毫升 100×抗生素

3)TPCK－胰酶（使用浓度为2微克/毫升）

4)固定液：80%的丙酮，即配即用，4℃保存

400毫升丙酮

100毫升 PBS，PH 7.2

2、ELISA实验材料

(1)抗体1：鼠抗流感病毒甲型核蛋白克隆抗体

(2)抗体2：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG

(3)洗涤液：PBS+0.05%TWEEN－20

4升 PBS，PH 7.2

2毫升 TWEEN－20

(4)封闭液：PBS+1%牛血清白蛋白+0.05％TWEEN－20

867毫升PBS，PH 7.2

132毫升牛血清白蛋白

1毫升TWEEN－20

(5)底物和底物溶液：

常用的辣根过氧化物酶（HRP）所用底物为磷苯二胺（OPD）

底物溶液为PH5.0磷酸盐－柠檬酸缓冲液（0.05M）

底物和底物溶液：10毫克OPD

20毫升柠檬酸缓冲液（含0.015%双氧水）

即配即用

磷酸盐－柠檬酸缓冲液，PH5.0

58.8克柠檬酸三钠

1升蒸馏水

用盐酸调节PH为5.0

加0.015%双氧水，（临用前加入）

* 如果使用磷酸盐－柠檬酸缓冲液胶囊（Sigma）1个胶囊加入100毫升蒸馏水，临用前配制

(6)终止反应液：1N硫酸（28毫升浓硫酸+1升蒸馏水）

3、其他

细胞培养和酶联免役吸附实验的常用设备和仪器（参照英文讲义）

备注：A.以上实验材料购自Gibco,，Hyclone，Dynatech，Kirkegaard&Perry和Sigma 公司，材料编号（CAT#）参照英文讲义。

B.实验材料的配制，例如0.25%的胰酶等，请参照黄桢祥主编的医学病毒学基础及实验技术一书。

（二）质量控制

病毒中和实验技术是一个相当复杂的过程，参与中和反应的因素有病毒、抗血清和宿主细胞。这些因素的变化都会影响中和实验的结果。因此，对中和实验的整个过程进行严格的质量控制。每次测定必须设立阳性和阴性血清对照，阳性和阴性细胞对照，以及对病毒使用剂量进行滴定。

1、血清对照

血清对照包括人或动物血清阳性和阴性对照。即血清中含有（阳性对照）或不含有（阴性对照）对测定病毒特异性的中和抗体。血清对照一般分装成多份，－20℃保存，并避免反复冻融使用。

(1)阴性血清对照

1）动物血清一般来自未免疫或未感染动物，即与待检血清同种动物的正常血清。

2）人血清一般来自与待检血清年龄相同的正常人群，该人群未曾暴露于待检病毒。

3）测定过程中，阴性对照血清与待检血清应处于相同稀释水平。

(2)阳性血清对照

1）动物血清一般来自免疫后或感染后动物。

2）人血清一般采用急性期和恢复期双份血清做对照。

* 人血清使用前须经加热灭活处理，动物血清则须经霍乱滤液RDE（即受体破坏酶）处理，以排除非特异性反应因素。

2、病毒和细胞对照

每次实验必须设立阳性和阴性细胞对照，以及对加入病毒工作液进行滴定检查，以便获得准确可靠的实验结果。

(1)阳性和阴性细胞对照

一般设立4个重复孔为阳性细胞对照，即将细胞与100倍组织细胞半数感染剂量

（100TCID

）的病毒进行混合培养。同时设立4个孔为阴性细胞对照，即将细胞与病50

毒稀释液进行混合培养。

阳性细胞对照：50微升病毒稀释液+50微升病毒+100微升MDCK细胞。

阴性细胞对照：100微升病毒稀释液+100微升MDCK细胞

(2)病毒工作液滴度检查

的100微升病毒液，然后进行2倍稀释，再与MDCK 一般第1孔加入含有200TCID

50

细胞进行混合培养。

）病毒滴度检查：50微升2倍系列稀释病毒液（第1孔为100TCID

50 +50微升病毒稀释液+100微升MDCK细胞（1.5×104细胞/孔）（三）实验步骤

1、病毒滴度测定（组织培养半数感染量－TCID

滴定）

50

(1)流感病毒制备

利用鸡胚尿囊腔接种法制备流感病毒，收获尿囊液，血凝实验测定病毒的存在，

分装后－70℃冻存。

(2)病毒的稀释

1)取1管冻存病毒尿囊液，1:100稀释（100微升病毒液+9.9毫升稀释液）

2)第1排孔加入146微升1:100稀释过的病毒液，然后做系列半对数稀释，使之成10-2、

10-2.5、10-3、10-3.5……10-7。每孔含100微升病毒液，每个稀释度重复4孔，详细操

作参见图1。

* 人流感病毒一般在胰酶存在的条件下才能感染MDCK细胞，因此病毒稀释液中需加

入2微克/毫升的TPCK－胰酶。某些毒性很高的禽流感病毒在无胰酶存在的条件下

即可感染MDCK细胞，因此在测定新病毒滴度时，最好配制含有和不含有胰酶的两

种稀释液，以获得最佳结果。