利血平对多巴胺所致 PC12 细胞程序性死亡的影响

　第15卷　第2期医学研究生学报Vol.15　No.2　2002年4月Journal of Medical Postgraduates Apr.2002

・论 著・利血平对多巴胺所致PC12细胞程序性死亡的影响

方　刚,　凌立君,　侯亚义,　韩晓冬

(南京大学医学院免疫微生物学教研室,江苏南京210093)

摘要:　目的:探讨帕金森病黑质多巴胺神经元的死亡机制。　方法:用M TT法及流式细胞仪检测和观察囊泡单胺类转运体(VMA T)抑制剂利血平对多巴胺所致的毒性作用和细胞程序性死亡的影响。　结果:利血平(1000 nmol/L)作用于大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞96h,对细胞无毒性效应;多巴胺(0.4mmol/L)作用于PC12细胞48h 即出现毒性效应;利血平(1000nmol/L)与多巴胺能够明显增强多巴胺(0.4mmol/L)的毒性效应(P<0.01),二者的协同毒性效应还具有时间依赖性。当多巴胺浓度(0.2mmol/L)较低时,协同毒性效应在药物作用96h才显现出来。同时毒性效应主要是通过诱导细胞程序性死亡来实现的。　结论:VMA T功能下降加重或触发多巴胺的内源性毒性,诱导多巴胺神经元的程序性死亡,可能参与帕金森病的发病机制。

关键词:　帕金森病;　利血平;　多巴胺;　PC12细胞

中图分类号:　R74215 文献标识码:　A 文章编号:　100828199(2002)022*******Ξ

The effect of reserpine on dopamine2induced apoptosis in PC12cells

FAN G G ang,L IN G Li2jun,HOU Ya2yi,HAN Xiao2dong

(Department of Immunomicrobiology,Medical School of Nanjing University,Nanjing210093,Jiangsu,

China)

Abstract:　Objectives:To study the mechanism of dopaminergic neuronal death in substantia nigra of Parkinson disease.　Met hods:The effects of reserpine on dopamine2induced cytotoxicity and apoptosis in PC12cells were detected by M TT assay and flow cytometry.　Results:Reserpine(1000nmol/ L)itself had no direct poisonous effect on PC12cells,but it increased dopamine2induced cytotoxicity and apoptosis in PC12cells.These effects were dopamine concentration2related,and were also depen2 dent on the drug exposure time.　Conclusions:Inhibition of VMA T induced apoptosis in PC12 cells,which may involved in the dopaminergic neuronal death of Parkinson disease.

K ey w ords:　Parkinson disease;　Reserpine;　Dopamine;　PC12cells

0　引 言

帕金森病(Parkinson disease,PD)是常见的锥体外系进行性变性疾病,其发病原因和机制尚未明了。近年来,作为脑内神经递质多巴胺的“自动氧化”对多巴胺神经元的内源性毒性作用日益受到重视1。神经元内的囊泡单胺类转运体(VMA T)能把胞质中多余的多巴胺转运至囊泡内,实现“隔室效应”,以保护神经细胞。VMA T功能下降是否会加重或触发多巴胺的细胞毒性?PC12细胞为大鼠嗜铬细胞瘤细胞,内含保护性囊泡,广泛应用于神经递质的药理研究2。本研究采用VMA T抑制剂利血平3,观察其对多巴胺细胞毒性作用的影响。

1　材料与方法

1.1　材料　PC12细胞购自中科院上海细胞所。细胞培养于DM EM(美国Sigma)培养液中,内含10%新生小牛血清。多巴胺和利血平为国产注射液,用全DM EM培养液稀释至一定浓度后使用。程序性死亡检测试剂盒为深圳晶美公司产品。

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Ξ收稿日期:　2001209226

作者简介:　方　刚(19602),男,江苏南通人,副教授,医学硕士,从事肿瘤免疫生物学专业。

112　方法

1.211　M TT法检测药物对PC12细胞的毒性作用　接种PC12细胞于96孔培养板中培养,细胞接种浓度为3×103个/孔。当细胞进入对数生长期时,换成含不同浓度多巴胺和利血平的培养液,每个浓度及对照孔设3个复孔。在37℃、5%CO2孵箱中培养48或96h。每孔加5mg/ml的M TT液50μl, 37℃避光作用4h,弃去孔内液,每孔加DMSO液150μl,充分溶解后于D G3022A型酶联免疫检测仪570nm处测吸收值。实验对照为不含药物的全DM EM液培养的相应细胞。实验孔细胞生存率按公式:(实验孔的吸收值/对照孔的吸收值)×100%计算。对照孔细胞生存率为100%。

1.2.2　Annexin2FITC双染法检测药物诱发PC12细胞程序性死亡的作用　接种PC12细胞于24孔培养板中培养,细胞接种浓度为1.5×104个/孔。当细胞进入对数生长期时,换成含不同浓度多巴胺和利血平的培养液,每个浓度及对照孔设3个复孔。在37℃,5%CO2孵箱中培养48或96h。胰酶消化收集细胞,细胞经染色后,用流式细胞仪(美国Bec2 ton Dick公司)检测每孔的细胞程序性死亡率。每孔检测10000个细胞。

1.2.3　统计分析　每组实验重复3次,数据以均数±标准差(X±s)表示,用t检验处理。

2　结 果

2.1　利血平处理对PC12细胞生存率的影响　利血平为1000nmol/L、500nmol/L、250nmol/L、125 nmol/L四个浓度组作用于PC12细胞,96h后细胞生存率分别为(96.2±9.3)%、(95.8±8.5)%、(98. 1±10.3)%、(95.1±10.1)%,与对照组100%比较,差异均不显著(P>0.05)。

2.2　多巴胺处理对PC12细胞生存率的影响　不同浓度的多巴胺作用于PC12细胞48h,多巴胺浓度越大,毒性作用越强(表1)。

表1　多巴胺对PC12细胞生存率的影响

Talbe1　E ffects of dopamine on growth rate of PC12cells

多巴胺浓度(mmol/L)细胞生存率(%)

0.293.4±11.33

0.443.1±5.833

0.631.8±4.733

0.89.7±1.933

与对照组100%相比,3P>0.05,33P<0.01

2.3　多巴胺和利血平联合处理对PC12细胞生存率的影响　利血平(1000nmol/L)和多巴胺(0.2 mmol/L)作用于PC12细胞48h,细胞生存率为(91.8±10.7)%,与多巴胺(0.2mmol/L)单独作用48h后的生存率9

3.4%比较,差异不显著(P> 0.05);当两组药物作用时间延长至96h,多巴胺和利血平协同作用(两药物浓度同上)所导致的细胞生存率为(65.3±7.0)%,与多巴胺(0.2mmol/L)单独作用96h后的生存率(91.8±9.7)%比较,差异显著(P<0.05)。利血平(1000nmol/L)和多巴胺(0.4mmol/L)作用于PC12细胞48h,细胞生存率为(18.6±2.1)%,与多巴胺(0.4mmol/L)单独作用48h后的生存率43.1%比较,差异显著(P<0.01)。多巴胺和利血平对PC12细胞协同毒性作用具有时间和药物浓度依赖性。

2.4　多巴胺或(和)利血平处理物对PC12细胞程序性死亡的影响　药物作用48h诱发PC12细胞程序性死亡的结果见表2。利血平增强了0.4mmol/L 多巴胺诱发PC12细胞程序性死亡的作用(P< 0.05)。对0.2mmol/L多巴胺无增强作用。多巴胺(0.2mmol/L)与利血平(1000nmol/L)共同作用96 h,诱发PC12细胞程序性死亡率为(18.8±2.5)%,与单独多巴胺(0.2mmol/L)作用96h所致的程序性死亡率(4.1±0.6)%比较,差异显著(P<0.01)。

表2　药物作用48h诱发PC12细胞程序性死亡的结果Table2　Results of PC12cells apoptosis induced by drug expo2 sure for48h

药物(浓度)程序性死亡(%)

对照(0) 2.5±0.4

利血平(1000nm ol/L) 2.8±0.53

多巴胺(0.2mm ol/L) 3.0±0.53

利血平+多巴胺(1000nm ol/L+0.2mm ol/L) 3.1±0.53

多巴胺(0.4mm ol/L)51.2±7.833

利血平+多巴胺(1000nm ol/L+0.4mm ol/L)76.5±9.733

与对照组比较,3P>0.05;　33P<0.01

3　讨 论

导致帕金森病的原因是多重的,既有遗传因素,又有环境因素4,但帕金森病基本的病理改变是黑质多巴胺神经元的减少。多巴胺神经元具有合成、分泌多巴胺的功能。新近的实验证实,多巴胺代谢毒性可使p53高表达,并损伤细胞大分子进而诱发细胞程序性死亡5。因此,多巴胺神经元倘若在调节多巴胺的合成、贮存、分泌等方面出现功能障碍,其代谢毒性会损伤神经元本身。

单胺类神经元内的分泌囊泡具有贮存单胺类神经递质的功能。囊泡膜上的VMA T能将胞质中多余的多巴胺转运至囊泡内6。先进的成像技术已发现帕金森病患者黑质纹状体的VMA T数量减

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